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¿En qué se diferencia el peso molecular de la subunidad del peso molecular nativo?

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Noté que el peso molecular nativo de una enzima es diferente del peso molecular de su subunidad. ¿Por qué son diferentes? ¿No son los genes necesarios para expresar la enzima los mismos en el organismo nativo y en el sistema de expresión heterólogo?

¿Afecta el sistema de expresión heterólogo al peso molecular del producto enzimático final? ¿Si es así, cómo?


Su pregunta se responde en el documento, la proteína probablemente existe como un homodímero in vivo y la desnaturalización (como la que se realiza con SDS PAGE -> Western Blot) separa los dímeros en monómeros:

"Para determinar la estructura cuaternaria, se realizó cromatografía líquida de alto rendimiento con exclusión de tamaño utilizando un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento Agilent serie 1100 con una columna Bio-Sil SEC-250 (300 por 7,8 mm) y una fase móvil de Na2PO4 0,1 M , NaCl 0,15 M y NaN3 0,01 M, pH 6,8. Se utilizó un estándar de Bio-Rad para estandarizar el tiempo de retención de la columna con respecto a la masa molecular (datos suplementarios). Todos los experimentos se repitieron dos veces con <0,05 min de desviación en la retención La masa molecular de XR se calculó a partir de su tiempo de retención en ∼53 kDa. La monomerización podría inducirse en presencia de 15% de SDS, haciendo que XR eluyera como un solo pico, con un tiempo de retención correspondiente a una masa molecular de ~ 34 kDa Los datos sugieren que el XR nativo es un dímero unido no covalentemente. La diferencia significativa entre el peso molecular calculado del dímero y su peso molecular aparente no es infrecuente para los XR de otras especies (7, 21, 33), que también suelen existir como dímeros. Sin embargo, para estar seguro del tamaño de la proteína, N. crassa XR se sometió a análisis de masas mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo de ionización por electropulverización. El pico de abundancia más alto tenía un valor de 38 381 m / z, correspondiente exactamente con la masa molecular predicha para el XR marcado con His6 con el fMet N-terminal eliminado (datos suplementarios). Además, un pico 2M + de aproximadamente el 20% de abundancia a 76.759 m / z se corresponde bien con la masa predicha de la forma dimérica de la enzima (76.762 Da) ".


Western Blot: ¿Por qué son diferentes los pesos moleculares observados y calculados?

La transferencia Western es un método de laboratorio ampliamente utilizado para detectar moléculas de proteínas específicas en un homogeneizado de tejido o lisado celular. Normalmente, implica separar proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), transferirlas a un soporte sólido [difluoruro de polivinilideno (PVDF) o membrana de nitrocelulosa] y detectar la proteína de interés utilizando anticuerpos. El tamaño de la proteína se puede determinar mediante separación por electroforesis: las proteínas más pequeñas migran más rápido que sus contrapartes más grandes. A continuación, se estima el tamaño de la proteína a partir de patrones de peso molecular y se denomina peso molecular & quotoobservado.

El peso molecular calculado (o predicho) de una proteína se determina sumando los pesos moleculares reales de los aminoácidos individuales en una proteína dada. El peso molecular calculado es ocasionalmente diferente del observado en la transferencia de Western. Varios factores pueden contribuir a la diferencia entre los pesos moleculares observados y calculados.


Piruvato quinasa de levadura. Peso molecular nativo y subunitario

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Romling, U. & amp Galperin, M. Y. Biosíntesis de celulosa bacteriana: diversidad de operones, subunidades, productos y funciones. Trends Microbiol. 23, 545–557 (2015).

Hollenbeck, E. C. et al. La celulosa de fosfoetanolamina mejora la adhesión mediada por curli de uropatógenos Escherichia coli a las células epiteliales de la vejiga. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 115, 10106–10111 (2018).

Thongsomboon, W. et al. Celulosa de fosfoetanolamina: una celulosa modificada químicamente producida naturalmente. Ciencias 359, 334–338 (2018).

Anderson, A. C., Burnett, A. J. N., Hiscock, L., Maly, K. E. y Weadge, J. T. Escherichia coli La subunidad G de celulosa sintasa (BcsG) es una fosfoetanolamina transferasa dependiente de Zn 2+. J. Biol. Chem. 295, 6225–6235 (2020).

Keegstra, K. Paredes de células vegetales. Plant Physiol. 154, 483–486 (2010).

Mélida, H., Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. & amp Bulone, V. Los análisis de carbohidratos extracelulares en oomicetos revelan la existencia de tres tipos diferentes de paredes celulares. Eucariota. Celda 12, 194–203 (2013).

McCrate, O. A., Zhou, X., Reichhardt, C. & amp Cegelski, L. Suma de las partes: composición y arquitectura de la matriz extracelular bacteriana. J. Mol. Biol. 425, 4286–4294 (2013).

Stewart, P. & amp Costerton, J. Resistencia a los antibióticos de las bacterias en las biopelículas. Lanceta 358, 135–138 (2001).

Snarr, B. D. y col. Hidrolasas de glucósido microbiano como agentes antibiofilm con actividad de reinos cruzados. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 114, 7124–7129 (2017).

Iguchi, M., Yamanaka, S. & amp Budhiono, A. La celulosa bacteriana es una obra maestra de las artes de la naturaleza. J. Mater. Sci. 35, 261–270 (2000).

Morgan, J., Strumillo, J. & amp Zimmer, J. Instantánea cristalográfica de la síntesis de celulosa y la translocación de membranas. Naturaleza 493, 181–186 (2013).

McNamara, J. T., Morgan, J. L. W. & amp Zimmer, J. Una descripción molecular de la biosíntesis de celulosa. Annu. Rev. Biochem. 84, 17.11–17.27 (2015).

Morgan, J. L. W., McNamara, J. T. & amp Zimmer, J. Mecanismo de activación de la celulosa sintasa bacteriana por di-GMP cíclico. Nat. Struct. Mol. Biol. 21, 489–496 (2014).

Nojima, S. et al. Estructura cristalina del dominio repetido en tándem flexible de la subunidad C de síntesis de celulosa bacteriana. Sci. Reps. 7, 13018 (2017).

Acheson, J. F., Derewenda, Z. S. & amp Zimmer, J. Arquitectura del canal de membrana externa de celulosa sintasa y su asociación con el dominio periplásmico TPR. Estructura 27, 1855–1861.e3 (2019).

Mazur, O. & amp Zimmer, J. Estructuras unidas a apo y celopentaosa de la subunidad de celulosa sintasa bacteriana BcsZ. J. Biol. Chem. 286, 17601–17606 (2011).

Yasutake, Y. et al. Caracterización estructural de la Acetobacter xylinum endo-β-1,4-glucanasa CMCax necesaria para la biosíntesis de celulosa. Proteínas 64, 1069–1077 (2006).

Zouhir, S., Abidi, W., Caleechurn, M. & amp Krasteva, P. V. Estructura y multitarea del regulador de la secreción de celulosa que detecta c-di-GMP BcsE. Mbio 11, e01303-20 (2020).

Fang, X. y col. GIL, un nuevo dominio de proteína de unión a c-di-GMP involucrado en la regulación de la síntesis de celulosa en enterobacterias. Mol. Microbiol. 93, 439–452 (2014).

Le Quéré, B. y amp Ghigo, J.-M. BcsQ es un componente esencial del Escherichia coli Aparato de biosíntesis de celulosa que se localiza en el polo de la célula bacteriana. Mol. Microbiol. 72, 724–740 (2009).

Sun, L. y col. Caracterización estructural y funcional de la subunidad BcsG de la celulosa sintasa en Ssalmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 430, 3170–3189 (2018).

Krasteva, P. V. et al. Información sobre la estructura y el ensamblaje de un sistema de secreción de celulosa bacteriana. Nat. Comun. 8, 2065 (2017).

Thongsomboon, W., Werby, S. H. & amp Cegelski, L. Evaluación de la producción de celulosa de fosfoetanolamina entre comunidades bacterianas utilizando fluorescencia roja de Congo. J. Bacteriol. 202, e00030-20 (2020).

Omadjela, O. et al. BcsA y BcsB forman el núcleo catalíticamente activo de la celulosa sintasa bacteriana suficiente para la síntesis de celulosa in vitro. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 110, 17856–17861 (2013).

Du, J., Vepachedu, V., Cho, S. H., Kumar, M. & amp Nixon, B. T. Estructura del complejo de celulosa sintasa de Gluconacetobacter hansenii a una resolución de 23,4 Å. Más uno 11, e0155886 (2016).

Clairfeuille, T. et al. Estructura del complejo lipopolisacárido-PbgA de la membrana interna esencial. Naturaleza 584, 479–483 (2020).

Fan, J., Petersen, E. M., Hinds, T. R., Zheng, N. & amp Miller, S. I. Estructura de una proteína de la membrana interna requerida para los aumentos regulados por PhoPQ en la cardiolipina de la membrana externa. Mbio 11, e03277-19 (2020).

Anandan, A. et al. Estructura de un lípido A fosfoetanolamina transferasa sugiere cómo los cambios conformacionales gobiernan la unión del sustrato. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 114, 2218–2223 (2017).

Ghosal, D., Trambaiolo, D., Amos, L. A. & amp Lowe, J. Las proteínas de división celular MinCD forman filamentos citomotores copoliméricos alternos. Nat. Comun. 5, 5341 (2014).

Lackner, L. L., Raskin, D. M. & amp de Boer, P. A. Interacciones dependientes de ATP entre Escherichia coli Proteínas mínimas y membrana fosfolipídica in vitro. J. Bacteriol. 185, 735–749 (2003).

Nixon, B. T. et al. El análisis comparativo estructural y computacional respalda dieciocho celulosa sintasas en el complejo de síntesis de celulosa vegetal. Sci. Reps. 6, 28696 (2016).

Ross, P. y col. Regulación de la síntesis de celulosa en Acetobacter xylinum por ácido diguanílico cíclico. Naturaleza 325, 279–281 (1987).

Spires, A. J., Bohannon, J., Gehrig, S. M. & amp Rainey, P. B. Formación de biopelículas en la interfaz aire-líquido por el Pseudomonas fluorescens El esparcidor de arrugas SBW25 requiere una forma acetilada de celulosa.Mol. Microbiol. 50, 15–27 (2003).

Marmont, L. S. y col. La lipoproteína oligomérica PelC guía la exportación de polisacárido Pel a través de la membrana externa de Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl Acad. Sci. Estados Unidos 114, 2892–2897 (2017).

Low, K. E. & amp Howell, P. L. Máquinas biosintéticas de exopolisacáridos dependientes de sintasa gramnegativos. Curr. Opin. Struct. Biol. 53, 32–44 (2018).

El sistema de gráficos moleculares PYMOL v.2.0 (Schroedinger, LLC, 2021)

Pettersen, E. F. y col. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Comput. Chem. 25, 1605–1612 (2004).

Edgar, R. C. MUSCLE: alineación de secuencia múltiple con alta precisión y alto rendimiento. Ácidos nucleicos Res. 32, 1792–1797 (2004).

Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M. & amp Barton, G. J. Jalview versión 2: un editor de alineación de secuencias múltiples y un banco de trabajo de análisis. Bioinform. 25, 1189–1191 (2009).

Drozdetskiy, A., Cole, C., Procter, J. & amp Barton, G. J. JPred4: un servidor de predicción de estructura secundaria de proteínas. Ácidos nucleicos Res. 43, W389 – W394 (2015).


RESULTADOS

La función mitocondrial no se ve afectada por la fusión de la etiqueta biológica al terminal carboxi

Se hicieron dos versiones de la proteína Cbp1-Bio: la primera fusión, Bio1, contiene el sitio de reconocimiento de tetrapéptidos para la proteasa del factor Xa (Nagai y Thogersen, 1984) entre Cbp1 y la etiqueta Bio, mientras que la segunda versión, Bio2, carece del factor Sitio Xa. Las fusiones se introdujeron en el CBP1 localización cromosómica por reemplazo de genes (ver MATERIALES Y MÉTODOS). Las cepas que contenían las proteínas Cbp1 etiquetadas crecieron en el medio YEPG que contenía glicerol a velocidades similares a las de la cepa de tipo salvaje sin etiquetar S150, lo que indica que la función mitocondrial no se vio afectada en estas cepas (nuestros datos no publicados).

Extracción y solubilidad de Cbp1

Para determinar la localización intramitocondrial de Cbp1, las mitocondrias de la cepa Bio1 se rompieron mediante choque osmótico y sonicación, y la fracción de matriz soluble se separó de la fracción de membrana insoluble mediante ultracentrifugación. Las proteínas tanto en el sobrenadante soluble como en el sedimento insoluble se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western. Usando tampón de sonicación estándar que contenía KCl 1 M, Cbp1 estaba en la fracción de membrana insoluble. Sin embargo, cuando se omitió el KCl del tampón de sonicación, & gt90% de Cbp1 estaba en la fracción de matriz soluble (Figura 1A). La solubilidad de Cbp1 se relacionó inversamente con la concentración de sal en el tampón de sonicación, lo que sugiere interacciones hidrofóbicas entre los monómeros de Cbp1 o entre Cbp1 y otras proteínas.

Figura 1. Extracción y solubilidad de Cbp1. (A) Efecto de la sal sobre la extracción de Cbp1 de las mitocondrias. Las mitocondrias aisladas de la cepa Cbp1-Bio1 se rompieron mediante sonicación en presencia de diversas concentraciones de KCl. Las proteínas solubles (S) se separaron de las proteínas insolubles (P) mediante ultracentrifugación (ver MATERIALES Y MÉTODOS). Todas las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y Western blot utilizando neutravidina acoplada a HRP. Las bandas corresponden a la proteína Cbp1-Bio1. (B) Efecto de la sonicación en ausencia de sal sobre proteínas solubles y de membrana. Las mitocondrias se rompieron en tampón que carecía de sal y se centrifugaron como se describe en A. Se probaron transferencias Western con Neutravidina para detectar Cbp1-Bio, con antisuero para Mdh1, malato deshidrogenasa mitocondrial y con anticuerpos monoclonales para Cox2. (C) Efecto de la extracción de carbonato alcalino sobre Cbp1. Las mitocondrias se trataron con carbonato de sodio 100 mM durante 30 min en hielo y las proteínas solubles se separaron de las proteínas de membrana insolubles mediante ultracentrifugación (ver MATERIALES Y MÉTODOS). Las transferencias de Western se sondaron con Neutravidin para detectar Cbp1-Bio, con antisuero para Mss51, una proteína de membrana periférica, y con anticuerpos monoclonales para Cox2, una proteína de membrana integral.

Investigar cómo la enzima malato deshidrogenasa soluble, Mdh1 (Thompson y McAlister-Henn, 1989), y la subunidad II de la citocromo oxidasa de la proteína integral de membrana, Cox2 (Tsukihara et al., 1996), divididas cuando las mitocondrias se sonicaron en ausencia de sal, las transferencias Western se hicieron reaccionar con antisuero contra Mdh1 o con anticuerpos monoclonales contra Cox2 (Figura 1B). Como era de esperar, Mdh1 estaba principalmente en la fracción soluble y Cox2 estaba principalmente en la fracción de pellets de membrana.

El hecho de que Cbp1 pueda solubilizarse mediante una etapa de sonicación sin sal sugiere que la proteína está asociada periféricamente con la membrana. Un método tradicional para extraer proteínas de membrana extrínseca es el tratamiento de las membranas mitocondriales con carbonato alcalino. Después del tratamiento con carbonato de sodio, Cbp1 permaneció en la fracción de pellet insoluble, mientras que la proteína de membrana extrínseca Mss51 (Decoster et al., 1990 Siep et al., 2000) se encontró en la fracción soluble (Figura 1C). La proteína de membrana integral Cox2 permaneció en la fracción de sedimento como se esperaba. De manera similar a los resultados con KCl (Figura 1A), el tratamiento con carbonato, que interrumpe las interacciones iónicas, fortaleció la asociación entre Cbp1 y la membrana, lo que sugiere que esta asociación se produce principalmente a través de interacciones hidrofóbicas.

Agregados de Cbp1 solubilizados en sal

Para examinar el efecto de la sal sobre la agregación de Cbp1 después de la sonicación, la fracción soluble que contiene Cbp1 obtenida por sonicación sin sal se dividió en tres formas y las alícuotas se trataron sin sal o con 150 mM o KCl 1 M durante 1 h en hielo. . A continuación, las muestras se centrifugaron para sedimentar las proteínas agregadas. En las muestras tratadas con sal, Cbp1 sedimentó con la fracción insoluble (Figura 2A). En el experimento de control, en el que se añadió agua en lugar de KCl, Cbp1 permaneció en el sobrenadante soluble. Este resultado apoya la hipótesis de que la Cbp1 solubilizada y / o las proteínas asociadas tienen un parche hidrofóbico, que hace que las proteínas se agreguen cuando se agrega la sal.

Figura 2. Solubilidad después de la sonicación y asociación de membranas en presencia de sal. (A) Solubilidad de Cbp1 cuando se agrega sal después de la sonicación. Las mitocondrias se sonicaron en tampón que carecía de KCl (S, P). Después de la sonicación y ultracentrifugación, se incubaron alícuotas de la fracción soluble (S) durante 1 h en hielo con H2O o las concentraciones indicadas de KCl. A continuación, las muestras se ultracentrifugaron y tanto los sobrenadantes solubles (S) como los sedimentos insolubles (P) se analizaron mediante SDS-PAGE y Western blot utilizando Neutravidina acoplada a HRP. (B) Análisis de gradiente de sacarosa de Cbp1 en la fracción de sedimento después de la sonicación en tampón que contiene sal. Las mitocondrias se sonicaron en tampón que contenía KCl 1 M, se centrifugaron y la fracción de sedimento se resuspendió y se cargó en un gradiente de sacarosa al 40-70%. Las fracciones 1-14 se recogieron y analizaron mediante Western blot. La mancha se probó primero con Neutravidin-HRP para detectar Cbp1-Bio1. La mancha fue reprobada con antisuero anti-Mss51, que detecta la proteína de la membrana mitocondrial Mss51 (Siep et al., 2000) y anticuerpos Cox2, que detectan la proteína integral de membrana Cox2 (Molecular Probes). Cbp1-Bio1, Mss51 y Cox2 se detectaron con mayor intensidad en las fracciones 8, 9 y 10.

Cbp1 se asocia con membranas cuando las mitocondrias se sonican en tampón que contiene sal

Cbp1 es soluble cuando las mitocondrias se sonican en ausencia de sal, pero la forma solubilizada se agrega cuando se agrega sal. Esto nos llevó a cuestionar si la proteína Cbp1 que se encuentra en la fracción de sedimento después de la sonicación en presencia de sal está asociada con las membranas o con una masa insoluble. Para investigar este punto, la fracción de sedimento mitocondrial obtenida después de la sonicación en tampón que contiene KCl 1 M se resuspendió, se dializó y se colocó en capas en un gradiente continuo de sacarosa al 40-70%. Después de la centrifugación, las fracciones del gradiente se analizaron mediante SDS-PAGE y Western blot. Cbp1-Bio anillado en una posición dentro del gradiente que es típico de las membranas mitocondriales, y se detectaron Mss51 y Cox2 en las mismas fracciones que contenían Cbp1-Bio (Figura 2B). Se esperarían agregados de proteínas en las fracciones de sacarosa más pesadas hacia el fondo del tubo (Ackerman y Tzagoloff, 1990). Por lo tanto, cuando las mitocondrias se sonican en presencia de KCl, Cbp1-Bio está en la fracción de pellets en virtud de su unión a las membranas mitocondriales.

Cbp1 eluye de una columna de exclusión de tamaño en el rango de 900,000 Da

Para analizar el extracto sin sal mitocondrial soluble, se fraccionó el sobrenadante sónico en una columna Sephacryl S300. El valor Ve / Vo deducido de Cbp1 se comparó con Ve / Vo de varias proteínas marcadoras que se utilizaron para calibrar la columna. El pico de Cbp1 en la fracción 46 correspondió a un peso molecular de ~ 900 kDa (Figura 3, A y B). El alto peso molecular de las fracciones de filtración en gel que contienen Cbp1 sugirió que Cbp1 se asocia con otras proteínas mitocondriales. Para investigar si Cbp1 es parte de uno o más complejos, la fracción soluble obtenida por sonicación sin sal de las mitocondrias se analizó mediante electroforesis en gel nativo azul, que separa los complejos de proteínas según el tamaño y la distribución de carga en sus superficies (Schägger y von Jagow , 1991 Schägger et al., 1994). El análisis de inmunotransferencia de la primera dimensión nativa mostró que Cbp1 se detecta en una banda de alto peso molecular (Figura 4). El complejo de isocitrato deshidrogenasa con un peso molecular nativo de 320 kDa migró más rápido que el complejo Cbp1 (Figura 4). Cuando se añadió el detergente no iónico laurilmaltósido a una concentración final del 1%, la neutravidina acoplada a HRP reaccionó con varias bandas de peso molecular más pequeñas entre 66 y 140 kDa además de la banda de 900 kDa, lo que indica que el complejo que contiene Cbp1 es modestamente sensible al tratamiento con detergente.

Figura 3. Análisis de filtración en gel de Cbp1-Bio1. (A) Mapeo fino del volumen de elución pico de fracciones que contienen Cbp1. Las fracciones de filtración en gel 43-56 (correspondientes al volumen en mililitros, Ve) de la cepa Cbp1-Bio1 se sometieron a electroforesis, se transfirieron y se sondaron para detectar la presencia de proteína Cbp1-Bio1 con neutravidina acoplada a HRP. (B) Cálculo del peso molecular del complejo que contiene Cbp1-Bio1. El gráfico muestra el logaritmo de los pesos moleculares (eje y) frente a Ve / Vo de las proteínas marcadoras utilizadas para la calibración de la columna (eje x). Los nombres y pesos moleculares de las proteínas utilizadas para la calibración se dan a la derecha. La posición del pico Ve / Vo del complejo que contiene Cbp1 – Bio1 se indica mediante una flecha y una línea de puntos.

Figura 4. Análisis PAGE azul nativo de Cbp1-Bio1. Las proteínas mitocondriales solubles de la cepa Cbp1-Bio1 se sometieron a electroforesis en gel nativo azul. Un carril del gel se volvió a teñir con Coomassie Brilliant Blue R250 para visualizar los complejos de proteínas (izquierda). Los otros carriles que contenían muestras paralelas se transfirieron y se sondaron con un anticuerpo dirigido contra isocitrato deshidrogenasa (IDH) o con Neutravidin-HRP para detectar Cbp1-Bio1. Se añadió laurilmaltósido a una muestra del extracto de proteína hasta una concentración final del 1% antes de la electroforesis (+ detergente).

Purificación de Cbp1-Bio1 por cromatografía de afinidad y elución de proteasa de factor Xa

Cbp1-Bio1 se purificó mediante adsorción del extracto soluble en perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Las perlas adsorben muchas proteínas diferentes de los extractos de tipo salvaje y Cbp1-Bio1 (Figura 5A, fracción unida). Los patrones de proteínas eran idénticos excepto por un pequeño número de bandas teñidas con plata débil, que se detectaron solo en el extracto de Cbp1-Bio1. Uno de estos tenía un tamaño esperado para Cbp1-Bio1. En un Western blot de un gel duplicado, esta banda reaccionó con Neutravidin, confirmando que es Cbp1-Bio1. Toda la proteína Cbp1-Bio1 de la fracción soluble se unió a las perlas. Otras dos proteínas de 120 y 45 kDa que están biotiniladas o tienen un motivo proteico con afinidad por la estreptavidina también se adsorbieron en la matriz de afinidad (Figura 5B, fracción unida).

Figura 5. Purificación de Cbp1-Bio1 en perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. (A) Visualización de patrones de proteínas mediante tinción. Se permitió que las proteínas mitocondriales solubles de la cepa sin etiquetar (WT) o de la cepa Cbp1-Bio1 (-Bio) se adsorbieran sobre perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Las proteínas que se adsorbieron se separaron de las que no lo hicieron mediante el uso de un imán. Las perlas se lavaron y luego se hirvieron en tampón de carga de gel. Las fracciones unidas y no unidas se separaron en un gel de acrilamida desnaturalizante al 7,5%. Las muestras que contenían la fracción soluble original (fracción soluble) o las proteínas que no absorbieron las perlas (fracción no unida) se tiñeron con azul de Coomassie. Las muestras del material adherido a las perlas de estreptavidina (fracción unida) se tiñeron con nitrato de plata. (B) Análisis de transferencia Western. Se analizó un gel duplicado del mostrado en A mediante transferencia Western con neutravidina acoplada a HRP.

Se eluyó Cbp1-Bio1 de las perlas mediante tratamiento con proteasa de factor Xa. Como control, se adsorbió el extracto que contenía Cbp1-Bio2, que carece del sitio del factor Xa, en perlas de neutravidina y se trató con factor Xa. El análisis de transferencia Western y SDS-PAGE mostró que Cbp1-Bio2 permanecía unido a las perlas después de la digestión con proteasa, mientras que Cbp1-Bio1 se liberó de manera eficiente de las perlas mediante tratamiento con proteasa (Figura 6A). Un gel duplicado teñido con plata reveló al menos 10 bandas de proteína que estaban presentes en la fracción eluida con factor Xa de las perlas adsorbidas en Cbp1-Bio1 pero ausentes en las fracciones eluidas con Xa de Cbp1-Bio2 y de tipo salvaje sin etiquetar (Figura 6B). Las proteínas exclusivas de la muestra tratada con proteasa tenían pesos moleculares relativos estimados de 110, 85 y 68 kDa, y varias estaban en el rango de 40 a 50 kDa. La proteína de 68 kDa tiene el tamaño correcto para ser Cbp1.

Figura 6. Elución de Cbp1-Bio1 de las perlas de estreptavidina con proteasa del factor Xa. (A) Análisis de transferencia Western de proteínas eluidas. Las fracciones unidas a estreptavidina de extractos mitocondriales de WT, Cbp1-Bio1 y Cbp1-Bio2 se trataron con proteasa del factor Xa. Las proteínas que quedaron en las perlas de estreptavidina se eluyeron en condiciones desnaturalizantes. Las proteínas se analizaron mediante SDS-PAGE y Western blot utilizando neutravidina acoplada a HRP. (B) Análisis de tinción de plata de proteínas eluidas. El gel teñido con plata muestra la composición proteica de las fracciones de eluato que contienen las proteínas que se escindieron de las perlas con la proteasa del factor Xa, las fracciones que quedaron unidas a las perlas y, como controles, los eluidos obtenidos sin adición de la proteasa. Las bandas de proteínas exclusivas del eluato de la cepa Cbp1-Bio1 se indican con asteriscos.

El análisis MALDI identifica una de las proteínas como Pet309

Las tres proteínas de peso molecular más alto exclusivas del eluato de Cbp1-Bio1 + Xa de la Figura 6B (110, 85 y 68 kDa) podrían escindirse de geles de una sola dimensión sin el riesgo de incluir bandas contaminantes. Estas tres bandas se recogieron de los geles y se prepararon para el análisis MALDI como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Se obtuvo un número suficiente de picos de péptidos para permitir una búsqueda en la base de datos general para solo la banda de 110 kDa. Cinco de los 10 péptidos identificados a partir de esta banda coincidían con la proteína Pet309 de 113 kDa. Pet309 es una proteína mitocondrial que protege y promueve específicamente la traducción del COX1 ARNm, análogo a la función de Cbp1 para MAZORCA ARNm (Manthey y McEwen, 1995). Como era de esperar, dos de los tres picos experimentales obtenidos para la proteína de 68 kDa por MALDI coincidieron con masas de péptidos teóricas determinadas para la proteína Cbp1. La identidad de las proteínas en las otras bandas únicas requerirá una investigación adicional.

Blue Native PAGE identifica a Pet309 y Cbp1 como componentes del mismo complejo de alto peso molecular

Se utilizó un análisis PAGE nativo azul bidimensional para verificar la interacción putativa entre Cbp1 y Pet 309. Para detectar ambas proteínas en el mismo extracto, se construyó una cepa que contenía Pet309 etiquetada con HA además de Cbp1-Bio1 (ver MATERIALES Y MÉTODOS) . La alteración de las mitocondrias por sonicación o por el uso de detergentes resultó en la escisión de la proteína Pet309-HA en varios fragmentos más pequeños. Sin embargo, descubrimos que el tratamiento repetido de una suspensión mitocondrial mediante períodos alternos de congelación y descongelación liberaba suficiente complejo de alto peso molecular que contiene Cbp1 (nuestros datos no publicados) para permitir el análisis mediante PAGE azul bidimensional nativo. Como se muestra en la Figura 7, este extracto contenía al menos dos bandas visibles de pesos moleculares & gt670 kDa (Figura 7A). Estas bandas dieron lugar a un patrón de proteína complejo en el gel desnaturalizante de segunda dimensión como se visualiza mediante tinción con plata (Figura 7B). Tanto Cbp1-Bio como Pet309-HA se detectaron en el segundo y tercer carril (0,6 a 0,9 cm desde la parte superior del gel de primera dimensión) que contienen las bandas de alto peso molecular, lo que sugiere que son parte de un solo complejo ( Figura 7C). Además, se detectó una gran cantidad de proteína Pet309-HA monomérica en carriles correspondientes a un peso molecular aproximado de ~ 140 kDa (3,3–3,9 cm desde la parte superior del gel de primera dimensión). Asimismo, el Cbp1-Bio monomérico se observó principalmente en los carriles correspondientes a proteínas o tamaños de complejos proteicos de 69–140 kDa (3,9–4,5 cm desde la parte superior del gel de primera dimensión).

Figura 7. Análisis bidimensional de un extracto mitocondrial soluble de la cepa Cbp1-Bio1 / Pet309-HA. (A) Las proteínas solubles se extrajeron de las mitocondrias Cbp1-Bio1 / Pet309-HA en ausencia de sal mediante congelación y descongelación repetidas y se sometieron a electroforesis en presencia de Serva Blue como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Se utilizó una alícuota del "kit de calibración HMW para electroforesis nativa" (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) como marcador de peso molecular. La dirección de la electroforesis está indicada por la flecha. (B) Para el análisis posterior de la composición proteica de los complejos por SDS-PAGE, el gel de primera dimensión se cortó en rodajas de 3 mm comenzando por la parte superior. Las piezas de gel se sometieron a SDS-PAGE. A modo de comparación, el extracto mitocondrial soluble (S) también se sometió a electroforesis. Después de la separación, las proteínas se tiñeron con nitrato de plata. A la izquierda, se muestran las posiciones de las proteínas marcadoras de peso molecular de la segunda dimensión desnaturalizante. A continuación, se indican las posiciones relativas de los marcadores de peso molecular de primera dimensión. (C) Se transfirió un gel idéntico al de B sobre una membrana de PVDF y se sondaron consecutivamente con anti-HA-peroxidasa (diluido a 50 mU / ml) (Roche Diagnostics) para detectar Pet309 marcado con HA y Neutravidin-HRP (1: 1500 dilución) (Pierce Chemical) para detectar Cbp1-Bio.


Contenido

Preparación de la muestra Editar

Las muestras pueden ser cualquier material que contenga proteínas o ácidos nucleicos. Estos pueden derivarse biológicamente, por ejemplo, de células procariotas o eucariotas, tejidos, virus, muestras ambientales o proteínas purificadas. En el caso de células o tejidos sólidos, estos a menudo se descomponen primero mecánicamente usando un mezclador (para volúmenes de muestra más grandes), usando un homogeneizador (volúmenes más pequeños), por sonicador o usando ciclos de alta presión, y una combinación de bioquímicos y Se pueden utilizar técnicas mecánicas, incluidos varios tipos de filtración y centrifugación, para separar diferentes compartimentos celulares y orgánulos antes de la electroforesis. También pueden usarse como analitos biomoléculas sintéticas tales como oligonucleótidos.

La muestra a analizar se mezcla opcionalmente con un desnaturalizante químico si así se desea, normalmente SDS para proteínas o urea para ácidos nucleicos. El SDS es un detergente aniónico que desnaturaliza las estructuras secundarias y terciarias no unidas por disulfuro y, además, aplica una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa. La urea rompe los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases del ácido nucleico, haciendo que las hebras constituyentes se hibriden. Calentar las muestras a al menos 60 ° C promueve aún más la desnaturalización. [7] [8] [9] [10]

Además de SDS, las proteínas pueden opcionalmente calentarse brevemente hasta casi la ebullición en presencia de un agente reductor, como ditiotreitol (DTT) o 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol / BME), que desnaturaliza aún más las proteínas al reducir los enlaces disulfuro, superando así algunas formas de plegamiento de proteínas terciarias y rompiendo la estructura de las proteínas cuaternarias (subunidades oligoméricas). Esto se conoce como reducción de SDS-PAGE.

Puede agregarse un tinte de seguimiento a la solución. Esto típicamente tiene una mayor movilidad electroforética que los analitos para permitir que el experimentador rastree el progreso de la solución a través del gel durante el ciclo electroforético.

Preparación de geles de acrilamida Editar

Los geles consisten típicamente en acrilamida, bisacrilamida, el desnaturalizante opcional (SDS o urea) y un tampón con un pH ajustado. La solución se puede desgasificar al vacío para evitar la formación de burbujas de aire durante la polimerización. Alternativamente, se puede agregar butanol al gel de resolución (para proteínas) después de vertido, ya que el butanol elimina las burbujas y suaviza la superficie. [11] Se añaden una fuente de radicales libres y un estabilizador, como persulfato de amonio y TEMED, para iniciar la polimerización. [12] La reacción de polimerización crea un gel debido a la bisacrilamida añadida, que puede formar enlaces cruzados entre dos moléculas de acrilamida. La relación de bisacrilamida a acrilamida se puede variar para propósitos especiales, pero generalmente es aproximadamente 1 parte en 35. La concentración de acrilamida del gel también se puede variar, generalmente en el rango de 5% a 25%. Los geles de menor porcentaje son mejores para resolver moléculas de muy alto peso molecular, mientras que se necesitan porcentajes mucho más altos de acrilamida para resolver proteínas más pequeñas. El diámetro medio de los poros de los geles de poliacrilamida se determina mediante la concentración total de acrilamidas (% T con T = concentración total de acrilamida y bisacrilamida) y la concentración del reticulante bisacrilamida (% C con C = concentración de bisacrilamida). [13] El tamaño de los poros se reduce recíprocamente al% T. Con respecto al% C, una concentración del 5% produce los poros más pequeños, ya que la influencia de la bisacrilamida sobre el tamaño de los poros tiene forma de parábola con un vértice al 5%.

Los geles generalmente se polimerizan entre dos placas de vidrio en un molinillo de gel, con un peine insertado en la parte superior para crear los pocillos de muestra. Una vez polimerizado el gel, se puede quitar el peine y el gel está listo para la electroforesis.

Electroforesis Editar

Se utilizan varios sistemas tampón en PAGE dependiendo de la naturaleza de la muestra y el objetivo experimental. Los tampones utilizados en el ánodo y el cátodo pueden ser iguales o diferentes. [9] [14] [15]

Se aplica un campo eléctrico a través del gel, lo que hace que las proteínas o ácidos nucleicos con carga negativa migren a través del gel alejándose del electrodo negativo (que es el cátodo, ya que se trata de una celda electrolítica en lugar de galvánica) y hacia el electrodo positivo (el ánodo). Dependiendo de su tamaño, cada biomolécula se mueve de manera diferente a través de la matriz del gel: las moléculas pequeñas entran más fácilmente a través de los poros del gel, mientras que las más grandes tienen más dificultad. El gel se hace funcionar normalmente durante unas horas, aunque esto depende del voltaje aplicado a través del gel. La migración se produce más rápidamente a voltajes más altos, pero estos resultados suelen ser menos precisos que a voltajes más bajos. Después de la cantidad de tiempo establecida, las biomoléculas han migrado a diferentes distancias en función de su tamaño. Smaller biomolecules travel farther down the gel, while larger ones remain closer to the point of origin. Biomolecules may therefore be separated roughly according to size, which depends mainly on molecular weight under denaturing conditions, but also depends on higher-order conformation under native conditions. The gel mobility is defined as the rate of migration traveled with a voltage gradient of 1V/cm and has units of cm 2 /sec/V. [3] : 161–3 For analytical purposes, the relative mobility of biomolecules, RF, the ratio of the distance the molecule traveled on the gel to the total travel distance of a tracking dye is plotted versus the molecular weight of the molecule (or sometimes the log of MW, or rather the Mr, molecular radius). Such typically linear plots represent the standard markers or calibration curves that are widely used for the quantitative estimation of a variety of biomolecular sizes. [3]: 161–3

Certain glycoproteins, however, behave anomalously on SDS gels. Additionally, the analysis of larger proteins ranging from 250,000 to 600,000 Da is also reported to be problematic due to the fact that such polypeptides move improperly in the normally used gel systems. [dieciséis]

Further processing Edit

Following electrophoresis, the gel may be stained (for proteins, most commonly with Coomassie Brilliant Blue R-250 or autoradiography for nucleic acids, ethidium bromide or for either, silver stain), allowing visualization of the separated proteins, or processed further (e.g. Western blot). After staining, different species biomolecules appear as distinct bands within the gel. It is common to run molecular weight size markers of known molecular weight in a separate lane in the gel to calibrate the gel and determine the approximate molecular mass of unknown biomolecules by comparing the distance traveled relative to the marker.

For proteins, SDS-PAGE is usually the first choice as an assay of purity due to its reliability and ease. The presence of SDS and the denaturing step make proteins separate, approximately based on size, but aberrant migration of some proteins may occur. Different proteins may also stain differently, which interferes with quantification by staining. PAGE may also be used as a preparative technique for the purification of proteins. For example, quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis (QPNC-PAGE) is a method for separating native metalloproteins in complex biological matrices.

Polyacrylamide gel (PAG) had been known as a potential embedding medium for sectioning tissues as early as 1964, and two independent groups employed PAG in electrophoresis in 1959. [17] [18] It possesses several electrophoretically desirable features that make it a versatile medium. It is a synthetic, thermo-stable, transparent, strong, chemically relatively inert gel, and can be prepared with a wide range of average pore sizes. [19] The pore size of a gel and the reproducibility in gel pore size are determined by three factors, the total amount of acrylamide present (%T) (T = Total concentration of acrylamide and bisacrylamide monomer), the amount of cross-linker (%C) (C = bisacrylamide concentration), and the time of polymerization of acrylamide (cf. QPNC-PAGE). Pore size decreases with increasing %T with cross-linking, 5%C gives the smallest pore size. Any increase or decrease in %C from 5% increases the pore size, as pore size with respect to %C is a parabolic function with vertex as 5%C. This appears to be because of non-homogeneous bundling of polymer strands within the gel. This gel material can also withstand high voltage gradients, is amenable to various staining and destaining procedures, and can be digested to extract separated fractions or dried for autoradiography and permanent recording.

Componentes Editar

Polyacrylamide gels are composed of a stacking gel and separating gel. Stacking gels have a higher porosity relative to the separating gel, and allow for proteins to migrate in a concentrated area. Additionally, stacking gels usually have a pH of 6.8, since the neutral glycine molecules allow for faster protein mobility. Separating gels have a pH of 8.8, where the anionic glycine slows down the mobility of proteins. Separating gels allow for the separation of proteins and have a relatively lower porosity. Here, the proteins are separated based on size (in SDS-PAGE) and size/ charge (Native PAGE). [20]

Chemical buffer stabilizes the pH value to the desired value within the gel itself and in the electrophoresis buffer. The choice of buffer also affects the electrophoretic mobility of the buffer counterions and thereby the resolution of the gel. The buffer should also be unreactive and not modify or react with most proteins. Different buffers may be used as cathode and anode buffers, respectively, depending on the application. Multiple pH values may be used within a single gel, for example in DISC electrophoresis. Common buffers in PAGE include Tris, Bis-Tris, or imidazole.

Counterion balance the intrinsic charge of the buffer ion and also affect the electric field strength during electrophoresis. Highly charged and mobile ions are often avoided in SDS-PAGE cathode buffers, but may be included in the gel itself, where it migrates ahead of the protein. In applications such as DISC SDS-PAGE the pH values within the gel may vary to change the average charge of the counterions during the run to improve resolution. Popular counterions are glycine and tricine. Glycine has been used as the source of trailing ion or slow ion because its pKa is 9.69 and mobility of glycinate are such that the effective mobility can be set at a value below that of the slowest known proteins of net negative charge in the pH range. The minimum pH of this range is approximately 8.0.

Acrylamide ( C
3 H
5 NO mW: 71.08) when dissolved in water, slow, spontaneous autopolymerization of acrylamide takes place, joining molecules together by head on tail fashion to form long single-chain polymers. The presence of a free radical-generating system greatly accelerates polymerization. This kind of reaction is known as vinyl addition polymerisation. A solution of these polymer chains becomes viscous but does not form a gel, because the chains simply slide over one another. Gel formation requires linking various chains together. Acrylamide is carcinogenic, [21] a neurotoxin, and a reproductive toxin. [22] It is also essential to store acrylamide in a cool dark and dry place to reduce autopolymerisation and hydrolysis.

Bisacrylamide (norte,norte′-Methylenebisacrylamide) ( C
7 H
10 N
2 O
2 mW: 154.17) is the most frequently used cross linking agent for polyacrylamide gels. Chemically it can be thought of as two acrylamide molecules coupled head to head at their non-reactive ends. Bisacrylamide can crosslink two polyacrylamide chains to one another, thereby resulting in a gel.

Sodium dodecyl sulfate (SDS) ( C
12 H
25 NaO
4 S mW: 288.38) (only used in denaturing protein gels) is a strong detergent agent used to denature native proteins to individual polypeptides. This denaturation, which is referred to as reconstructive denaturation, is not accomplished by the total linearization of the protein, but instead, through a conformational change to a combination of random coil and α helix secondary structures. [6] When a protein mixture is heated to 100 °C in presence of SDS, the detergent wraps around the polypeptide backbone. It binds to polypeptides in a constant weight ratio of 1.4 g SDS/g of polypeptide. In this process, the intrinsic charges of polypeptides become negligible when compared to the negative charges contributed by SDS. Thus polypeptides after treatment become rod-like structures possessing a uniform charge density, that is same net negative charge per unit weight. The electrophoretic mobilities of these proteins is a linear function of the logarithms of their molecular weights. Without SDS, different proteins with similar molecular weights would migrate differently due to differences in mass-charge ratio, as each protein has an isoelectric point and molecular weight particular to its primary structure. This is known as native PAGE. Adding SDS solves this problem, as it binds to and unfolds the protein, giving a near uniform negative charge along the length of the polypeptide.

Urea ( CO(NH
2 )
2 mW: 60.06) is a chaotropic agent that increases the entropy of the system by interfering with intramolecular interactions mediated by non-covalent forces such as hydrogen bonds and van der Waals forces. Macromolecular structure is dependent on the net effect of these forces, therefore it follows that an increase in chaotropic solutes denatures macromolecules,

Ammonium persulfate (APS) ( N
2 H
8 S
2 O
8 mW: 228.2) is a source of free radicals and is often used as an initiator for gel formation. An alternative source of free radicals is riboflavin, which generated free radicals in a photochemical reaction.

TEMED (norte, norte, norte′, norte′-tetramethylethylenediamine) ( C
6 H
16 N
2 mW: 116.21) stabilizes free radicals and improves polymerization. The rate of polymerisation and the properties of the resulting gel depend on the concentrations of free radicals. Increasing the amount of free radicals results in a decrease in the average polymer chain length, an increase in gel turbidity and a decrease in gel elasticity. Decreasing the amount shows the reverse effect. The lowest catalytic concentrations that allow polymerisation in a reasonable period of time should be used. APS and TEMED are typically used at approximately equimolar concentrations in the range of 1 to 10 mM.

Chemicals for processing and visualization Edit

The following chemicals and procedures are used for processing of the gel and the protein samples visualized in it.

Tracking dye as proteins and nucleic acids are mostly colorless, their progress through the gel during electrophoresis cannot be easily followed. Anionic dyes of a known electrophoretic mobility are therefore usually included in the PAGE sample buffer. A very common tracking dye is Bromophenol blue (BPB, 3',3",5',5" tetrabromophenolsulfonphthalein). This dye is coloured at alkali and neutral pH and is a small negatively charged molecule that moves towards the anode. Being a highly mobile molecule it moves ahead of most proteins. As it reaches the anodic end of the electrophoresis medium electrophoresis is stopped. It can weakly bind to some proteins and impart a blue colour. Other common tracking dyes are xylene cyanol, which has lower mobility, and Orange G, which has a higher mobility.

Loading aids most PAGE systems are loaded from the top into wells within the gel. To ensure that the sample sinks to the bottom of the gel, sample buffer is supplemented with additives that increase the density of the sample. These additives should be non-ionic and non-reactive towards proteins to avoid interfering with electrophoresis. Common additives are glycerol and sucrose.

Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB)( C
45 H
44 N
3 NaO
7 S
2 mW: 825.97) is the most popular protein stain. It is an anionic dye, which non-specifically binds to proteins. The structure of CBB is predominantly non-polar, and it is usually used in methanolic solution acidified with acetic acid. Proteins in the gel are fixed by acetic acid and simultaneously stained. The excess dye incorporated into the gel can be removed by destaining with the same solution without the dye. The proteins are detected as blue bands on a clear background. As SDS is also anionic, it may interfere with staining process. Therefore, large volume of staining solution is recommended, at least ten times the volume of the gel.

Ethidium bromide (EtBr) is a popular nucleic acid stain. EtBr allows one to easily visualize DNA or RNA on a gel as EtBr fluoresces an orange color under UV light. [23] Ethidium bromide binds nucleic acid chains through the process of Intercalation. [3] While Ethidium bromide is a popular stain it is important to exercise caution when using EtBr as it is a known carcinogen. Because of this fact, many researchers opt to use stains such as SYBR Green and SYBR Safe which are safer alternatives to EtBr. [24] EtBr is used by simply adding it to the gel mixture. Once the gel has run, the gel may be viewed through the use of a photo-documentation system. [3]

Silver staining is used when more sensitive method for detection is needed, as classical Coomassie Brilliant Blue staining can usually detect a 50 ng protein band, Silver staining increases the sensitivity typically 10-100 fold more. This is based on the chemistry of photographic development. The proteins are fixed to the gel with a dilute methanol solution, then incubated with an acidic silver nitrate solution. Silver ions are reduced to their metallic form by formaldehyde at alkaline pH. An acidic solution, such as acetic acid stops development. [25] Silver staining was introduced by Kerenyi and Gallyas as a sensitive procedure to detect trace amounts of proteins in gels. [26] The technique has been extended to the study of other biological macromolecules that have been separated in a variety of supports. [27] Many variables can influence the colour intensity and every protein has its own staining characteristics clean glassware, pure reagents and water of highest purity are the key points to successful staining. [28] Silver staining was developed in the 14th century for colouring the surface of glass. It has been used extensively for this purpose since the 16th century. The colour produced by the early silver stains ranged between light yellow and an orange-red. Camillo Golgi perfected the silver staining for the study of the nervous system. Golgi's method stains a limited number of cells at random in their entirety. [29]

Autoradiography, also used for protein band detection post gel electrophoresis, uses radioactive isotopes to label proteins, which are then detected by using X-ray film. [30]

Western blotting is a process by which proteins separated in the acrylamide gel are electrophoretically transferred to a stable, manipulable membrane such as a nitrocellulose, nylon, or PVDF membrane. It is then possible to apply immunochemical techniques to visualise the transferred proteins, as well as accurately identify relative increases or decreases of the protein of interest.


Conclusión

In conclusion, a storage protein was isolated from the aerial tuber of Dioscorea bulbifera por primera vez. The storage protein has similar functional properties and structural homology with the storage proteins of other Dioscorea especies. The storage protein is heat stable and exhibited carbonic anhydrase, dehydroascorbate reductase and trypsin inhibitory activities. It is also a good source of essential amino acids thus, the protein may be suitable for development as functional food.


Native molecular weight determination - using restricted SDS in PAGE (Oct/10/2010 )

I wish to determine molecular weight of the native protein (without dissociating the subunits). My protein will remain and migrate in intact form during the PAGE in the absence of SDS, but since there will be no uniform charge on the molecules, the separation will not occur only on the basis of size, hence I will not be able to determine the exact molecular weight. I am aware of other techniques such as gel filtration, blue-native PAGE which are more commonly used for this purpose. But since they require specialized chemicals and/or equipments, I was looking for a simpler method. While doing so, I came to know from here, that PAGE with restricted SDS can be used for native and subunit molecular weight determination simultaneously . I did one experiment and both native and denatured forms of my two test protein migrated the same distance which I did not expect. My next experiment will be doing the PAGE in the complete absence of SDS, where I wont be able to see the exact weight, but I can at least get an idea of what is happening. Meanwhile, does anybody has the experience with native molecular mass determination with this/similar method?
Thanks for your time

Hi Ram,
If you want to look for a native protein marker,
try look for NativeMark LC0725 from invitrogen
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/LC0725?ICID=search-product

p/s: can you send me (pm) the article that you mentioned? I didn't subscribe to it. Gracias

adrian kohsf on Mon Oct 11 02:58:09 2010 said:

Hi Ram,
If you want to look for a native protein marker,
try look for NativeMark LC0725 from invitrogen
http://products.invitrogen.com/ivgn/product/LC0725?ICID=search-product

p/s: can you send me (pm) the article that you mentioned? I didn't subscribe to it. Gracias

Thanks for the reply Adrian. I am already using the same marker. Find attached paper in the PM


How Molecular Weight Is Determined

Empirical data on the molecular weight of a compound depends on the size of the molecule in question. Mass spectrometry is commonly used to find the molecular mass of small to medium-sized molecules. The weight of larger molecules and macromolecules (e.g., DNA, proteins) is found using light scattering and viscosity. Specifically, the Zimm method of light scattering and the hydrodynamic methods dynamic light scattering (DLS), size-exclusion chromatography (SEC), diffusion-ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy (DOSY), and viscometry may be used.


Ribosome: Types, Structure and Functions

The ribosome is one of the essential membrane-bound organelles of the cells. It is a minute spherical structure that contains RNA and protein and serves as the site of protein synthesis. It occurs either freely in the cytoplasm or in the matrix of mitochondria and chloroplast or attached on the outer membranes of the endoplasmic reticulum (ER) and nucleus. The word ribosome comes from ‘ribo’ meaning ribonucleic acid and Greek ‘soma’, meaning body.

Albert Claude first observed the tiny particles or granules of ribonucleoprotein and lipid under an electron microscope and he called them as microsomes in 1943. But Romanian born American Cell Biologist George E. Palade discovered it as dense particles or granules of the cytoplasm in 1955. In 1958, Richard B. Roberts proposed the name “Ribosome”. George E. Palade and other scientists discovered that ribosomes are the protein synthesizer in the cells and for this reason, in 1974 Palade was awarded the Nobel Prize for his great job.

Ribosomes are remarkably plentiful in cells. A mammalian cell contains about 10 billion protein molecules and most of them are produced from the ribosomes. One active eukaryotic cell contains about 10 million ribosomes while the prokaryotic cell (Escherichia coli) contain about 15000-20000 ribosomes which are equal about 25% of the total cell mass. The size of the ribosomes varies within cells which depend on the cell types. The average size of the ribosomes of the Escherichia coli is 200 Å in diameter.

Types of Ribosome

Ribosomes are of two types on the basis of the size and sedimentation coefficient (S) such as the 70S and 80S. Here, ‘S’ refers to Svedberg unit. This is a sedimentation coefficient which shows how fast a cell organelle sediments in an ultracentrifuge.

70S Ribosome: This type of ribosome is comparatively smaller and has sedimentation coefficient 70S which consists of two subunits such as large 50S subunit and small 30S subunit and they are linked together. The molecular weight is 2.7×106 Daltons. They are found in all prokaryotic cells, in mitochondria and chloroplast of eukaryotic cells.

80S Ribosome: This type of ribosome is comparatively larger and has sedimentation coefficient 80S which consists of large circular 60S subunit and small elliptical 40S subunit. The molecular weight is 40×106 Daltons. They are found in all eukaryotic cells.

Physical Structures of Ribosome

Each ribosome contains two subunits, such as a larger one and a smaller one. Ribosomal subunits are made in the nucleolus from the proteins and nucleic acids. Then, through the nuclear pores, they are exported into the cytoplasm. The sizes of the two subunits are unequal and exist in this state until required for use. The larger sub-unit is about two times larger than smaller one

The 40S and 60S are the small and large subunits of eukaryotic cells, respectively, while 30S and 50S are the small and large subunit, respectively of prokaryotic cells. The smaller subunit occurs above the larger subunit-like a cap. The ribosomal subunits occur individually when ribosomes are not involved in protein synthesis. The two subunits join together when protein synthesis starts and undergo dissociation when protein synthesis stops. During protein synthesis, two subunits are grouped and form polyribosome or polysome.

Chemical Structure of Ribosome

Chemically, ribosomes consist of ribosomal proteins and rRNA(ribosomal RNA). In the prokaryotic cells, ribosomes have 40% protein and 60% rRNA while in eukaryotic cells, ribosomes are made up of about 50% protein and 50% rRNA. Besides these, ribosomes also contain trace amounts of Magnesium (Mg), Calcium(Ca) and manganese(Mn).



Comentarios:

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