Información

¿Cómo determinar la sensibilidad en una curva dosis-respuesta?

¿Cómo determinar la sensibilidad en una curva dosis-respuesta?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

En una curva de respuesta a la dosis, el% de inhibición se puede representar frente al antagonista de la concentración. En nuestro caso, el efecto del antagonista se prueba en diferentes variantes genéticas de un microbio.

Al intentar determinar la potencia de un fármaco en las diferentes variantes, comparé los valores de IC50. Cuanto menor sea la concentración requerida para una inhibición del 50%, más potente será el fármaco.

Al comparar la eficacia de los fármacos, comparo las concentraciones necesarias para alcanzar Emax o la inhibición máxima que puede ejercer cada fármaco, que resulta ser una inhibición del 100%.

Para comparar la sensibilidad, ¿cómo se procede?


Creo que estas tras el Pendiente de la curva dosis-respuesta:


Curva dosis-respuesta. Fuente: Merck

La pendiente indica el cambio en la respuesta por dosis unitaria, que se traduce en sensibilidad.


Algunas notas sobre estos cálculos:

  • Aunque los investigadores a veces dicen que calculan el área bajo la & ldquocurve & rdquo de dosis-respuesta, en realidad solo tiene sentido calcular el área bajo los datos de dosis-respuesta, no bajo una curva de ajuste. Si tiene suficientes datos de calidad para ajustarse a las curvas de dosis-respuesta y determinar la EC50 (o IC50), la pendiente y el efecto máximo con intervalos de confianza razonablemente estrechos, compare esos parámetros. Comparar el área bajo la relación dosis-respuesta es una estrategia a utilizar cuando no puede determinar esos parámetros con precisión.
  • Si los valores de X están igualmente espaciados, los cálculos de Prism & rsquos AUC son equivalentes a tomar un promedio ponderado de todos los valores de Y, dando los valores de Y correspondientes a los valores de X más bajos y más altos, la mitad del peso de los otros puntos. Si los valores de X no están igualmente espaciados, el área sigue siendo un promedio ponderado de las respuestas, pero las ponderaciones representan el espaciado desigual y las respuestas correspondientes a las dosis ampliamente espaciadas tienen más peso que las respuestas de las dosis que están más estrechamente espaciadas.
  • El área bajo la curva reportada por Prism es el área bajo la & ldquocurve & rdquo creada al conectar las respuestas con líneas rectas. Sus unidades son las unidades X (generalmente concentración logarítmica) multiplicadas por las unidades Y. Realmente no es posible interpretar estas unidades, pero lo único que le importa a usted es comparar el área determinada en diferentes condiciones o con diferentes líneas celulares.
  • Solo puede comparar áreas calculadas con exactamente el mismo conjunto de valores X. Si los conjuntos de datos utilizan diferentes dosis o concentraciones, por lo que tienen un conjunto diferente de valores X, cualquier comparación de área no tendría sentido.
  • El análisis AUC de Prism le pide que especifique una línea de base para el área. Puede ingresar Y = 0 o Y igual a algún otro valor de línea de base medido usando los controles apropiados.
  • Si ingresó valores de Y replicados (digamos triplicados) para cada X, el análisis de AUC de Prism promedia estos y solo se ingresa la media en los cálculos del AUC, pero la variación entre las repeticiones permite a Prism calcular el SE del AUC y sus 95 % CI.
  • Si desea comparar áreas con datos de dosis-respuesta de dos conjuntos de datos, concéntrese en la diferencia en lugar de en la proporción. Obtendrá una proporción diferente si define la línea de base de manera diferente.

Todas estas pruebas descritas aquí son medidas de precisión en un sentido u otro. Es inquietante que la mayoría de las personas, cuando se enfrentan a la tarea de definir la precisión, normalmente no podrán dar más que la definición común del hogar (es decir, "la cualidad de ser correcto o fiel a algún estándar objetivo"). En estadística, la definición de precisión la rige la ISO, que define lo siguiente:

  • Precisión es la proximidad de los resultados de la medición al valor real
  • Precisión es la repetibilidad o reproducibilidad de la medición

En ocasiones, la precisión se denomina "precisión diagnóstica" o "eficacia diagnóstica" y se expresa como la proporción de sujetos correctamente clasificados entre todos los sujetos:


¿Cómo determinar la sensibilidad en una curva dosis-respuesta? - biología

Little Pro en 2019-06-06 Vistas:

Distribuciones de sensibilidad de especies (SSD) son una técnica muy importante utilizada en la evaluación de riesgos ecológicos. Se utiliza principalmente para derivar concentraciones previstas sin efecto (PNEC) para la evaluación de riesgos ambientales.

Principios de SSD

Diferentes especies muestran diferentes sensibilidades a la misma sustancia química y la variación entre esas especies puede describirse mediante una distribución estadística. Si ha realizado muchas pruebas de ecotoxicidad con la misma sustancia utilizando varias especies (peces, invertebrados y plantas) y ha obtenido muchos criterios de valoración de ecotoxicidad, puede utilizar SSD, el enfoque estadístico, para dibujar una curva como la siguiente y derivar HC5 (concentración peligrosa para el 5% de las especies).

Luego, el HC5 derivado se puede usar para calcular la PNEC dividiéndola con un factor de seguridad adicional (1-5).

Si solo tiene un pequeño conjunto de datos (es decir, algas, dafnidos y peces), el enfoque SSD no será aplicable. En ese caso, normalmente es necesario dividir el valor de NOEC más bajo con el factor de seguridad más grande (normalmente 10).

¿Tiene preguntas?

No brindamos servicios de consultoría. Si tiene preguntas o necesita ayuda, comuníquese con nuestro patrocinador. También puede encontrar un experto en el directorio de empresas CSP a continuación. Si es un consultor, puede incluirse en el directorio de empresas de CSP (gratis) o patrocinar esta página para dejar su información de contacto en esta página.


DISCUSIÓN

La administración de agonistas de GnRH suprimió la secreción de testosterona y LH endógena, por lo tanto, las concentraciones de testosterona circulante durante el tratamiento fueron proporcionales a la dosis administrada de enantato de testosterona. Esta estrategia de administración combinada de agonista de GnRH y dosis graduadas de enantato de testosterona fue eficaz para establecer diferentes niveles de concentraciones séricas de testosterona entre los cinco grupos de tratamiento. Los diferentes niveles de concentraciones de testosterona circulante creados por este régimen se asociaron con cambios dependientes de la dosis y la concentración en la masa libre de grasa, masa grasa, volumen de los músculos del muslo y cuádriceps, fuerza muscular, potencia de las piernas, hemoglobina, IGF-I circulante y colesterol HDL en plasma. Los niveles séricos de PSA, el deseo y la actividad sexuales y la cognición espacial no cambiaron significativamente con ninguna dosis. Los cambios en la masa libre de grasa, el volumen muscular, la fuerza y ​​potencia de la prensa de piernas, la hemoglobina y el IGF-I se correlacionaron positivamente, mientras que los cambios en el colesterol HDL plasmático y la masa grasa se correlacionaron negativamente con la dosis de testosterona y las concentraciones de testosterona total y libre durante el tratamiento. .

El cumplimiento del régimen de tratamiento fue alto. Los participantes recibieron el 100% de su agonista de GnRH programado y el 99% de las inyecciones de testosterona. Los niveles séricos de LH se suprimieron en todos los hombres, lo que demuestra la eficacia del tratamiento con agonistas de GnRH. El régimen de tratamiento fue bien tolerado. No hubo cambios significativos en el PSA o las enzimas hepáticas en ninguna dosis. Sin embargo, se desconocen los efectos a largo plazo de la administración de andrógenos en la próstata, el riesgo cardiovascular y el comportamiento.

Los niveles séricos de testosterona se midieron 7 días después de la inyección anterior y reflejan los niveles más bajos de testosterona después de una inyección. Las concentraciones de testosterona fueron más altas en otros momentos. Las inyecciones semanales de enantato de testosterona están asociadas con fluctuaciones en los niveles de testosterona (44). Aunque las concentraciones nadir de testosterona estaban altamente correlacionadas con la dosis de enantato de testosterona, es posible que la administración sostenida de testosterona mediante un parche o gel pueda revelar diferentes relaciones dosis-respuesta, particularmente con respecto a la hemoglobina y el colesterol HDL (19).

No hubo cambios significativos en la actividad sexual en general o el deseo sexual en ningún grupo, incluidos los que recibieron la dosis de 25 mg. El reemplazo de testosterona de los hombres hipogonadales mejora la frecuencia de los actos y fantasías sexuales, el deseo sexual y la respuesta a los estímulos eróticos visuales (3, 13, 15, 17, 31, 41). Nuestros datos demuestran que las concentraciones séricas de testosterona en el extremo inferior del rango masculino pueden mantener algunos aspectos de la función sexual (3, 13). Se ha demostrado que la testosterona regula la actividad de la óxido nítrico sintasa en el músculo liso cavernoso (32), y es posible que la rigidez óptima del pene requiera niveles de testosterona más altos que los producidos por la dosis de 25 mg.

Este estudio demuestra que un aumento en las concentraciones de testosterona circulante resulta en aumentos dependientes de la dosis en la masa libre de grasa, el tamaño de los músculos, la fuerza y ​​la potencia. Las relaciones entre las concentraciones circulantes de testosterona y los cambios en la masa libre de grasa y el tamaño del músculo se ajustan a una única curva log-lineal de dosis-respuesta. Nuestros datos no apoyan la noción de dos curvas de dosis-respuesta separadas que reflejan dos mecanismos independientes de acción de la testosterona en el músculo. Forbes et al. (22) predijeron hace 25 años que la acumulación de masa muscular durante la administración de andrógenos está relacionada con la dosis acumulada de andrógenos, el producto de la dosis diaria y la duración del tratamiento. Nuestros datos son consistentes con la hipótesis de Forbes de una relación lineal entre la dosis de testosterona y la acumulación de masa magra, sin embargo, no sabemos si aumentar la duración del tratamiento conduciría a mayores ganancias en la masa muscular.

Además, no sabemos si la capacidad de respuesta a la testosterona se atenúa en los hombres mayores. Las relaciones entre la dosis de testosterona y la respuesta pueden estar moduladas por otros reguladores del crecimiento muscular, como el estado nutricional, el nivel de ejercicio y actividad, los glucocorticoides, las hormonas tiroideas y el estado secretor de la hormona del crecimiento endógena.

Los niveles séricos de PSA disminuyen después de la abstinencia de andrógenos, y el reemplazo de testosterona en hombres con hipogonadismo aumenta los niveles de PSA al rango normal (16, 34). No encontramos cambios significativos en el PSA en ninguna dosis, lo que indica que la dosis más baja de testosterona mantuvo los niveles de PSA. No medimos el volumen de la próstata en este estudio, por lo tanto, no sabemos si el volumen de la próstata exhibe la misma relación con la dosis de testosterona que los niveles de PSA.

Los niveles de hemoglobina cambiaron significativamente en relación con la dosis y concentración de testosterona. La testosterona regula la eritropoyesis a través de sus efectos sobre la eritropoyetina y la proliferación de células madre (14,35, 40). Aunque los incrementos modestos en la hemoglobina podrían ser beneficiosos en los hombres anémicos con deficiencia de andrógenos con enfermedades crónicas, los aumentos marcados en los niveles de hemoglobina podrían incrementar el riesgo de eventos cerebrovasculares (25) e hipertensión (42).

Aunque los hombres, en promedio, obtienen mejores resultados en las pruebas de cognición espacial que las mujeres, no se ha demostrado de manera consistente que el reemplazo de testosterona mejore la cognición espacial en hombres con hipogonadismo (1, 29, 48). No encontramos cambios en la cognición espacial en ninguna dosis. El tamaño del efecto de las diferencias de género en la cognición espacial es pequeño; es posible que nuestro estudio no tuviera el poder suficiente para detectar pequeñas diferencias. No podemos excluir la posibilidad de que las diferencias de género en la cognición espacial puedan deberse a los efectos organizativos de la testosterona y podrían no responder a los cambios en los niveles de testosterona en los hombres adultos.

Aunque el cambio medio en la masa libre de grasa y el tamaño del músculo se correlacionó con la dosis y concentración de testosterona, hubo una heterogeneidad considerable en respuesta a la administración de testosterona dentro de cada grupo. Estas diferencias individuales en respuesta a la administración de andrógenos pueden reflejar diferencias en el nivel de actividad, metabolismo de la testosterona, nutrición o polimorfismos en el receptor de andrógenos, miostatina, 5-α-reductasa u otros reguladores del crecimiento muscular.

Nuestros datos demuestran que los diferentes procesos dependientes de andrógenos tienen diferentes relaciones de respuesta a la dosis de testosterona. Algunos aspectos de la función sexual y la cognición espacial, y los niveles de PSA, se mantuvieron con dosis relativamente bajas de testosterona en hombres tratados con agonistas de GnRH y no aumentaron más con la administración de dosis más altas de testosterona. Por el contrario, las dosis graduales de testosterona se asociaron con cambios dependientes de la dosis y la concentración de testosterona en la masa libre de grasa, la masa grasa, el volumen muscular, la fuerza y ​​potencia de la prensa de piernas, la hemoglobina, el IGF-I y el colesterol HDL plasmático. Los mecanismos precisos de las diferencias específicas de tejidos y funciones en la dependencia de la dosis de testosterona no se comprenden bien (36). Aunque solo una proteína receptora de andrógenos se expresa en todos los tejidos que responden a los andrógenos, la especificidad tisular de la acción de los andrógenos podría estar mediada por el reclutamiento combinatorio de coactivadores y correpresores específicos de tejido (36).

Las dosis de testosterona asociadas con ganancias significativas en la masa libre de grasa, el tamaño de los músculos y la fuerza se asociaron con reducciones significativas en las concentraciones plasmáticas de HDL. Se necesitan más estudios para determinar si se pueden lograr efectos anabólicos clínicamente significativos de la testosterona sin afectar negativamente el riesgo cardiovascular. Son deseables los moduladores selectivos de los receptores de andrógenos que aumentan preferentemente la masa y la fuerza muscular, pero que solo afectan mínimamente los factores de riesgo cardiovascular y de la próstata (36).

Este estudio fue financiado principalmente por la subvención 1RO1-AG-14369 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El apoyo adicional fue proporcionado por las subvenciones 1RO1-DK-49296, 1RO1-DK-59297–01, subvención de la Administración Federal de Drogas ODP 1397, una investigación clínica general Subvención del centro MO-00425, NIH-Centro nacional de recursos de investigación-00954, Subvenciones de RCMI P20-RR-11145–01 (Iniciativa de investigación clínica de RCMI) y G12-RR-03026. BioTechnology General (Iselin, NJ) proporcionó enantato de testosterona y R. P. Debio (Martigny, Suiza) proporcionó el agonista de GnRH (Decapeptyl).


Curvas de respuesta de fase:

Este artículo se publicó originalmente en Circadian Clocks from Cell to Human, ed. T. Hiroshige y K. Honma (Hokkaido Univ. Press, Sapporo), 1992, págs. 209-249. El documento se reimprime aquí con algunas ligeras modificaciones con el permiso de los Dres. Ken-ichi y Sato Honma.

Pocos cronobiólogos han intentado revisar el tema de las curvas de respuesta de fase (PRC); las revisiones de Aschoff (1) y Pittendrigh (55) son los ejemplos notables. Probablemente la tarea ha parecido demasiado abrumadora para emprenderla. La compilación del PRC Atlas (31) me obligó a estudiar todos los PRC publicados. Este proyecto llevó a algunas generalizaciones que creo que vale la pena resumir aquí. Este documento no intenta revisar exhaustivamente todos los PRC - el Atlas es en sí mismo la revisión más completa posible - sino discutir generalizaciones basadas en el Atlas de PRC. Los temas a tratar son (A) PRC como reflejo de los mecanismos de arrastre (reajuste por estímulos de luz, oscuridad y temperatura) y estrategias ecológicas de los mismos (B) vías de fototransducción (C) PRC como sondas para el mecanismo de marcapasos circadianos (D ) PRC como marcadores de fase para el oscilador y (E) PRC como indicadores de la amplitud de los osciladores circadianos. Este documento muestra cifras, la mayoría de las cuales provienen del Atlas de la República Popular China, y se refiere a los números de la República Popular China del formato Atlas (por ejemplo, A / Gp-2, C / Nc-10).

Un PRC es un gráfico de cambios de fase en función de la fase circadiana de un estímulo. Los estímulos incluyen pulsos de luz, pulsos de temperatura o pulsos de fármacos o productos químicos. Como se muestra en las Figs. 1A, 1D y 1G, los PRC representativos de osciladores circadianos para pulsos de luz exhiben cambios de fase de retraso en la noche subjetiva temprana y cambios de fase de avance en la noche subjetiva tardía, con pocos cambios de fase que ocurren durante el día subjetivo (por lo tanto, la porción del día subjetivo de la República Popular China se refiere a menudo como la "zona muerta"). Como se discutirá más adelante, algunas de estas características topológicas de los PRC ligeros son cruciales para determinar la capacidad de los marcapasos circadianos para incorporarse al ciclo diario de luz / oscuridad.

Como se ilustra en la Fig. 1, hay dos denominados "tipos" de PRC: el Tipo 1 y el Tipo O (72). El tipo 1 muestra cambios de fase relativamente pequeños (p. Ej., Generalmente cambios de fase de menos de 6 horas) y tiene una transición continua entre retrasos y avances (Fig. 1A), mientras que los PRC de Tipo 0 muestran grandes cambios de fase (Fig. 1D) . Si los cambios de fase de un PRC Tipo 0 se grafican como avances y retrasos, a menudo aparece una discontinuidad (el "punto de interrupción", ver más abajo y en la Fig. 2) en la transición entre el retraso y los cambios de fase de avance. Los términos Tipo "0" y "1" se refieren a la pendiente media de la curva cuando se traza como "nueva fase" frente a "fase antigua", una denominada "curva de transición de fase" o PTC (mientras que un PRC traza " cambio de fase "frente a" fase anterior "). Como se muestra en la Fig. 1B, el reinicio de Tipo 1 se puede visualizar como un PTC con una pendiente promedio de 1 (ángulo de 45 0), mientras que la Fig. 1E representa un PTC de Tipo 0, que tiene una pendiente promedio de 0 (ángulo de 0 0) .

El hecho de que se presente un restablecimiento de Tipo 1 o Tipo 0 a menudo depende de la fuerza del estímulo. Por ejemplo, aumentar la dosis de luz (Culex: pulsos de luz de 7,5 min frente a 120 min, F / Cq-1-2) o la dosis del fármaco (Gonyaulax: anisomicina 0,1 frente a 0,3 m M, F / Gp-19-20 ) convierte el tipo 1 en el reinicio del tipo 0. Sin embargo, otros factores también pueden causar la conversión de Tipo 1 a Tipo 0: por ejemplo, mutación genética (Drosophila melanogaster: F / Dm-1-2) y calidad y / o intensidad de la luz de fondo (Gonyaulax: A / Gp-4-5 ). Estos "otros factores" probablemente afectan la sensibilidad del reloj a los estímulos, por lo que afectan la fuerza percibida del estímulo.

La interpretación de "ciclo límite" del reinicio del Tipo 1 frente al del Tipo 0 también se compara en las Figuras 1C y 1F. Los estímulos de cambio de fase se postulan para cambiar las variables de estado del "ciclo límite" (el círculo de las Figs. 1C, 1F, 1I) a otra área del plano de fase, denominada "contorno de reinicio" (la línea discontinua gruesa de las Figs. . 1C, 1F, 1I). Si este cambio mueve las variables de estado a otra isócrona en el plano de fase, se observará un desplazamiento de fase de estado estable. El restablecimiento de tipo 1 se produce si el contorno de restablecimiento no se mueve más allá de la singularidad (restableciendo el contorno en el "lado cercano" de la singularidad), mientras que el restablecimiento de tipo 0 se produce si el estímulo es lo suficientemente fuerte como para mover las variables más allá de la región singular (restableciendo el contorno en " lado lejano "de la singularidad).
Higos. 1G, 1H, 1I también ilustran un caso interesante de restablecimiento de "estímulos críticos" en Gonyaulax (A / Gp-5). Los pulsos de luz dados temprano en la noche subjetiva provocan un reinicio de Tipo 1, mientras que los pulsos de luz dados más tarde producen un reinicio de Tipo 0, produciendo un PRC altamente asimétrico y un contorno de reinicio.

Se podría suponer que los estímulos presentados durante la zona muerta (por ejemplo, ct 3-10) no modifican las variables de estado. Si bien esto puede ser cierto para algunos modelos específicos, no es una necesidad de un modelo de ciclo límite. La otra alternativa, igualmente plausible, es que los estímulos presentados durante la zona muerta inducen cambios de las variables de estado, pero estos valores alterados no mueven las variables a una isócrona diferente (ver Fig. 1F). Por lo tanto, no se produce ningún cambio de fase.En consecuencia, las variables de estado del marcapasos no son necesariamente insensibles al estímulo durante la zona muerta; de hecho, el estímulo podría inducir grandes cambios en las variables de estado, pero estos cambios no mueven el marcapasos a una isócrona diferente.

La discontinuidad del punto de ruptura de los PRC es en algunos casos simplemente una convención de trazado de asignar arbitrariamente los cambios de fase en un medio ciclo (12 horas) como retrasos y el otro medio ciclo como avances. Para evitar estas distinciones arbitrarias, a veces los PRC de Tipo 0 se trazan de forma monótona, es decir, todos los cambios de fase se trazan como retrasos de 0 a 24 horas, como se muestra en la Fig. 1D. Al trazar esos PRC de Tipo 0 que resultan ser asimétricos (por ejemplo, Fig. 1G), el punto de corte no es una convención arbitraria, porque el PRC tiene una discontinuidad sin importar cómo se traza el PRC.

La ventaja de graficar los cambios de fase de forma monótona (o como un PTC) es que tales gráficos no inducen a error al lector a asumir que el restablecimiento de avance frente a la demora son mecánicamente diferentes, por ejemplo, que los cambios de fase de avance son el resultado de un cambio de la variable de estado de un marcapasos. en una dirección, mientras que los cambios de fase de retardo cambian la variable en una dirección opuesta. De hecho, los modelos de ciclo límite generalmente no sugieren una diferencia mecánica entre los avances y retrasos en el restablecimiento del Tipo O. Además, los modelos de ciclo límite suelen interpretar que la transición del restablecimiento de Tipo 1 al Tipo O depende simplemente de si la magnitud del estímulo es suficiente para desplazar el contorno de restablecimiento más allá de la "singularidad" (72).

En retrospectiva, lamento no haber trazado también el comportamiento de restablecimiento de fase como PTC en el Atlas, por dos razones. En primer lugar, los PTC evitan la distinción engañosa entre avance y retraso que se discutió anteriormente. En segundo lugar, los PTC pueden codificar otra información sobre el marcapasos. Por ejemplo, Cote (8) modificó recientemente un PRC publicado por Tamponnet y Edmunds (69) en un formato PTC y puede haber descubierto un fenómeno hasta ahora desconocido: ¡restablecimiento de tipo 2! Winfree (72) afirma que el restablecimiento de tipo 2 implica que tres o más variables de estado deben ser intrínsecas al mecanismo del marcapasos. Esta sorprendente percepción se obtuvo simplemente volviendo a trazar los datos como un PTC. Por lo tanto, los PTC pueden brindarnos información adicional. (Tenga en cuenta que la versión para computadora del Atlas permite cambiar rápidamente entre los formatos PRC y PTC).

II. ¿Cómo se puede medir una PRC?

En principio, los PRC pueden determinarse mediante varios protocolos diferentes, como describe Aschoff (1). A continuación se describen cuatro de los protocolos que se utilizan con más frecuencia (consulte la referencia 1 para ver una discusión de otros protocolos):

(1) El estímulo (pulso) se aplica mientras el oscilador está funcionando libremente (por ejemplo, un pulso de luz a un organismo que corre libremente en DD). En este caso, el organismo individual sirve como su propio control, y la asignación precisa del tiempo circadiano del estímulo depende del conocimiento del tiempo circadiano de f r en un recorrido libre. Por lo general, el tiempo circadiano de f r se evalúa por su fase en un ciclo LD 12: 12, pero es importante asegurarse de que no se produzca un "enmascaramiento" de f r en LD. La posibilidad de enmascaramiento se puede evaluar liberando al organismo de LD a un freerun y confirmando que f r en el freerun se extrapola de nuevo a f r en LD.

(2) El estímulo (pulso) se aplica en un movimiento libre poco después de la liberación de las condiciones de arrastre (por ejemplo, un pulso de luz a un organismo en DD dentro de unos pocos ciclos después de la liberación de LD 12:12). Este es un buen método cuando se está probando una población de organismos, requiere unos pocos organismos de control (cultivos) que no reciben un estímulo con el que comparar los tratados. Este es probablemente el mejor método para estimar el comportamiento de arrastre, ya que la forma de la PRC poco después de la liberación del arrastre debería reflejar más su forma durante el arrastre que su forma después de una larga exposición a condiciones de funcionamiento libre.

(3) El estímulo es un "paso" de una condición continua a otra (por ejemplo, DD a LL).

(4) El PRC se puede estimar a partir del ángulo de fase asumido por el ritmo a diferentes ciclos T del estímulo (por ejemplo, ciclos T de pulsos de luz). Un ejemplo de este método es el de Eskin (13), quien comparó los PRC derivados del método n. ° 1 anterior (ver H / Pd-1) y el método n. ° 4 y encontró que eran equivalentes. El método # 4 no puede dar un PRC completo porque el ángulo de fase no será estable alrededor de la región del punto de ruptura del PRC durante el arrastre a los ciclos T.

III. ¿Cómo se debe trazar un PRC?

Para la compilación de los PRC en el Atlas, se eligió un formato estandarizado para poder comparar fácilmente los diferentes PRC. Los comentarios a continuación se refieren al formato utilizado en el Atlas de la República Popular China.

(1) Información general: La abscisa es el tiempo circadiano (ct) del estímulo, de ct 0 a ct 24. El tiempo circadiano de 0 a ct 24 es la duración del período endógeno (t, "tau"). Debido a que LD 12:12 se considera condiciones estándar de arrastre, el tiempo circadiano 0 se define como el comienzo del día subjetivo (por lo tanto, el amanecer subjetivo o "luces encendidas") y ct 12 como el comienzo de la noche subjetiva (por lo tanto anochecer subjetivo). La ordenada es la magnitud del cambio de fase en horas circadianas (ver más abajo). Los avances se representan por encima de la abscisa como valores positivos, mientras que los retrasos se representan debajo como valores negativos. Para el restablecimiento de Tipo 0, todos los cambios de fase se pueden representar de forma monótona, como en la Fig. 1D.

(2) Tiempo circadiano: debido a que los marcapasos circadianos tienen diferentes frecuencias endógenas, los PRC entre diferentes organismos no pueden compararse directamente a menos que sus escalas de tiempo estén estandarizadas al "tiempo circadiano". El primer aspecto del tiempo circadiano es que las escalas para el tiempo circadiano del estímulo (abscisas) y la magnitud del cambio de fase (ordenadas) se expresan en "horas circadianas". Los PRC se escalan en horas circadianas para poder comparar directamente los ejes horizontal y vertical de los PRC de diferentes organismos. Una hora circadiana es igual a 1/24 del período endógeno, t (por lo tanto, una hora circadiana = tau / 24 horas). Para convertir horas "reales" en horas "circadianas", el número de horas reales (p. Ej., Del cambio de fase) se multiplica por 24 / tau.

(3) Definición de tiempo circadiano cero: El segundo aspecto del tiempo circadiano es que los PRC deben trazarse a lo largo de la abscisa en relación con un tiempo definido, por ejemplo, tiempo circadiano cero (ct 0). En general, la definición de ct 0 ha sido la variable menos estandarizada de PRC en la literatura y, sin embargo, es crucial para poder comparar las respuestas de cambio de fase entre organismos.

La definición estándar de ct 0 es como la fase en el freerun que se extrapola al último "amanecer" (es decir, "luces encendidas" del último ciclo LD 12:12 visto antes de la liberación en condiciones constantes-DD o LL ). En muchos casos, sin embargo, son necesarias definiciones alternativas. Los PRC que se miden en LL a menudo usan el comienzo de LL como el "amanecer" extrapolado en lugar de "luces encendidas" del ciclo de luz final. Además, muchos PRC se han medido a partir de organismos que han estado en condiciones constantes durante mucho tiempo, por lo que es inexacto o inconveniente extrapolar a la señal final de encendido. Para estos PRC, el tiempo circadiano generalmente se define a partir del punto de referencia de fase (f r). Primero, se mide el ángulo de fase en LD 12:12 del punto de referencia de fase (f r) del ritmo. Entonces, se supone que este f r define la misma fase del oscilador en condiciones de funcionamiento libre, y ct 0 se convierte en un cierto número de horas circadianas antes o después de f r en el funcionamiento libre. Por ejemplo, el inicio de la actividad (f r) de los roedores nocturnos ocurre al anochecer en LD 12:12, y por lo tanto se define como ocurriendo en ct 12. Por lo tanto, ct 0 se convierte en ese tiempo que es doce horas circadianas antes o después de f r en un freerun. Como se discutió anteriormente (método n. ° 1 de medición de PRC), la determinación de f r en LD puede complicarse por el problema del enmascaramiento. En consecuencia, en todos los casos, el tiempo circadiano de f r en LD debe determinarse liberando al organismo en condiciones de carrera libre y extrapolando f r de nuevo a su ángulo de fase en el último ciclo de LD.

(4) Estimación de la magnitud y la dirección del cambio de fase: Hay dos problemas principales que deben tenerse en cuenta al estimar el cambio de fase: (1) con frecuencia, el período (tau) cambia después de un estímulo ("efectos secundarios") y (2) a menudo, especialmente en el caso de cambios de fase avanzados, puede haber ciclos transitorios de reajuste de fase pequeño o nulo antes de que se establezca el cambio de fase de estado estable. La mejor manera de evitar estos dos problemas es extrapolar f r para muchos ciclos antes y después del estímulo, preferiblemente mediante una regresión lineal de mínimos cuadrados. Los ciclos transitorios obvios deben excluirse de esta regresión. Luego, el cambio de fase se calcula por la diferencia en el día del estímulo entre el f r extrapolado antes y después del estímulo. En el caso del método # 2 de medición de PRC, los controles f r se extrapolan al día del estímulo y se utilizan para comparar con las extrapolaciones de organismos experimentales.

Para el reinicio de Tipo 1, generalmente es fácil determinar si el cambio de fase debe representarse como un avance o retraso en un PRC, pero cuando se encuentran los grandes cambios de fase del reinicio de Tipo 0, a menudo es difícil asignar de manera inequívoca la dirección de el cambio de fase. Un enfoque es simplemente trazar el PRC de manera monótona: desde una perspectiva de ciclo límite, la distinción entre avances y retrasos en el restablecimiento de Tipo 0 es arbitraria de todos modos (ver Fig. 1D).

Otro enfoque para distinguir operativamente entre avances y retrasos mientras se usa una presentación de tipo PRC es realizar experimentos de respuesta a la dosis, generando así curvas de respuesta a la dosis (DRC). Los DRC analizan la respuesta en una determinada fase circadiana del reloj a diferentes intensidades / concentraciones del estímulo. La reducción de la intensidad del estímulo cambiará el restablecimiento del Tipo 0 al restablecimiento del Tipo 1, momento en el que la distinción entre avances y retrasos se vuelve más obvia.

(5) Definición de fase de estímulo: no importa qué tipo de estímulo se considere, ya sea luz, temperatura o pulso químico, el inicio del pulso de estímulo se ha representado como la "fase de estímulo" en la abscisa de los PRC en el Atlas. En sus artículos originales, muchos autores han trazado los PRC utilizando otras convenciones para el tiempo de estímulo; a menudo se utilizó el punto medio y, a veces, incluso el final del pulso. No existe un razonamiento a priori que favorezca alguno de estos criterios como "fase de estímulo". Todos son arbitrarios. Aschoff instó en 1965 (1) a que el punto medio del estímulo se utilizara como tiempo de estímulo. Su argumento, que los PRC trazados de esa manera "se alinean" mejor, tiene sentido para muchos PRC ligeros. Sin embargo, cuando se consideran todos los tipos de estímulos y formas PRC, tal convención de trazado puede causar problemas. En particular, argumentaré más adelante que para muchos estímulos químicos / farmacológicos, se desconoce la duración efectiva del pulso, ya que el tiempo de recuperación de un fármaco no siempre coincide con el tiempo de lavado. Si se desconoce la duración efectiva, se desconoce el punto medio.

Por lo tanto, se eligió el comienzo del pulso como el marcador estándar para la "fase de estímulo". Es probable que la respuesta de cambio de fase de un oscilador sea una característica de la fase cuando comienza el estímulo, es decir, de la primera fase no perturbada que se presenta con un estímulo. Si uno usa el punto medio o el final del estímulo como marcador, entonces está eligiendo una fase que ya ha sido perturbada. Y usar el inicio como marcador de la fase de estímulo evita las complicaciones del tiempo de recuperación.

IV. ¿Para qué sirven los PRC?

(A) PRC como indicadores del mecanismo de arrastre

Los PRC para estímulos de luz y temperatura han sido muy valiosos para comprender cómo los marcapasos circadianos se incorporan al ciclo diario por señales ambientales de luz y temperatura (55). Brevemente, el restablecimiento de fase compensa el hecho de que el período de funcionamiento libre t de los osciladores circadianos no es igual a 24 horas; por lo tanto, los estímulos de arrastre (por ejemplo, la luz) reinician el reloj para igualar el período del oscilador de arrastre (el circadiano reloj) al período del oscilador de arrastre (la rotación diaria de la tierra). Este principio básico se resume en la siguiente ecuación para un oscilador circadiano bajo arrastre de estado estable: t - T = Df

Restablecimiento del pulso de luz
La luz suele ser el Zeitgeber más importante para incorporar osciladores circadianos. Por lo tanto, los PRC para estímulos de luz tienen un interés especial y, de hecho, se han estudiado de manera más extensa. Los PRC de pulso de luz suelen tener características similares: retrasos de los cambios de fase en la noche subjetiva temprana, cambios de fase avanzados en la noche subjetiva tardía y pocos cambios de fase durante el día subjetivo. Esta generalización es cierta tanto si el ritmo manifiesto alcanza su punto máximo durante el día, la noche o el crepúsculo (55). Por lo tanto, los PRC de los organismos nocturnos frente a los diurnos tienen una fase similar en el ciclo de luz / oscuridad, aunque sus ritmos no lo estén.

La magnitud del cambio de fase exhibido por el reloj es un indicador de los "límites de arrastre". Obviamente, los PRC con grandes cambios de fase pueden permitir la sincronización con ciclos T claro-oscuros de un rango más amplio en comparación con los PRC de baja amplitud. La magnitud del cambio de fase por la luz depende de la intensidad y duración del estímulo (entre otros factores). A medida que aumenta la intensidad y / o la duración, los PRC ligeros de los marcapasos de ciclo límite pasan por dos transiciones. Como se mencionó anteriormente, el cambio de fase primero cambia del reinicio de Tipo 1 al Tipo 0 (Figs. 1A, 1D), por lo que la magnitud del cambio de fase aumenta, pero el tiempo circadiano de la transición entre los cambios de retraso y avance permanece fijo. Hay varios buenos ejemplos de este tipo de transición PRC (Tipo 1 a Tipo 0) con una fuerza de estímulo creciente: Chlamydomonas (A / Cr-1-4), Euglena (A / Eg-3,4,7), Kalanchoe (D / Kb-1-11), Leucophaea (F / Lm-6-10), Culex (F / Cq-1-2), Nauphoeta (F / Nc-1-2), Sarcophaga (F / Sa-13), Drosophila (52) y Rattus (H / Re-1-3).

A medida que la duración (y posiblemente la intensidad) del pulso de luz aumenta aún más, se produce la segunda transición: el tiempo circadiano del punto de ruptura comienza a desplazarse a tiempos anteriores (Fig. 2). Esta segunda transición se ha interpretado como el reloj "parando" en ct 12 hasta que finaliza el pulso de luz, pero otros datos sugieren que el reloj continúa oscilando durante el pulso de luz en otro ciclo límite que está cerca de una isócrona de ct 12 del ciclo límite en DD (51). En consecuencia, el reloj siempre vuelve al ciclo límite original en ct 12 al final del pulso de luz. Existen menos ejemplos del segundo tipo de transición PRC (es decir, cambio de punto de ruptura) para PRC ligeros; los mejores son Drosophila (52) y Sarcophaga (F / Sa-1-11, Fig.2).

Además de los cambios de la forma PRC mencionados en el párrafo anterior, Page ha descubierto recientemente la plasticidad del desarrollo de ty la forma PRC (49, 50). Page ha descubierto que la crianza de larvas de cucarachas en varios regímenes de iluminación (LD, LL, DD y ciclos T) transforma los PRC ligeros de las cucarachas maduras, es decir, los PRC resultantes se convierten en PRC en su mayoría de avance, en su mayoría en retraso o simétricos. dependiendo de las condiciones de desarrollo (F / Lm-1-5, Fig. 3). Este resultado inesperado demuestra que los PRC no son inmutables desde el punto de vista del desarrollo.

El arrastre estable no requiere necesariamente un PRC que tenga esencialmente la misma topología simétrica de avance frente a retardo que los PRC representados en las Figs. 1A y 1D. De hecho, para que ocurra el arrastre, el PRC de un oscilador circadiano solo necesita tener (1) una región de pendiente negativa que sea mayor que -2, y (2) un punto en el PRC donde el cambio de fase es igual a t -T. En particular, no es necesario tener un PRC con retrasos y avances. Si el período de funcionamiento libre es superior a 24 horas, un PRC que exhibe solo un restablecimiento avanzado permitirá un arrastre estable (este sería un ejemplo de un PRC altamente asimétrico). Un ejemplo específico son las células Gonyaulax bajo iluminación de luz roja (Fig. 1G, A / Gp-5): el período es de 25 horas y el PRC para pulsos de luz azul o blanca es esencialmente todos los avances (hasta 12 horas de avance). En este caso, Gonyaulax entrará en un ciclo de luz / oscuridad (o ciclo de luz blanca / roja) y el inicio del pulso de luz (amanecer) se producirá en ese momento circadiano, lo que dará como resultado un avance de fase de una hora (33). Por lo tanto, los PRC altamente asimétricos pueden permitir un arrastre estable.

Restablecimiento del pulso oscuro
El estímulo aparentemente opuesto de los pulsos de luz es dar pulsos oscuros a los organismos en LL (Fig. 4). El modelo más simplista predeciría que los PRC de pulso oscuro serán la imagen especular de los PRC de pulso de luz, lo cual es casi cierto en Paramecium (Fig. 4). Aunque esta es una descripción aproximadamente válida de algunos reajustes de impulsos oscuros, los PRC de impulsos oscuros a veces no son la imagen especular exacta de los PRC de impulsos de luz. Un motivo para explicar por qué los dos tipos de PRC pueden no ser imágenes especulares es que el estímulo de pulso oscuro en la mayoría de PRC es a menudo más largo que el estímulo de pulso de luz correspondiente. El Atlas de PRC incluye PRC de pulso oscuro para Acetabularia, Euglena, Gonyaulax, Paramecium, Lemna, pineals de pollo, hámsteres, gorriones y murciélagos (Taphozous).

Reebs y Mrosovsky (60) descubrieron un "artefacto" interesante en los hámsteres con respecto a los pulsos oscuros y los pulsos de algunas drogas. Notaron que los pulsos oscuros y algunos medicamentos antidepresivos (por ejemplo, la benzodiazepina triazolam) estimulan la actividad de correr sobre ruedas en los hámsteres. Posteriormente probaron si la estimulación de la actividad locomotora imitaría por sí sola la acción de cambio de fase de los pulsos oscuros. ¡Lo hizo! Además, van Reeth y Turek (71) encontraron que la estimulación de la actividad también era el medio por el cual se lograba el cambio de fase por el triazolam. Por lo tanto, en los hámsteres, los pulsos oscuros parecen reiniciarse por la retroalimentación del ritmo manifiesto en el marcapasos. Será interesante encontrar otros ejemplos de retroalimentación de ritmos abiertos en marcapasos.

Restablecimiento del pulso de temperatura
Los PRC de pulso de temperatura se han medido en una variedad de organismos, los incluidos en la prueba Atlas, la respuesta del reloj en Euglena, Gonyaulax, Oedogonium, Neurospora, Bryophyllum, Kalanchoe, Lemna, Phaseolus, Hemideina, Leucophaea, Uca, Perognathus y hámsters (en este caso final, pulsos de hipotermia). Aunque la temperatura indudablemente puede funcionar como un zeitgeber, aparentemente juega un papel de apoyo al ciclo de luz / oscuridad. En estudios de arrastre de ciclos conflictivos de luz y temperatura, el ciclo de luz / oscuridad predomina en Euglena (5), Drosophila, cucarachas (52) y Pectinophora (57). En estos estudios no se realizaron comparaciones de las amplitudes de los PRC de luz frente a temperatura. Sería interesante repetir este tipo de experimentos utilizando estímulos de luz y temperatura que provocan PRC de amplitud equivalente, y luego determinar si todavía predomina la luz.

Estrategias ecológicas de forma PRC
El caso de los PRC de pulso de luz que son asimétricos es especialmente interesante desde una perspectiva ecológica.Estos son PRC que exhiben tanto retrasos como avances, pero en los que predomina el área bajo el avance o la porción de retraso del PRC (a lo que se hace referencia a continuación como la relación entre el área de avance y el área de retraso, o A / D). La figura 5 ilustra PRC con varias formas A / D. Pittendrigh y Daan (53, 55, 56) han señalado que una combinación apropiada de valores de tau y formas de PRC asimétricas puede dar un arrastre estable de marcapasos a varios fotoperíodos, de modo que la fr del oscilador siempre se producirá en un ángulo de fase dado hasta el amanecer. o anochecer de los diversos ciclos de luz / oscuridad. Este ángulo de fase será independiente de la duración del fotoperiodo, por lo que se compensa por los cambios estacionales en el fotoperiodo. Por ejemplo, una tau de menos de 24 horas en combinación con un PRC que tiene relativamente más área de retraso que área de avance (= pequeña A / D) permitirá que ct 12 del ciclo del marcapasos coincida con el anochecer en los ciclos de luz / oscuridad que tienen una variedad de longitudes de día ecológicamente relevantes (por ejemplo, fotoperíodos de 6 a 18 horas). Ésta es una estrategia que puede adaptarse a un animal nocturno (por ejemplo, un ratón). El ejemplo inverso - tau largo y PRC de gran avance / retardo - produce un oscilador cuya fase ct 0 coincidirá con el amanecer independientemente de la duración del fotoperiodo - por lo tanto, una estrategia óptima para un organismo que está activo durante el día (53, 55, 56).

La idea de Pittendrigh y Daan asume que el crepúsculo es más importante que el amanecer para los organismos activos durante la noche, y que el amanecer es más importante para los organismos activos durante el día. Obviamente, esta es una simplificación de la ecología de la conservación. El punto crucial es si la ecología del organismo exige un ajuste del reloj al amanecer frente al anochecer, no si el organismo está activo de día o de noche. Por ejemplo, uno podría imaginar un roedor nocturno que se activa en una fase indeterminada en algún momento en medio de la noche, pero debe regresar a su madriguera antes del amanecer para escapar de la depredación. Para este roedor hipotético, un PRC A / D grande y una t larga podrían ser el sistema de reloj óptimo. Por el contrario, cuando un ángulo de fase constante al anochecer es adaptativo, un A / D pequeño y una t corta serían un buen diseño de reloj (una estrategia común para los roedores nocturnos).

Otra pregunta acerca de los organismos que exhiben múltiples ritmos controlados por un (presumiblemente) un solo marcapasos es: ¿qué fase del ritmo es más importante conservar? Una célula de Gonyaulax tiene ritmos de fotosíntesis que alcanzan su punto máximo durante el día y de bioluminiscencia que alcanzan su punto máximo durante la noche. La estrategia y la selección de la celda puede depender del ángulo de fase del ritmo que sea más importante. Como su marcapasos tiene una T larga y una PRC A / D grande, Gonyaulax parece conservar su relación de fase hasta el amanecer (33).

Un tema diferente, pero relacionado, es si el organismo está expuesto al fotoperíodo completo durante el día en condiciones naturales. (Este criterio de "exposición a la luz diurna" no es lo mismo que "actividad diurna"; por ejemplo, los depredadores nocturnos como los gatos pueden "ver" el fotoperiodo completo durante el día, pero cazan de noche). está expuesto a un fotoperiodo más o menos completo (PP c) es importante desde la perspectiva del arrastre. Podríamos suponer que los relojes que están expuestos a un fotoperíodo completo (PP c) podrían depender de un "arrastre continuo (paramétrico)" en lugar de un "arrastre discreto (no paramétrico)" (55). Además, los relojes expuestos al fotoperíodo completo podrían permitirse el lujo de ser menos sensibles a la luz que los relojes que solo ven breves pulsos de luz al amanecer y / o al anochecer. Estas diferencias en la exposición al fotoperíodo podrían estar correlacionadas con las diferencias en la forma de la PRC (A / D), t y la sensibilidad.

Para determinar si la forma, t, y la sensibilidad de los PRC están correlacionados con los patrones de exposición y / o actividad de PP c, la información de los PRC ligeros en el Atlas se ha destilado en las Tablas 1, 2 y 3. La primera conclusión que es obvia a partir de La Tabla 1 indica que es imposible sacar ninguna conclusión acerca de las sensibilidades relativas entre los relojes "expuestos a PP c" y "no expuestos a PP c". Ya sea que se defina "sensibilidad" sobre la base de (1) intensidad umbral, (2) duración umbral y / o (3) amplitud de PRC, pocos PRC pueden compararse directamente.

Se han utilizado muchas intensidades y duraciones de luz diferentes (columna de "estímulo") y se han realizado pocos intentos para establecer sensibilidades de umbral. Aunque muchos de los estudios sobre organismos "expuestos a PP c" utilizaron pulsos de luz de larga duración y / o alta intensidad, lo que sugiere baja sensibilidad, algunos de los relojes más sensibles están "expuestos a PP c" (p. Ej., Neurospora, Samanea) .

Además, el PRC puede ser "dependiente de la historia", como se muestra para la respuesta de hámsteres y gorriones al fotoperiodo previo y ciclos T (p. Ej., H / Ma-6-13 H / Pd-2-4), y para las cucarachas. después del crecimiento larvario en varios ciclos T (Fig. 3, F / Lm-1-5). Debido a que estos estudios han utilizado condiciones ampliamente variables de duración y / o intensidad del pulso de luz, actualmente es imposible comparar la sensibilidad a la luz de los osciladores en organismos "expuestos a PP c" y "no expuestos a PP c".

Las tablas 2 y 3 resumen los datos de la tabla 1 desde la perspectiva de los patrones de actividad y la exposición al PPc. La Tabla 2 muestra las correlaciones entre la forma PRC, t, y los patrones de actividad en animales. La predicción de Pittendrigh de que los animales nocturnos podrían preferir A / D & lt 1 y t & lt 24 está débilmente respaldada por los datos. La predicción de que los animales de actividad diurna podrían preferir A / D> 1 yt> 24 no está respaldada por los datos; no hay correlaciones significativas entre la forma de PRC yt son obvias para los animales de actividad diurna. Los datos de los animales crepusculares son demasiado escasos para sacar conclusiones.

La Tabla 3 resume la forma de PRC y los datos t para todos los organismos representativos sobre la base de la exposición a PP c. Los organismos expuestos a PP c exhiben formas A / D de todo tipo, con PRC ligeramente más simétricas. Los organismos expuestos a PPc parecen evitar valores de t cercanos a las 24 horas. Los organismos no expuestos a PP c favorecen los PRC A / D & lt1 y Tipo 1. Cuando los datos de la Tabla 3 se vuelven a analizar sobre la base de plantas frente a animales o si el PRC se midió con iluminación de fondo (DD frente a LL), no surgen nuevas correlaciones. (Tenga en cuenta, sin embargo, que el análisis extenso de Aschoff de t frente a la intensidad de LL indica diferencias significativas para esta respuesta entre los organismos "activos durante el día" y los "activos durante la noche"; consulte la referencia 2. Desafortunadamente, la forma de la PRC no se conoce para la mayoría de esos organismos). Los datos de la Tabla 3 demuestran que pueden existir algunas correlaciones entre la forma de la RPC y la exposición al fotoperíodo.

Los datos discutidos anteriormente pueden provocar una revisión de nuestros conceptos de mecanismo de arrastre. Nuestros modelos de arrastre actuales explican con éxito el mecanismo de arrastre discreto de los relojes no expuestos a PP c. Es en estos casos que los PRC para señales luminosas breves nos han ayudado a comprender el arrastre. Pero los organismos que están expuestos a un fotoperíodo completo se encuentran en una situación bastante diferente, que los PRC no modelan bien para estímulos breves. En particular, la luz puede cambiar t durante un fotoperiodo completo (9, 55), no se produce el salto y (56) y el reloj puede permitirse ser mucho menos sensible a la luz.

Pittendrigh (55) ha analizado los posibles mecanismos de arrastre "continuo" en los organismos expuestos a PP c, pero este (los) mecanismo (s) sigue siendo un campo fértil para ser cultivado en futuras investigaciones, tanto por modelado como por experimentación directa. En particular, el modelado de ciclo límite de arrastre continuo indudablemente conducirá a nuevos conocimientos (51). Además, algunas preguntas experimentales que podrían abordarse en este contexto incluyen:

(1) Compare el umbral de sensibilidad (intensidad y / o duración, pero especialmente la intensidad) entre organismos expuestos a PP c y no expuestos a PP c (hasta ahora, solo se ha medido cuidadosamente el umbral de sensibilidad del hámster - ver ref.67) .

(2) Prueba de reciprocidad de intensidad / duración para organismos expuestos a PP c frente a organismos no expuestos a PP c. Hasta ahora, la reciprocidad solo se ha probado en hámsters (67) y Chlamydomonas (42).

(3) Mida el PRC para pulsos de luz largos (8-16 horas) como el mejor indicador para predecir las propiedades de arrastre de los organismos expuestos al PP c.

(4) Pruebe qué aspecto de un ciclo de LD se utiliza como zeitgeber en organismos expuestos a PP c - versus no PP c -. Por ejemplo, ¿cómo responde el reloj a los cambios graduales de intensidad de la luz en el crepúsculo? En plantas que utilizan fitocromo como fotorreceptor de reloj, puede ser el cambio de R: FR al amanecer y al anochecer lo que es el zeitgeber más importante. Además, ¿se puede predecir el cambio de fase mediante pulsos de luz de los cambios de fase provocados por los pasos-LL a DD, o DD a LL?

(5) ¿Cómo modifica el comportamiento la exposición del organismo a la luz y, por lo tanto, modula el arrastre? DeCoursey (10) ha demostrado que el comportamiento puede ser un componente crucial del arrastre en roedores nocturnos. Contrastar los componentes conductuales del arrastre en organismos expuestos a PP c frente a organismos no expuestos a PP c podría resultar esclarecedor.

Obviamente, quedan por abordar muchas cuestiones interesantes sobre el arrastre.

(B) Vías de fototransducción

Fotopigmentos implicados en la restauración del pulso de luz
Aparentemente, el reloj circadiano se vinculó temprano en su evolución con (o tuvo como componente) un proceso fotosensible que permitió la sincronización del reloj con el ciclo de luz / oscuridad del sol. Podría suponerse que este vínculo podría conducir a pistas valiosas sobre la conservación o diversidad del mecanismo bioquímico del oscilador si el marcapasos circadiano se originó una vez durante la evolución y su mecanismo se conservó posteriormente, entonces un escenario predeciría que los pigmentos involucrados en también podría conservarse el proceso fotosensible.

Desafortunadamente, esto claramente no es cierto. Los espectros de acción que se describen a continuación muestran que los fotopigmentos del reloj en varios organismos son bastante diferentes entre sí. Esto significa (a) que un mecanismo de reloj conservado ha cambiado su fotopigmento varias veces durante la evolución (aún podrían conservarse pasos más proximales en la vía de fototransducción), o (b) si la conexión entre el mecanismo del reloj y el fotopigmento se ha conservado durante la evolución, el reloj debe haberse originado independientemente muchas veces y, por lo tanto, los mecanismos bioquímicos de los relojes en varios organismos podrían ser bastante diferentes.

Un primer paso para caracterizar la vía de la fototransducción es identificar el fotopigmento del reloj. En la práctica, identificar un fotopigmento requiere medir alguna característica específica del fotopigmento y compararlo con las características de los fotopigmentos conocidos. Por lo general, esto implica espectroscopia de acción.

La espectroscopia de acción es dosimetría con luz. Para medir un espectro de acción, se mide la fotorrespuesta (en este caso, el cambio de fase) en diferentes longitudes de onda. Para cada longitud de onda, se usa un rango de fluencias ("fluencia" es el número de fotones por unidad de área, "tasa de fluencia" es fluencia por unidad de tiempo, y es equivalente al término menos preciso "intensidad"). En el caso ideal, donde se mantiene la "univariancia", la pendiente de la curva de respuesta de fluencia (graficada como cambio de fase vs fluencia logarítmica) es la misma para cada longitud de onda, y la sensibilidad en cada longitud de onda se evalúa como la fluencia necesaria para lograr una dada una fotorrespuesta arbitraria. Por otro lado, si la forma o linealidad de la respuesta de fluencia es diferente en varias longitudes de onda, puede significar que un pigmento de cribado está interfiriendo con la respuesta espectral.

Está más allá del alcance de este artículo (ver ref. 19 para una revisión de la espectroscopia de acción) entrar en mayor detalle sobre la espectroscopia de acción general. Pero es necesario abordar un problema específico sobre los espectros de acción para restablecer los osciladores de ciclo límite. Para el restablecimiento de Tipo 1, la curva de restablecimiento no cruza la singularidad (Fig. 1C), por lo que la respuesta de fluencia debe coincidir con la de un caso univariante ideal. Este es de hecho el resultado obtenido por Takahashi et al. (67) para restablecer la fase del reloj del hámster.

Sin embargo, para el restablecimiento de tipo 0, la respuesta esperada puede ser bastante diferente incluso con un fotorreceptor univariante ideal. En la (s) fase (s) donde los pulsos de luz producen un reinicio de fase máximo, el aumento de la fluencia del pulso puede hacer que el reloj se reinicie en regiones cercanas o más allá de la singularidad. Esto puede provocar una discontinuidad en la curva de respuesta de fluencia. Este tipo de respuesta a fluencias variables se ha observado en Gonyaulax (33), Neurospora (Fig. 32 en la ref. 11) y Chlamydomonas (35). Estas curvas de respuesta de fluencia discontinua recuerdan la respuesta a la dosis del reloj de Gonyaulax a la anisomicina, que es otro caso de comportamiento singular (70).

Una curva de respuesta de fluencia discontinua significa que algún proceso "aguas abajo" de la absorción de luz del fotopigmento está convirtiendo la respuesta fotoquímica inicialmente continua en una respuesta biológica discontinua. En el caso de los fotorreceptores de reloj, es la organización de ciclo límite del oscilador circadiano la responsable de convertir la respuesta inicialmente monótona en una respuesta discontinua a medida que el pulso de luz mueve el marcapasos más allá de la región singular.

Entonces, ¿cómo debería medirse la sensibilidad espectral de los fotorreceptores de reloj? Las siguientes tres tácticas deberían ser procedimientos válidos para construir espectros de acción precisos para fotopigmentos de reloj (ver ref. 35 para más discusión y ejemplos experimentales). La primera táctica es usar fluencias y / o duraciones que provoquen solo un reinicio de Tipo 1 (para un ejemplo reciente, consulte la referencia 67). En este caso, la respuesta crítica se define como un "porcentaje de respuesta" arbitrario a lo largo de una curva de respuesta de fluencia continua. Si el experimento requiere un restablecimiento de tipo 0, la segunda táctica es medir el espectro de acción en una fase circadiana que no está cerca del "punto de ruptura" del PRC. Si se hace esto, la probabilidad de que el marcapasos se mueva a través de la singularidad se reduce y, por lo tanto, la respuesta de fluencia probablemente será continua. Como en la primera táctica, el experimentador seleccionará la respuesta crítica como un "porcentaje de respuesta" arbitrario. Finalmente, en el caso del reinicio de Tipo 0, se puede trazar en la ordenada del espectro de acción la fluencia en la que se produce un comportamiento singular (es decir, arritmicidad o una discontinuidad en la curva de respuesta de fluencia). Esta tercera táctica depende de que el propio marcapasos establezca un umbral crítico a partir del cual se deriva el espectro de acción en lugar de que el experimentador seleccione un nivel de "respuesta porcentual" de una función continua (35).

La fotobiología de los fotorreceptores de reloj se resume en las Tablas 4 y 5. La mayoría de estos estudios se realizaron antes de que se apreciaran por completo las complicaciones del restablecimiento del tipo 0. Por ejemplo, varios de los espectros de acción enumerados en la Tabla 4 usan solo una única fluencia de luz para cada longitud de onda (un espectro de acción de "igual intensidad") en lugar del rango de fluencias requerido para la espectroscopia de acción adecuada. Esto significa que no se probó ni la univariancia ni la continuidad de la respuesta de fluencia. Por lo tanto, las conclusiones de estos estudios pueden verse comprometidas por artefactos. Esta crítica es cierta para los estudios de Coleus, Kalanchoe y Bryophyllum (posiblemente también Paramecium). En el caso de Gonyaulax, solo se verificaron dos fluencias, por lo que este espectro de acción también puede haber sido comprometido por este problema.

El restablecimiento inducido por la luz en Chlamydomonas exhibe una característica notable: ¡los espectros de acción para las células en DD frente a LL son diferentes! Los relojes de las células en LL responden a la luz roja y azul y los inhibidores fotosintéticos evitan el restablecimiento de fase inducido por la luz (34). Por lo tanto, los componentes de la fotosíntesis parecen mediar en el reajuste del reloj de las células en LL. Por otro lado, la luz verde y roja reinicia el reloj en DD y los inhibidores fotosintéticos son ineficaces (42). Se desconoce la identidad de este fotorreceptor. La sensibilidad de los dos fotosistemas también es muy diferente: las células en DD responden a 1/2000 de la fluencia necesaria para restablecer las células en LL.

Si bien la identificación de la mayoría de los fotopigmentos requiere que se midan espectros de acción en todo el rango visible de longitudes de onda, un fotopigmento es excepcional: el fitocromo, un fotopigmento común en las plantas, se caracteriza por la absorción del rojo (aproximadamente 660 nm) y cuya fotorrespuesta se invierte con la iluminación posterior. con luz roja lejana (aproximadamente 730 nm). (El fitocromo también puede exhibir la llamada "respuesta de alta irradiancia", o HIR, que no se revierte con la luz roja lejana, pero de hecho se potencia mediante la irradiancia simultánea con luz roja y roja lejana). Para una respuesta fitocromática simple ( no HIR), la reversibilidad a rojo lejano se considera generalmente un diagnóstico suficiente y, a menudo, no se realiza un espectro de acción completo. En la Tabla 5 se muestran ejemplos de reajuste del reloj circadiano en los que está implícito el fitocromo.

Tanto en Gonyaulax (A / Gp-8) como en Paramecium (A / Pb-1,2), los pulsos breves de luz ultravioleta pueden causar un cambio de fase significativo. Las células responden de manera diferente a la luz ultravioleta que a la luz visible: (1) la magnitud del cambio de fase no depende mucho de la fase, y (2) los cambios son todos avances (Gonyaulax) o todos los retrasos (Paramecium). El restablecimiento de fase por luz ultravioleta (UV-C) puede no ser relevante para el arrastre en un entorno natural, pero puede implicar algo sobre el mecanismo bioquímico de los osciladores circadianos.

Hasta el momento, la identificación de algunos de estos fotopigmentos de reloj no es concluyente. Sin embargo, está claro que no todos los marcapasos circadianos utilizan un fotopigmento único. Algunas plantas verdes usan un fitocromo, mientras que algunos animales usan una rodopsina. Se justifican más estudios de este tipo. (Ver ref.47 para una discusión más completa, pero desactualizada, de los fotorreceptores de reloj).

También puede valer la pena probar la reciprocidad de la intensidad frente a la duración de los fotorreceptores de reloj. Así como los fotorreceptores "HIR" muestran características de reciprocidad bastante diferentes a las del fitocromo que actúa en su modo clásico rojo / rojo lejano, los fotorreceptores de reloj también pueden exhibir características que no se encuentran en otros sistemas fotorreceptores. Por ejemplo, Takahashi et al. (67) encontraron una reciprocidad inusualmente larga (para la rodopsina) en la respuesta de cambio de fase de los hámsteres nocturnos. Lógicamente, "tiene sentido" que un fotopigmento de reloj integre señales de luz durante períodos prolongados, pero rara vez se han realizado estudios cuantitativos de reciprocidad en el campo de los relojes. La reciprocidad también debe probarse en organismos expuestos a PPc, que podrían ignorar la reciprocidad; tal vez estos organismos presten atención a la duración del pulso de luz en lugar del número total de fotones absorbidos.

Caracterización de las vías de fototransducción: se han utilizado PRC químicos / farmacológicos para rastrear la vía de información de cambio de fase desde algún tipo de receptor (por ejemplo, fotorreceptor) hasta el mecanismo de relojería. Este enfoque ha sido defendido por Eskin (14). Por ejemplo, Eskin ha demostrado que el reloj del ojo de Aplysia responde a los aumentos de GMP cíclico de la misma manera que lo hace a la luz (E / Ac-1,14), lo que sugiere que, como en la transducción de luz dentro de los vertebrados ojo - GMP cíclico media el efecto de la transducción de luz dentro del fotorreceptor de este reloj (16).Este restablecimiento inducido por cGMP puede estar mediado por la síntesis de nuevas proteínas (59). Además, Eskin ha descubierto que el neurotransmisor serotonina provoca un cambio de fase dentro de este ojo (E / Ac-11), y este efecto parece estar mediado por aumentos de la concentración intracelular de AMP cíclico porque, además de otras pruebas, el activador de adenilato ciclasa forskolina provoca un PRC que es el mismo que el de la serotonina (E / Ac-13 ref. 15).

Johnson y Nakashima (32) utilizaron un enfoque similar para estudiar el restablecimiento de fase inducido por la luz en Neurospora. Descubrimos que la inhibición de la síntesis de proteínas evitaba los cambios de fase inducidos por la luz de una manera dependiente de la dosis. Como control, mostramos que el cambio de fase por luz no fue inhibido por el fármaco en mutantes cuyo mecanismo de síntesis de proteínas era resistente al fármaco.

Estos estudios ejemplifican algunas de las formas en que los PRC para estímulos químicos / farmacológicos pueden usarse para estudiar la transducción de información de cambio de fase (ya sea por luz u otros estímulos). En el caso de tratamientos de bloqueo que no causan por sí mismos un reinicio de fase, la interpretación de los resultados es relativamente sencilla: si el tratamiento de bloqueo inhibe el cambio de fase por el estímulo probado, entonces el proceso afectado por el tratamiento de bloqueo puede estar involucrado en la transducción / transmisión del estímulo probado. Sin embargo, el enfoque de usar sustancias químicas / medicamentos para bloquear el cambio de fase por otro estímulo puede ser difícil de interpretar si el tratamiento de bloqueo también provoca el reinicio de fase. Estas complicaciones se discuten en otra parte (32).

Influencias espectrales en la expresión del ritmo y tau: en algunas plantas, la estimulación frecuente de fitocromos parece ser necesaria para la persistencia de la ritmicidad circadiana. Esto se ha observado en Albizzia (64), Lemna (39, 40) y en el tabaco transgénico (37). En otras dos plantas, se ha encontrado que la luz roja frente a la azul afecta de manera diferencial a tau: en coleus 'rojo LL acorta t, mientras que azul LL alarga t (23) en Gonyaulax, el fenómeno se invierte: rojo LL alarga t, mientras que azul LL acorta t (62). Se ha interpretado que estos resultados sugieren que dos fotopigmentos están acoplados a los marcapasos circadianos en estos organismos.

(C) PRC como sondas para el mecanismo del reloj: reajuste químico / farmacológico

Los estímulos químicos también se han probado exhaustivamente para determinar la acción de restablecimiento de fase. Los primeros estudios (por ejemplo, ref. 25) sugirieron que el reloj circadiano era relativamente resistente a las drogas y los productos químicos, pero ahora se han descubierto muchos tratamientos farmacológicos que reinician el reloj.

En general, la motivación para estudiar la respuesta de fase de los marcapasos circadianos a los estímulos de luz o temperatura ha sido comprender cómo se logra la sincronización del marcapasos con el día solar. El motivo para estudiar la respuesta del marcapasos a sustancias químicas y fármacos es diferente. La esperanza es descubrir el mecanismo bioquímico del marcapasos evaluando su sensibilidad farmacológica. El impacto de los productos químicos sobre el marcapasos se ha evaluado por su efecto tanto en el período como en la fase.

¿Qué pueden decirnos los PRC químicos / farmacológicos sobre el marcapasos? Los PRC para pulsos de sustancias químicas / medicamentos generalmente se interpretan en el sentido de que los supuestos objetivos bioquímicos afectados por la sustancia química son una variable de estado o un parámetro de estado del marcapasos. En la discusión que sigue, discutiré el reajuste del reloj inducido por sustancias químicas en el contexto de los cambios de las variables de estado. En un oscilador muy simple compuesto solo por un único componente bioquímico con dos variables de estado (por ejemplo, concentración y tasa de cambio de concentración), las sustancias químicas que aumentan o disminuyen el nivel del componente deben evocar PRC que están separados 180 'y deben tener un valor predecible. relación de fase a la fase de la oscilación del componente (ver ref. 61 para un ejemplo).

La situación es considerablemente más complicada para un oscilador que se compone de múltiples componentes con múltiples variables de estado, lo que probablemente resulte cierto para los osciladores circadianos. Para osciladores multidimensionales, los PRC para la perturbación de las variables de estado no pueden predecirse mediante la oscilación de una sola variable de estado. ¿Se pueden seguir utilizando los PRC para probar si las entidades bioquímicas son posibles variables de estado? Sí, pero la predicción precisa de la forma PRC depende del modelado de todas o la mayoría de las variables de estado y parámetros específicos en el oscilador y las interacciones entre estos componentes. En ausencia de un modelo tan específico, la única predicción irrefutable que se puede hacer es que la perturbación del nivel de una variable de estado debería provocar un reajuste de fase. La forma o el ángulo de fase del PRC resultante no es diagnóstico en ausencia de un modelo multicomponente específico. (Ver ref. 22 para un intento de usar PRCs químicos / farmacológicos para distinguir las manos de las variables / parámetros de estado y para construir un modelo del mecanismo del marcapasos).

Si esto es cierto, ¿tiene algún valor medir los PRC completos para medicamentos / productos químicos? ¿La medición de la capacidad de respuesta de fase en fases a lo largo del ciclo circadiano nos dice algo más que datos de un punto de una sola fase? Creo que la respuesta es sí, por varias razones. Primero, observar los cambios de fase en varias fases nos asegura que el resultado no es un artefacto. En segundo lugar, conocer la capacidad de respuesta de la fase a lo largo del ciclo será útil para el modelado posterior del marcapasos o para diseñar experimentos futuros. Finalmente, la capacidad de respuesta debe medirse en muchas fases para detectar discontinuidades o para distinguir el tipo 1 del tipo 0; sin duda, el restablecimiento de esta información será crucial cuando llegue el momento de modelar la bioquímica del marcapasos.

Además, tenga en cuenta que las variables de estado de un oscilador de ciclo límite pueden cambiarse mediante estímulos de reinicio de fase, incluso si los estímulos se presentan en fases de la "zona muerta". Como se discutió anteriormente en este artículo, el marcapasos no es necesariamente insensible a los estímulos de reinicio presentados durante la zona muerta; las variables de estado se pueden cambiar en estas fases, pero este cambio no mueve el marcapasos a una isócrona diferente. Este fenómeno es relevante para los métodos de prueba de si una sustancia bioquímica específica es una variable de estado: los estímulos de reinicio de fase presentados durante las fases de la zona muerta pueden modificar las variables de estado, aunque no se provoque ningún cambio de fase.

Tendencias en los PRC químicos / farmacológicos: ¿Los diferentes organismos muestran respuestas similares a los tratamientos farmacológicos? Si es así, ¿sugeriría que el mecanismo bioquímico del marcapasos se ha conservado durante la evolución? No necesariamente. Por ejemplo, se ha invocado el hecho de que el óxido de deuterio alargue el período circadiano de tantos organismos diferentes para sugerir que se ha conservado la bioquímica del reloj. Desafortunadamente, sin embargo, la acción del óxido de deuterio es tan inespecífica y sus efectos retardadores sobre los procesos biológicos son tan universales que estos datos no han sido útiles para desentrañar el mecanismo del reloj.

Otros productos químicos / medicamentos pueden ser más útiles. La clase de fármacos cuya acción de cambio de fase se ha caracterizado mejor en una variedad de organismos es la de los inhibidores de la síntesis de proteínas en los ribosomas 80S: cicloheximida, puromicina, anisomicina y estreptimidona. Estos fármacos restablecen los relojes en una amplia gama de organismos: las algas Acetabularia (A / Am-2,3) y Gonyaulax (A / Gp-13-24, ver también la Fig.10), el hongo Neurospora (C / Nc -19, 20), las angiospermas Phaseolus (D / Pc-18,19) y Lemna (D / Lg-7), el ojo del molusco Aplysia (E / Ac-15-18), células pineales de pollo (Fig. 6F ver ref.68) y hámsters (ref.29). La Fig. 6 ilustra que la mayoría de estos PRC muestran un fuerte restablecimiento de Tipo 0. Los análogos de aminoácidos también tienen potentes efectos de restablecimiento en Lemna (D / Lg-10-17 ref. 41). También se sabe que la cicloheximida alarga el período de Euglena (17) y Chlamydomonas (21), pero no se han informado PRC para estos organismos. Finalmente, es interesante notar que los inhibidores de la síntesis de proteínas en los ribosomas 70S (p. Ej., Cloranfenicol) tienen poco o ningún efecto sobre los ritmos circadianos en eucariotas. Por lo tanto, la síntesis de proteínas en ribosomas mitocondriales o de cloroplasto parece innecesaria para la precesión circadiana en células eucariotas.

Otra clase de estímulos químicos / farmacológicos que se han aplicado a varios tipos de organismos son los inhibidores del metabolismo. Una vez más, los relojes de muchos organismos se reinician mediante inhibidores metabólicos: Euglena (nitrógeno A / Eg 9), Neurospora (azida, cianuro, antimicina AC / Nc-26-28), Lemna (azida, cianuro D / Lg-8,9 ), Phaseolus (cianuro, azida D / Pc-20,21), ojos de Aplysia (cianuro, dinitrofenol, E / Ac-7,8) y Drosophila (nitrógeno F / Dp-11). Algunos de estos PRC se muestran en la Fig. 7. En general, las respuestas a los inhibidores metabólicos son más variables entre las diferentes especies que las respuestas a los inhibidores de la síntesis de proteínas.

Los fármacos que afectan al AMP cíclico (cAMP) también se han aplicado a una variedad de organismos: Euglena (teofilina A / Eg-12), Phaseolus (teofilina ref.44), Trifolium (cAMP, teofilina D / Tr-1,3), Aplysia (forskolina E / Ac-13), ratas (teofilina H / R-1) y SCN de rata in vitro (análogo de cAMP ref. 58). Cuatro de estos PRC se ilustran en la Fig.8.

Algunas otras sustancias químicas / fármacos se han probado en varios organismos, p. Ej., Fármacos que afectan (1) el Ca ++ intracelular o la calmodulina (A23187, cloropromazina, trifluoperazina, verapamilo, EGTA y teofilina, véase la figura 9), (2) potencial de membrana (K +, Li +, estrofantidina, estimulación eléctrica), u (3) otras propiedades de la membrana y flujos iónicos (ácido fusárico, el anestésico quinidina y los ionóforos valinomicina, CCCP, CCmP y A23187) pero de estos estímulos, ningún agente ha Se ha aplicado a suficientes organismos diferentes para permitir una comparación significativa.

Problemas de interpretación con el restablecimiento de sustancias químicas / medicamentos: por supuesto, existen muchas advertencias para la interpretación de las PRC de sustancias químicas / medicamentos. Lo más obvio es que se debe tener cuidado al asignar el sitio de acción del químico / fármaco. Los efectos secundarios de los tratamientos farmacológicos abundan y son conocidos por inducir a error las conclusiones de los investigadores. Se han utilizado cuatro tipos de controles como evidencia de la especificidad de la acción del fármaco. El primer control es medir la dependencia de la concentración del efecto del fármaco sobre el presunto sitio de acción (por ejemplo, síntesis de proteínas) y compararlo con la dependencia de la concentración de la eficacia de restablecimiento de fase del fármaco. Si los dos no se correlacionan estrechamente, entonces es probable que el impacto del fármaco en la fase se produzca a través de un sitio de acción diferente. La segunda forma de evaluar la posibilidad de efectos secundarios es probar mutantes cuyo presunto sitio de acción es resistente al fármaco. Si el cambio de fase se reduce concomitantemente en estos mutantes, uno puede estar más seguro de que los efectos secundarios no son responsables de la acción de restablecimiento de fase (46). El tercer método consiste en comprobar si los derivados de un fármaco que son inactivos en la presunta diana bioquímica son, no obstante, capaces de cambiar de fase el reloj, según lo probado por Jacklet (30) para los derivados del inhibidor de la síntesis de proteínas anisomicina. Finalmente, un cuarto control es probar varios medicamentos que inhiben el mismo proceso bioquímico general, pero por diferentes mecanismos. Un buen ejemplo de este control es la prueba de varios fármacos que inhiben la síntesis de proteínas en diferentes sitios: cicloheximida, anisomicina, puromicina, estreptimidona et al. (por ejemplo, A / Gp-13-24, E / Ac-15-18, ver Fig.6).

Otro problema con la aplicación de pulsos de sustancias químicas / fármacos es que el organismo puede no recuperarse rápidamente de la inhibición o estimulación (mientras que, la recuperación de pulsos de luz generalmente se considera rápida). Los momentos en los que (a) un fármaco / químico ha comenzado a afectar significativamente un proceso bioquímico específico y (b) el proceso específico se ha recuperado significativamente de los efectos del fármaco / químico pueden ser bastante diferentes de los tiempos del fármaco / químico ( a) adición y (b) lavado. Estas son consideraciones importantes al comparar PRC para diferentes fármacos / productos químicos cuya cinética de penetración / recuperación puede diferir, o incluso al comparar PRC para el mismo fármaco / producto químico en diferentes organismos cuyas características de permeabilidad pueden diferir. Si bien este problema puede parecer obvio, apenas se ha discutido en la literatura y parece poco apreciado.

La mejor solución sería medir los tiempos de penetración / recuperación para cada fármaco / químico y para cada organismo. Uno de los pocos ejemplos en los que se han realizado tales mediciones es el de la inhibición de la síntesis de proteínas por la anisomicina en Gonyaulax. En esta célula, la anisomicina inhibe significativamente la síntesis de proteínas dentro de los 5 minutos posteriores a la exposición de las células al fármaco. Pero la recuperación de la síntesis de proteínas después de la eliminación del fármaco puede requerir mucho más tiempo, dependiendo de la concentración utilizada. Hemos descubierto que la recuperación de las células de Gonyaulax a partir de la anisomicina puede requerir horas (quizás incluso días) y que esta recuperación es función de la concentración del inhibidor que se administró a las células: cuanto mayor sea la concentración, mayor será la duración efectiva de el pulso (48). Esto es significativo porque el aumento de la duración de los estímulos de cambio de fase generalmente da como resultado un aumento de la magnitud del restablecimiento de fase y, para los estímulos prolongados, a menudo cambia el tiempo circadiano del punto de ruptura del PRC.

Este efecto puede ayudar a explicar los puntos de corte cambiantes de los PRC a varias dosis de anisomicina en Gonyaulax (70). Como se muestra en la Fig.10, pulsos de una hora de anisomicina a concentraciones crecientes en las células de Gonyaulax producen una transición de Tipo 1 a Tipo 0 (Fig.10A a 10B), luego un desplazamiento progresivo del punto de ruptura hacia la izquierda (A / Gp-19 -23), o como desplazamiento del PRC hacia abajo, dependiendo de su perspectiva (70). En la Fig. 10D, se ve que el punto de ruptura ha atravesado casi un ciclo completo. Presumiblemente, las variables de estado se están empujando cada vez más hacia afuera en el plano de fase a medida que la concentración aumenta progresivamente. Los efectos de la anisomicina persisten después del lavado y la duración de esa persistencia está determinada por la dosis presentada originalmente a medida que aumenta la dosis del pulso de anisomicina, aumenta la cantidad de tiempo requerido para la recuperación completa. Por tanto, una curva de respuesta a la dosis de anisomicina en Gonyaula: r es simultáneamente una curva de respuesta a la duración. En consecuencia, los PRC para varias dosis de un fármaco / producto químico pueden mostrar resultados análogos a los de los PRC para diversas duraciones de estímulos de luz, que exhiben puntos de interrupción cambiantes si la duración del pulso de luz es lo suficientemente larga, como se mencionó anteriormente para la serie de PRC de Sarcophaga. (Figura 2).

Además, la temperatura ambiente también podría afectar la cinética de recuperación y podría explicar el cambio en la República Popular China a cicloheximida a 20 C frente a 25 C que se ha observado en Acetabularia (A / Am-2,3 ref. 4). Por lo tanto, nunca se puede estar completamente seguro de cuándo termina un pulso químico / farmacológico a menos que se mida directamente la recuperación del proceso bioquímico afectado. Es por esta razón que estoy a favor del uso del inicio del estímulo como marcador de estímulo estándar para los PRC. (En realidad, el inicio efectivo también puede ser incierto, ya que la cinética de la penetración del fármaco puede variar. Sin embargo, en general, la recuperación generalmente depende de más factores que la penetración y, por lo tanto, es probable que sea más variable).

(D) PRC como marcadores de fase para el oscilador

Los PRC se han utilizado con frecuencia para sondear la posición de fase del comportamiento rítmico subyacente del marcapasos. Esta técnica ha llevado a varios conocimientos sobre las características esenciales de la organización circadiana en organismos multicelulares. Un ejemplo es que muchos organismos multicelulares muestran ciclos "transitorios" después de un pulso de luz dado en la noche subjetiva tardía (cambio de fase avanzado), mientras que los pulsos de luz dados en la noche subjetiva temprana (cambios de fase de retraso) generalmente provocan pocos o ningún transitorio. (54). Esta observación impulsó la hipótesis de múltiples osciladores acoplados jerárquicamente dentro de organismos multicelulares: los ritmos abiertos son controlados directamente por osciladores "esclavos" (B) que están sincronizados con un oscilador circadiano "maestro" (A). Este oscilador maestro es, a su vez, arrastrado al ciclo solar por el mecanismo de reinicio reflejado por el PRC (54).

Esta hipótesis se basa en la evidencia de un tipo especial de experimento PRC, el elegante PRC de 2 pulsos, que muestra que el marcapasos se reinicia rápidamente después de un pulso de luz. Estos resultados se interpretan en el sentido de que los ciclos transitorios observados después de un desplazamiento de fase avanzado son un reflejo de la resincronización del oscilador esclavo intermedio (B), no del oscilador maestro (A) (54). En la actualidad, los ciclos transitorios después del restablecimiento de fase por la luz no se han documentado para organismos unicelulares. Esto puede significar que los ritmos en las células individuales se controlan directamente mediante marcapasos sensibles a la luz sin ningún oscilador esclavo intermedio. Se han realizado experimentos de PRC de luz de dos pulsos en Drosophila (54, 55), hámsters (H / Ma-12-13) y gorriones (3).

Además, Hobohm et al. (28) han utilizado el paradigma PRC de dos pulsos para responder a una pregunta diferente: ¿el oscilador de Gonyaulax está precesando en algunas condiciones en las que no se expresa el ritmo manifiesto? La respuesta fue "sí", como lo indican los PRC de dos pulsos que utilizan pulsos del inhibidor de la síntesis de proteínas anisomicina como estímulo.

Además de utilizar PRC químicos / farmacológicos para identificar procesos bioquímicos que actúan como variables de estado / parámetros en el mecanismo de relojería, también se han utilizado para mapear las fases del marcapasos circadiano. Esta información se puede utilizar para determinar si las mutaciones o los tratamientos farmacológicos que afectan a tau ejercen sus efectos a lo largo del ciclo o solo durante una fracción del tiempo del marcapasos. El primer uso de un PRC para este propósito fue el estudio de Daan y Pittendrigh que utilizó el PRC ligero para mapear el efecto de alargamiento de tau del óxido de deuterio a través del ciclo circadiano del ratón (ver H / Mm-1,2). Otro ejemplo ha sido determinar si el PRC se ha deformado por exposición a varios fotoperiodos o ciclos T (H / Ma-6-11, H / Pd-2-4). Más recientemente, Nakashima (45) ha usado luz, temperatura y PRCs químicos / farmacológicos para mapear las fases afectadas por mutaciones tau en Neurospora, y Kondo (41) ha usado análogos de aminoácidos como estímulos de reinicio para mapear las fases de marcapasos en la lenteja de agua. Lemna. El uso de PRC para estos diversos estímulos que tienen puntos de ruptura repartidos a lo largo del ciclo del marcapasos ha permitido a Nakashima y Kondo hacer un mapeo mucho más fino de las fases circadianas afectadas por las mutaciones de lo que hubiera permitido un solo PRC.

Sin embargo, el mapeo del marcapasos con PRCs químicos / farmacológicos puede estar plagado de problemas por la misma razón que varias concentraciones de anisomicina cambian la fase del punto de ruptura en Gonyaulax (Fig. 10). Imagine por un momento usar anisomicina para mapear el marcapasos en Gonyaulex en dos condiciones diferentes (por ejemplo, tensión, mutación, temperatura, iluminación de fondo).Si la sensibilidad de las células a la anisomicina (o la recuperación de la anisomicina) se ve alterada por las diferentes condiciones, las células pueden responder de manera diferente a la misma concentración de anisomicina. Esto significa que los relojes de las células en dos condiciones diferentes pueden estar perfectamente en fase, pero la fase de los PRC provocada por el restablecimiento de Tipo 0 por anisomicina podría ser bastante diferente. Este es un peligro potencial de usar PRC químicos / farmacológicos para mapear cualquier marcapasos. Por supuesto, la recuperación de algunos medicamentos puede ser mucho más rápida que en el caso de la anisomicina en Gonyaulax. Sin embargo, es obvio en retrospectiva que muchos productos químicos / medicamentos tendrán efectos mucho después del lavado del medicamento. Por tanto, se trata de una trampa que debe evitarse siempre que se utilice una sustancia química o un fármaco para mapear el marcapasos.

Si esto es cierto, ¿tiene algún valor medir los PRC completos para medicamentos / productos químicos? ¿La medición de la capacidad de respuesta de fase en fases a lo largo del ciclo circadiano nos dice algo más que datos de un punto de una sola fase? Creo que la respuesta es sí, por varias razones. Primero, observar los cambios de fase en varias fases nos asegura que el resultado no es un artefacto. En segundo lugar, conocer la capacidad de respuesta de la fase a lo largo del ciclo será útil para el modelado posterior del marcapasos o para diseñar experimentos futuros. Finalmente, la capacidad de respuesta debe medirse en muchas fases para detectar discontinuidades o para distinguir el tipo 1 del tipo 0; sin duda, el restablecimiento de esta información será crucial cuando llegue el momento de modelar la bioquímica del marcapasos.

¿Se puede eludir este problema? Si. En primer lugar, las concentraciones bajas de una sustancia química / fármaco que provocan solo el restablecimiento del tipo 1 deberían producir PRC que son un reflejo preciso de la fase del marcapasos. Si la magnitud mayor del restablecimiento de Tipo 0 es útil para la asignación precisa de la fase PRC, entonces la concentración utilizada debe estar justo por encima del umbral para el restablecimiento de Tipo 0 antes de que ocurra cualquier cambio de punto de interrupción. Esta transición de Tipo 1 a Tipo 0 debe medirse de forma independiente para cada condición que se considere. La conclusión final es que se debe medir el restablecimiento de fase a muchas concentraciones para garantizar que se pueda utilizar un PRC químico / farmacológico para mapear el marcapasos en condiciones de restablecimiento de Tipo 0. Estos controles han sido realizados por Nakashima en diversas publicaciones y también por Kondo (41).

(E) PRC como medidores de amplitud del oscilador

Los PRC ligeros de Nakashima a diferentes temperaturas ambientales (C / Nc-11-15) proporcionan un ejemplo de cómo reinterpretar los datos de PRC en términos de ciclos límite puede ser interesante. Los datos, representados en las Figs. 11A, B, C, muestra que la amplitud del PRC a la luz disminuye a medida que aumenta la temperatura ambiente. Esto podría significar simplemente que el mecanismo de fototransducción se vuelve menos eficiente a temperaturas más altas. Por otro lado, si se supone que los pulsos de luz mueven las variables de estado la misma distancia a todas las temperaturas, surge un modelo más interesante. Lakin-Thomas y col. (43) planteó la hipótesis de que estos datos indican que la amplitud (= diámetro) del ciclo límite puede aumentar a medida que aumenta la temperatura. Por lo tanto, la misma fuerza del estímulo puede provocar el restablecimiento de Tipo 1 a alta temperatura (ciclo límite de diámetro grande) o el restablecimiento de Tipo 0 a temperatura más baja (ciclo límite de diámetro menor) (mostrado en la Fig. 11D). Después de proponer esta interesante idea de reajuste de amplitud, LakinThomas et al. (43) amplían su modelo para sugerir que los cambios en la amplitud de los ciclos límite también pueden explicar los cambios de período de los mutantes, donde la circunferencia del ciclo límite es proporcional a tau.

Pero creo que la idea de cambios de amplitud es aún más interesante si se plantea la hipótesis de que tau no cambia a medida que cambia la amplitud del ciclo límite. De hecho, tal suposición permite un modelo de ciclo límite de compensación de temperatura de tau. Si la amplitud del ciclo límite es mayor a temperaturas más altas, entonces los parámetros de estado se pueden especificar de modo que la velocidad angular (tau) sea la misma en diferentes amplitudes del ciclo límite. Si la velocidad angular se conserva a diferentes temperaturas, entonces la velocidad lineal a lo largo de la circunferencia debe ser más rápida a una temperatura más alta (= circunferencia más grande). En ese caso, las reacciones bioquímicas que modulan las variables de estado pueden depender de la temperatura, como lo indica la circunferencia más grande a una temperatura más alta. Por la propia naturaleza del ciclo inherente a un ciclo límite, las reacciones dependientes de la temperatura (la velocidad lineal aumenta con la temperatura) pueden convertirse en ritmos independientes de la temperatura (velocidad angular = tau que no cambia con la temperatura) si la amplitud del ciclo límite aumenta a medida que la temperatura aumenta.

Además de los PRC ligeros de Nakashima a diferentes temperaturas, hemos observado una dependencia de la temperatura similar utilizando pulsos de inhibidores de la síntesis de proteínas como estímulos (4). Desafortunadamente, la dependencia de la temperatura del restablecimiento de fase inducido por la luz no se ha observado universalmente. Pittendrigh no encontró que los PRC ligeros de Drosophila fueran dependientes de la temperatura (F / Dp-2,7,9,10). Sin embargo, los PRC de Drosophila se midieron con un estímulo de luz saturante, que podría ser tan grande que no detectaría cambios significativos en la amplitud del ciclo límite. En Chlamydomonas, he medido PRC con fluencia de luz sub-saturada a 18 ° C y 25 ° C, y todavía no he detectado diferencias significativas (observaciones no publicadas). En la actualidad, esta intrigante hipótesis necesita más pruebas.

En este artículo, he analizado qué son los PRC, cómo se pueden medir y mi opinión sobre cómo se deben graficar. También he mencionado por qué trazar los datos de restablecimiento de fase en un formato PTC también es ventajoso en algunas circunstancias. Finalmente, he descrito temas de investigación en los que los datos de restablecimiento de fase han proporcionado información crucial: arrastre, fototransducción, mecanismo del marcapasos, marcadores de fase del marcapasos y medidores de amplitud del oscilador. Claramente, los PRC / PTC nos han iluminado y continuarán haciéndolo.

Aunque sus opiniones no son necesariamente las expresadas en este documento, agradezco a las siguientes personas por sus invaluables discusiones sobre los PRC: los Dres. Woody Hastings, Takao Kondo, Richard Kronauer, Terry Page, Steven Strogatz y Joseph Takahashi. También agradezco a los Dres. Van Gooch y Takao Kondo por hacer posible una versión para computadora del PRC Atlas, que ha facilitado el análisis y trazado de PRCs del Atlas, y Grace Monty, por su ayuda experta en la preparación del manuscrito. Estoy especialmente en deuda con los Dres. Colin Pittendrigh y Patricia DeCoursey por iniciar y fomentar la compilación de PRC en un Atlas.

1. Aschoff, J. Curvas de respuesta en periodicidad circadiana. En: Circadian Clocks, editado por J. Aschoff, North-Holland, Amsterdam, 1965, págs. 95-111.

2. Aschoff, J. Ritmos circadianos: influencias de factores internos y externos sobre el período medido en condiciones constantes. Zeitschrift fur Tierpsychologie 49: 225-249, 1979.

3. Binkley, S. y K. Mosher. Restablecimiento del ritmo circadiano en gorriones: respuesta temprana a los pulsos de luz doblete. J. Bio. Ritmos 2: 1-11, 1987.

4. Broda, H., C. H. Johnson, W. R. Taylor y J. W. Hastings. Dependencia de la temperatura de las curvas de respuesta de fase para cambios de fase inducidos por fármacos. J. Biol. Ritmos 4: 327-333, 1989.

5. Bruce, V. G. Arrastre ambiental de los ritmos circadianos. En: Simposios de Cold Spring Harbor sobre biología cuantitativa, vol. 25, Biological Clocks, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1960, págs. 29-48.

6. Bruce, V. G. y D. H. Minis. Espectro de acción del reloj circadiano en una polilla fotoperiódica. Science 163: 583-585, 1969.

7. Bunning, E. y L. Lorcher. Regulierung und Auslosung endogentages-periodischer Blattbewegungen durch verschiedene Lichtqualitaten. Naturwiss. 44: 472, 1957.

8. Cote, G. G. ¿Reajuste del tipo dos del ritmo circadiano de Euglena gracilis? J. Biol. Rhythms 6: 367-369, 1991.

9. Daan, S. y C. S. Pittendrigh. Un análisis funcional de marcapasos circadianos en roedores nocturnos. III. Agua pesada y luz constante: ¿homeostasis de frecuencia? Comp. Physiol. 106: 267-290, 1976.

10. DeCoursey, P. J. Comportamiento de muestreo de luz en el fotoentrenamiento de un ritmo circadiano de roedor. J. Comp. Physiol. 159: 161-169, 1986.

11. Dharmananda, S. Estudios del reloj circadiano de Neurospora crassa: cambio de fase inducido por la luz. Tesis de doctorado, Universidad de California en Santa Cruz, 1980.

12. Ehret, C. F. Espectros de acción y metabolismo de ácidos nucleicos en ritmos circadianos a nivel celular. En: Simposios de Cold Spring Harbor sobre biología cuantitativa, vol. 25, Biological Clocks, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1960, págs. 149-158.

13. Eskin, A. Algunas propiedades del sistema que controla el ritmo de actividad circadiano de los gorriones. En: Biochemistry, editado por M. Menaker, National Acad. Sciences, Washington, D.C., págs. 55-80, 1971.

14. Eskin, A. Identificación y fisiología de marcapasos circadianos. Alimentado. Proc. 38: 2570-2579, 1979.

15. Eskin, A. y J. S. Takahashi. La activación de la adenilato ciclasa cambia la fase de un marcapasos circadiano. Science 220: 82-84, 1983.

16. Eskin, A., J. S. Takahashi, M. Zatz y G. D. Block. El monofosfato cíclico de guanosina 3 ': 5' imita los efectos de la luz en un marcapasos circadiano en el ojo de Aplysia. J. Neurosci. 4: 2466-2471, 1984.

17. Feldman, J. F. Alargamiento del período de un reloj biológico en Euglena por cicloheximida, un inhibidor de la síntesis de proteínas. P. N. A. S. 57: 1080-1087, 1967.

18. Frank, K. D. y W. F. Zimmerman. Espectros de acción para cambios de fase de un ritmo circadiano en Drosophila. Science 163: 688-689, 1969.

19. Galland, P. Espectroscopia de acción. En: Blue Light Responses: Phenomena and Occurrence in Plants and Microorganisms, Volumen II, editado por H. Senger, CRC Press, Boca Raton, FL, págs. 37-52, 1987.

20. Geusz, M. E. y T. L. Page. Un fotopigmento basado en opsina media los cambios de fase de
el marcapasos circadiano Bulla. J. Comp. Physiol. 168: 565-570, 1991.

21. Goodenough, J. E., V. G. Bruce y A. Carter. Los efectos de los inhibidores que afectan la síntesis de proteínas y la actividad de la membrana sobre el ritmo fototáctico de Chlamydomonas reinhardtii. Biol. Toro. 161: 371-381, 1981.

22. Goto, K., D. L. Laval-Martin y L. N. Edmunds, Jr. Modelado bioquímico de un reloj circadiano oscilatorio autónomo en Euglena. Science 228: 1284-1288, 1985.

23. Halaban, R. Efectos de la calidad de la luz sobre el ritmo circadiano del movimiento de las hojas de una planta de día corto. Plant Physiol. 44: 973-977, 1969.

24. Harris, P. J.C. y M. B. Wilkins. Evidencia de participación de fitocromos en el arrastre del ritmo circadiano del metabolismo del dióxido de carbono en Bryophyllum. Planta 138: 271-278, 1978.

25. Hastings, J. W. Aspectos bioquímicos de los ritmos: cambio de fase por sustancias químicas. En: Simposios de Cold Spring Harbor sobre biología cuantitativa, Volumen 25: Biological Clocks, Cold Spring Harbor, NY, págs. 131-143, 1960.

26. Hastings, J. W. y B. M. Sweeney. Espectros de acción para cambiar la fase del ritmo de luminiscencia en Gonyaulax polyedra. J. Gen. Physiol. 43: 697-706, 1960.

27. Hillman, W. S. Arrastre de la salida de C02 de Lemna a través del fitocromo. Plant Physiol. 48: 770-774, 1971.

28. Hobohm, U., G. Cornelius, W. Taylor y L. Rensing. ¿Se mantiene estacionario el reloj circadiano de Gonyaulax después de un fuerte pulso de anisomicina? Comp. Biochem. Physiol. 79A: 371-378, 1984.

29. Inouye, S. T., J. S. Takahashi, J. Wollnik y F. W. Turek. El inhibidor de la síntesis de proteínas desplaza la fase de un marcapasos circadiano en SCN de mamíferos. Soy. J. Physiol. 225: R1055-R1058, 1988.

30. Jacklet, J. W. Requisito de síntesis de proteínas del reloj circadiano de Aplysia probado por derivados activos e inactivos del inhibidor anisomicina. J. Exp. Biol. 85: 33-42, 1980.

31. Johnson, C. H. An Atlas of Phase Response Curves for Circadian and Circatidal Rhythms, Departamento de Biología, Universidad de Vanderbilt, 715 pp, 1990.

32. Johnson, C. H. y H. Nakashima. La cicloheximida inhibe el cambio de fase del reloj circadiano inducido por la luz en Neurospora. J. Biol. Ritmos 5: 159-167, 1989.

33. Johnson, C. H. y J. W. Hastings. Fototransducción circadiana: reajuste de fase y frecuencia del reloj circadiano, k de las células de Gonyaulax en luz roja. J. Biol. Ritmos 4: 417-437, 1989.

34. Johnson, C. H., T. Kondo y J. W. Hastings. Espectro de acción para restablecer el ritmo de fototaxis circadiano en la cepa CW15 de Chlamydomonas. II. Células iluminadas. Plant Physiol. 97: 1122-1129, 1991.

35. Johnson, C. H. y T. Kondo. Singularidades inducidas por la luz y cambios de período del ritmo de fototaxis circadiano en la cepa CW15 de Chlamydomonas, presentado en 1992.

36. Joshi, D. y M. K. Chandrashekaran. Sensibilidad espectral de los fotorreceptores responsables del cambio de fase del ritmo circadiano de actividad en el murciélago, Hipposideros speoris. J. Comp. Physiol. 156: 189-198, 1985.

37. Kay, S. A., A. Nagatani, B. Keith, M. Deak, M. Furuya y N.-H. Chua. El fitocromo del arroz es biológicamente activo en el tabaco transgénico. Plant Cell 1: 775-782, 1989.

38. Klemm, E. y H. Ninnemann. Espectro de acción detallado para el cambio de retardo en la aparición de pupas de Drosophila pseudoobscura. Photochem. Photobiol. 24: 369-371, 1976.

39. Kondo, T. Persistencia del ritmo de absorción de potasio en presencia de sacarosa exógena en Lemna gibba G3. Plant Cell Physiol. 23: 467-472, 1982.

40. Kondo, T. Control de fase del ritmo de absorción de potasio mediante señales luminosas en Lemna gibba G3. Pflanzenphysiol. Bd. 107. S. 395-407, 1982.

41. Kondo, T. Comparación de los cambios de fase del ritmo circadiano de la captación de K + en Lemna gibba G3 por varios análogos de aminoácidos. Plant Physiol. 90: 1600-1608, 1989.

42. Kondo, T., C. H. Johnson y J.W. Hastings. Espectro de acción para restablecer el ritmo de fototaxis circadiano en la cepa CW15 de Chlamydomonas. I. Celdas en la oscuridad "
ness. Plant Physiol. 95: 197-205, 1991.

43. Lakin-Thomas, P. L., G. G. Cote y S. Brody. Ritmos circadianos en Neurospora crassa: bioquímica y genética. Crit. Rev. Microbiol. 17: 365-416, 1990.

44. Mayer, W., Gruner, R. y H. Strubel. Periodenverlangerung und phasenverschiebungen der circadiamen rhythmik von Phaseolus coccineus L. durch teofilina. Planta 125: 141-148, 1975.

45. Nakashima, H. Aspectos bioquímicos y genéticos del ritmo de conidiación en Neurospora crassa: cambio de fase por inhibidores metabólicos. En: Circadian Clocks and Zeitgebers, editado por T. Hiroshige y K. Honma, Universidad de Hokkaido. Press, Sapporo, págs. 35-44, 1985.

46. ​​Nakashima, H., J. Perlman y J. F. Feldman. Evidencia genética de que la síntesis de proteínas es necesaria para el reloj circadiano de Neurospora. Science 212: 361-362, 1981.

47. Ninnemann, H. Fotorreceptores para ritmos circadianos. Photochem. Photobiol. Rev.4: 207-266, 1979.

48. Olesiak, W., A. Ungar, C. H. Johnson y J. W. Hastings. Correlación entre la inhibición de la síntesis de proteínas y el cambio de fase del reloj circadiano en Gonyaulax. J. Biological Rhythms 2: 121-138, 1987.

49. Page, T. L. Manipulación del desarrollo del marcapasos circadiano en la cucaracha: relación entre el período del marcapasos y la respuesta a la luz. Physiol. Entomol. 16: 243 -248, 1991.

50. Page, T. L. y R. K. Barrett. Efectos de la luz sobre el desarrollo del marcapasos circadiano. II. Respuestas a la luz. J. Comp. Physiol. A 165: 51 - 59, 1989.

51. Peterson, E. L. Una interpretación de ciclo límite de un oscilador circadiano de mosquito. J. Theor. Biol. 84: 281-310, 1980.

52. Pittendrigh, C. S. Ritmos circadianos y organización circadiana de los sistemas vivos. En: Simposios de Cold Spring Harbor sobre biología cuantitativa, vol. 25, Biological Clocks, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1960, págs. 159-184.

53. Pittendrigh, C. S. Algunos aspectos funcionales de los marcapasos circadianos. En: Biological Rhythms and their Central Mechanism, editado por M. Suda, O. Hayaishi y H. Nakagawa, Elsevier Press, Nueva York, 1980, págs. 3-12.

54. Pittendrigh, C. S. Sistemas circadianos: perspectiva general. En: Manual de neurobiología del comportamiento, vol. 4, Biological Rhythms, editado por J. Aschoff, Plenum Press, Nueva York, 1981, págs. 57-80.

55. Pittendrigh, C. S. Sistemas circadianos: arrastre. En: Manual de neurobiología del comportamiento, vol. 4, Biological Rhythms, editado por J. Aschoff, Plenum Press, Nueva York, 1981, págs. 95-124.

56. Pittendrigh, C. S. Y S. Daan. Un análisis funcional de marcapasos circadianos en roedores nocturnos. IV. Arrastre: marcapasos como reloj. J. Comp. Physiol. 106: 291 -331, 1976.

57. Pittendrigh, C. S. y D. H. Minis. La medición del tiempo fotoperiódico en Pectinophora gossypiella y su relación con el sistema circadiano en esa especie. En: Biocronometría, editado por M. Menaker, Academia Nacional de Ciencias, Washington, D.C., 1971, págs. 212-250.

58. Prosser, R. A. y M. U. Gillette. El reloj circadiano de los mamíferos en los núcleos matic supraquias se restablece in vitro mediante cAMP. J. Neurosci. 9: 1073-1081, 1989.

59. Raju, U., S. J. Yeung y A. Eskin. Participación de las proteínas en la luz que reajusta los osciladores circadianos oculares en Aplysua. Soy. J. Physiol. 258: R256-R262, 1990.

60. Reebs, S. G. y N. Mrosovsky. Efectos de la rueda inducida en los ritmos de actividad circadiana de los hámsteres sirios: curva de respuesta de fase y de arrastre. J. Biol. Ritmos 4: 39-48, 1989.

61. Rensing, L. y R. Hardeland. El mecanismo celular de los ritmos circadianos: una mirada a la evidencia, hipótesis y problemas. Chronobiol. En t. 7: 353-370, 1990.

62. Roenneberg, T. y J. W. Hastings. Dos fotorreceptores controlan el reloj circadiano de un alga unicelular. Naturwiss. 75: 206-207, 1988.

63. Sargent, M. L. y W. R. Briggs. Los efectos de la luz sobre un ritmo circadiano de conidiación en Neurospora. Plant Physiol. 42: 1504-1510, 1967.

64. Satter, R. L., P. B. Applewhite, J. Chaudhri y A. W. Galston. Requerimiento de sacarosa y fitocromo PFR para el movimiento rítmico de las hojas en Albizzia. Photochem. Photobiol. 23: 107-112, 1976.

65. Schrempf, M. Eigenschaften und Lokalisation des Photorezeptors fur phasenverschiebendes Storlicht bei der Blutenblattbewegung von Kalanchoe. Tesis doctoral de la Universidad de Tubingen, 1975.

66. Simon, E., R. L. Satter y A. W. Galston. Ritmicidad circadiana en Sa extirpado

nanae pulvini. II. Reinicio del reloj mediante conversión de fitocromo. Plant Physiol. 58: 421-425, 1976.

67. Takahashi, J. S., P. J. DeCoursey, L. Bauman y M. Menaker. Sensibilidad espectral de un nuevo sistema fotorreceptivo que media el arrastre de los ritmos circadianos de los mamíferos. Nature 308: 186-188, 1984.

68. Takahashi, J. S., N. Murakami, S. S. Nikaido, B. L. Pratt y L. M. Robertson. La pineal aviar, un sistema modelo vertebrado del oscilador circadiano: regulación celular de los ritmos circadianos por luz, segundos mensajeros y síntesis macromolecular. Prog. Reciente Hormone Res. 45: 279-352, 1989.

69. Tamponnet, C. y L. N. Edmunds, Jr. Arrastre y cambio de fase del ritmo circadiano de la división celular por calcio en cultivos sincrónicos de la cepa Z de tipo salvaje y del mutante aclorofílico ZC de Euglena gracilis. Plant Physiol.93: 425-431, 1990.

70. Taylor, W., R. Krasnow, J. C. Dunlap, J. Broda y J. W. Hastings. Los pulsos críticos de anisomicina impulsan el oscilador circadiano en Gnyaulax hacia su singularidad. J. Comp. Physiol. 148: 11-25, 1982.

71. Van Reeth, O. y F. W. Turek. La actividad estimulada media los cambios de fase en el reloj circadiano del hámster inducidos por pulsos oscuros o benzodiazepinas. Nature 339: 49-51, 1989.

72. Winfree, A. T. La geometría del tiempo biológico. Biomatemáticas, vol. 8, SpringerVerlag, Nueva York, 1980.

A / D = relación entre el área de cambios de fase de avance y el área de cambios de fase de retardo en un PRC

marcapasos = oscilador = reloj = maestro (A) oscilador

t = tau = período de ejecución libre

y = relación de fase de un fenómeno cíclico a otro punto de referencia de fase

(f r) = una fase del ritmo utilizada como punto de referencia

PP c = fotoperíodo "completo"

PP s = fotoperiodo "esqueleto"

PRC = curva de respuesta de fase = gráfico del tiempo circadiano del estímulo ("fase anterior") frente al cambio de fase


Discusión

Análisis de sensibilidad

¿Qué es un análisis de sensibilidad en la investigación clínica?

El análisis de sensibilidad (SA) se define como "un método para determinar la solidez de una evaluación mediante el examen de la medida en que los resultados se ven afectados por cambios en los métodos, modelos, valores de variables no medidas o supuestos" con el objetivo de identificar "resultados que dependen más de suposiciones cuestionables o infundadas ”[2]. También se ha definido como “una serie de análisis de un conjunto de datos para evaluar si la alteración de cualquiera de las suposiciones realizadas conduce a diferentes interpretaciones o conclusiones finales” [3]. Esencialmente, SA aborda el tipo de pregunta "¿qué pasa si las entradas clave o los supuestos cambian?". Si queremos saber si los resultados cambian cuando cambia algo sobre la forma en que abordamos el análisis de datos, podemos hacer el cambio en nuestro enfoque de análisis y documentar los cambios en los resultados o conclusiones. Para una cobertura más detallada de SA, remitimos al lector a estas referencias [4-7].

¿Por qué es necesario el análisis de sensibilidad?

El diseño y el análisis de los ensayos clínicos a menudo se basan en suposiciones que pueden tener algún efecto, influencia o impacto en las conclusiones si no se cumplen. Es importante evaluar estos efectos mediante análisis de sensibilidad. La coherencia entre los resultados del análisis primario y los resultados del análisis de sensibilidad puede fortalecer las conclusiones o la credibilidad de los hallazgos. Sin embargo, es importante señalar que la definición de coherencia puede depender en parte del área de investigación, el resultado de interés o incluso las implicaciones de los hallazgos o resultados.

Es igualmente importante evaluar la solidez para garantizar una interpretación adecuada de los resultados teniendo en cuenta las cosas que pueden tener un impacto en ellos. Por lo tanto, es imperativo que cada plan analítico tenga incorporados algunos análisis de sensibilidad.

La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos (EE. UU.) Y la Asociación Europea de Medicamentos (EMEA), que ofrecen orientación sobre los principios estadísticos para los ensayos clínicos, afirman que “es importante evaluar la solidez de los resultados y las conclusiones principales del prueba." La solidez se refiere a “la sensibilidad de las conclusiones generales a diversas limitaciones de los datos, supuestos y enfoques analíticos del análisis de datos” [8]. El Instituto Nacional de Salud y Excelencia Clínica (NICE) del Reino Unido (RU) también recomienda el uso de análisis de sensibilidad para “explorar escenarios alternativos y la incertidumbre en los resultados de rentabilidad” [9].

¿Con qué frecuencia se informa el análisis de sensibilidad en la práctica?

Para evaluar la frecuencia con la que se utilizan los análisis de sensibilidad en la investigación médica y de salud, encuestamos las ediciones de enero de 2012 de las principales revistas médicas (British Medical Journal, New England Journal of Medicine, The Lancet, Journal of the American Medical Association y Canadian Medical Association Journal ) y las principales revistas de economía de la salud (Farmacoeconomía, Toma de decisiones médicas, Revista europea de economía de la salud, Economía de la salud y Revista de economía de la salud). De cada artículo que incluía algún tipo de análisis estadístico, evaluamos: i) el porcentaje de artículos publicados que informaron resultados de algunos análisis de sensibilidad y ii) los tipos de análisis de sensibilidad que se realizaron. La Tabla 1 proporciona un resumen de los hallazgos. En general, el uso predominante puntual de los análisis de sensibilidad es de aproximadamente el 26,7% (36/135), lo que parece muy bajo. Un mayor porcentaje de artículos publicados en economía de la salud que en revistas médicas (30,8% frente a 20,3%) informaron algunos análisis de sensibilidad. Entre los artículos en revistas médicas, 18 (28,1%) eran ECA, de los cuales solo 3 (16,6%) informaron análisis de sensibilidad. La evaluación de la solidez de los hallazgos a diferentes métodos de análisis fue el tipo más común de análisis de sensibilidad informado en ambos tipos de revistas. Por tanto, a pesar de su importancia, los análisis de sensibilidad están infrautilizados en la práctica. Además, los análisis de sensibilidad son más comunes en la investigación de economía de la salud, por ejemplo, al realizar análisis de costo-efectividad, análisis de costo-utilidad o análisis de impacto presupuestario, que en otras áreas de la investigación médica o de salud.

Tipos de análisis de sensibilidad

En esta sección, describimos escenarios que pueden requerir análisis de sensibilidad y cómo se pueden usar los análisis de sensibilidad para evaluar la solidez de los análisis estadísticos o los hallazgos de los ECA. Estos no pretenden ser exhaustivos, sino más bien ilustrar situaciones comunes en las que podría ser útil considerar los análisis de sensibilidad (Tabla 2). En cada caso, proporcionamos ejemplos de estudios reales en los que se realizaron análisis de sensibilidad y las implicaciones de estos análisis de sensibilidad.

Impacto de valores atípicos

Un valor atípico es una observación numéricamente distante del resto de los datos. Se desvía notablemente del resto de la muestra de la que procede [14, 15]. Los valores atípicos suelen ser casos excepcionales en una muestra. El problema con los valores atípicos es que pueden desinflar o inflar la media de una muestra y, por lo tanto, influir en cualquier estimación del efecto del tratamiento o asociación que se derive de la media. Para evaluar el impacto potencial de los valores atípicos, primero se evaluaría si alguna observación cumple o no la definición de un valor atípico, utilizando un diagrama de caja o puntuaciones z [16]. En segundo lugar, se podría realizar un análisis de sensibilidad con y sin los valores atípicos.

En un análisis de costo-utilidad de una clínica de osteopatía basada en la práctica para el dolor espinal subagudo, Williams et al. informaron índices de costes por año de calidad de vida más bajos cuando excluyeron los valores atípicos [17]. En otras palabras, hubo ciertos participantes en el ensayo cuyos costos eran muy altos y estaban haciendo que los costos promedio parecieran más altos de lo que probablemente eran en realidad. El costo observado por año de calidad de vida no fue robusto para la exclusión de valores atípicos y cambió cuando se excluyeron.

Un análisis primario basado en el principio de intención de tratar no mostró diferencias estadísticamente significativas en la reducción de la depresión entre un programa de intervención de autoayuda cognitiva dirigido por enfermeras en comparación con la atención estándar entre 218 pacientes hospitalizados con angina durante 6 meses. Se realizaron algunos análisis de sensibilidad en este ensayo al excluir a los participantes con altos niveles iniciales de depresión (valores atípicos) y mostraron una reducción estadísticamente significativa de la depresión en el grupo de intervención en comparación con el control. Esto implica que los resultados del análisis primario se vieron afectados por la presencia de pacientes con depresión alta basal [18].

Impacto del incumplimiento o desviaciones del protocolo

En los ensayos clínicos, es posible que algunos participantes no se adhieran a la intervención que se les asignó para recibir o cumplir con las visitas de tratamiento programadas. La no adherencia o el incumplimiento es una forma de desviación del protocolo. Otros tipos de desviaciones del protocolo incluyen el cambio entre los brazos de intervención y control (es decir, cambio de tratamiento o cruces) [19, 20], o no implementar la intervención según lo prescrito (es decir, fidelidad de la intervención) [21, 22].

Las desviaciones del protocolo son muy frecuentes en la investigación intervencionista [23-25]. El impacto potencial de las desviaciones del protocolo es la dilución del efecto del tratamiento [26, 27]. Por lo tanto, es crucial determinar la solidez de los resultados a la inclusión de datos de participantes que se desvían del protocolo. Por lo general, para los ECA, el análisis primario se basa en un principio de intención de tratar (ITT), en el que los participantes se analizan según el brazo al que fueron asignados al azar, independientemente de si realmente recibieron el tratamiento o completaron el régimen prescrito [ 28, 29]. Se pueden realizar dos tipos comunes de análisis de sensibilidad para evaluar la solidez de los resultados a las desviaciones del protocolo: 1) análisis por protocolo (PP), en el que los participantes que violan el protocolo se excluyen del análisis [30] y 2) como- Análisis tratado (AT): en el que se analiza a los participantes según el tratamiento que realmente recibieron [30]. El análisis PP proporciona el escenario ideal en el que todos los participantes cumplen, y es más probable que muestre un efecto, mientras que el análisis ITT proporciona un escenario de la “vida real”, en el que algunos participantes no cumplen. Es más conservador y menos probable que demuestre que la intervención es eficaz. Para los ensayos con medidas repetidas, algunas violaciones del protocolo que conducen a la falta de datos pueden tratarse alternativamente. Esto se trata con más detalle en la siguiente sección.

Se diseñó un ensayo para investigar los efectos de una evaluación electrónica y una intervención breve para cambiar el comportamiento de riesgo de beber en estudiantes universitarios. Los resultados del análisis ITT (en los 2336 participantes que respondieron la encuesta de seguimiento) mostraron que la intervención no tuvo un efecto significativo. Sin embargo, un análisis de sensibilidad basado en el análisis de PP (que incluyó solo a aquellos con riesgo de consumo de alcohol al inicio del estudio y que respondieron la encuesta de seguimiento n = 408) sugirió un pequeño efecto beneficioso sobre el consumo semanal de alcohol [31]. Un lector podría tener menos confianza en los hallazgos del ensayo debido a la inconsistencia entre los análisis ITT y PP; el ITT no fue robusto para los análisis de sensibilidad. Un investigador podría optar por explorar las diferencias en las características de los participantes que se incluyeron en el análisis ITT versus el PP.

Un estudio comparó los efectos a largo plazo del tratamiento quirúrgico versus no quirúrgico del dolor de espalda crónico. Tanto el análisis ITT como el AT no mostraron diferencias significativas entre las dos estrategias de gestión [32]. Un lector estaría más seguro de los hallazgos porque los análisis ITT y AT fueron consistentes; el ITT fue robusto para los análisis de sensibilidad.

Impacto de los datos faltantes

Los datos faltantes son comunes en todos los estudios de investigación. Este es un problema que puede definirse ampliamente como “falta de información sobre los fenómenos que nos interesan” [33]. Los datos pueden faltar por diferentes razones, incluyendo (1) la falta de respuesta en las encuestas debido a la falta de interés, falta de tiempo, respuestas sin sentido y errores de codificación en la entrada / transferencia de datos (2) datos incompletos en grandes registros de datos debido a la falta citas, no todos son capturados en la base de datos y datos incompletos y (3) falta de estudios prospectivos como resultado de pérdidas durante el seguimiento, abandonos, incumplimiento, dosis faltantes y errores de entrada de datos.

La elección de cómo tratar los datos faltantes dependería de los mecanismos de falta. En este sentido, los datos pueden faltar al azar (MAR), faltar no al azar (MNAR) o faltar completamente al azar (MCAR). Cuando los datos son MAR, los datos faltantes dependen de algunas otras variables observadas en lugar de alguna no observada. Por ejemplo, considere un ensayo para investigar el efecto de los suplementos de calcio antes del embarazo sobre los trastornos hipertensivos durante el embarazo. La falta de datos sobre los trastornos hipertensivos depende (condicional) de estar embarazada en primer lugar. Cuando los datos son MCAR, los casos con datos faltantes pueden considerarse una muestra aleatoria extraída de todos los casos. En otras palabras, no existe una "causa" de ausencia. Considere el ejemplo de un ensayo que compara un nuevo tratamiento contra el cáncer con el tratamiento estándar en el que se realiza un seguimiento de los participantes a los 4, 8, 12 y 16 meses. Si un participante pierde el seguimiento a los 8 y 16 meses y estos no están relacionados con el resultado de interés, en este caso la mortalidad, entonces estos datos faltantes son MCAR. Razones como que el personal de la clínica esté enfermo o fallas en el equipo a menudo no están relacionadas con el resultado de interés. Sin embargo, la suposición de MCAR a menudo es difícil de probar porque es posible que no se conozca la razón por la que faltan datos y, por lo tanto, es difícil determinar si está relacionado con el resultado de interés. Cuando los datos son MNAR, la falta de datos depende de algunos datos no observados. Por ejemplo, en el caso anterior, si el participante perdió la cita del octavo mes porque se sentía peor o la cita del decimosexto mes porque estaba muerto, la ausencia depende de los datos no observados porque el participante estuvo ausente. Cuando los datos son MAR o MCAR, a menudo se hace referencia a ellos como ignorables (siempre que se tenga en cuenta la causa de MAR). MNAR, por otro lado, es una ausencia no despreciable. Ignorar la falta de estos datos conduce a estimaciones de parámetros sesgadas [34]. Ignorar los datos faltantes en los análisis puede tener implicaciones sobre la fiabilidad, validez y generalización de los resultados de la investigación.

La mejor manera de lidiar con los datos faltantes es la prevención, mediante los pasos dados en las etapas de diseño y recolección de datos, algunos de los cuales han sido descritos por Little et al. [35]. Pero esto es difícil de lograr en la mayoría de los casos. Hay dos enfoques principales para manejar los datos faltantes: i) ignorarlos — y usar un análisis de caso completo y ii) imputarlos — usando técnicas de imputación única o múltiple. La imputación es uno de los enfoques más utilizados para manejar los datos faltantes. Algunos ejemplos de métodos de imputación simple incluyen el método de plataforma caliente, el método de plataforma fría, la imputación media, la técnica de regresión, la última observación llevada hacia adelante (LOCF) y los métodos compuestos, que utilizan una combinación de los métodos anteriores para imputar los valores perdidos. Los métodos de imputación única a menudo conducen a estimaciones sesgadas y a una subestimación de la verdadera variabilidad de los datos. La técnica de imputación múltiple (IM) es actualmente el mejor método disponible para tratar los datos faltantes bajo el supuesto de que faltan datos al azar (MAR) [33, 36-38]. MI aborda las limitaciones de la imputación única mediante el uso de múltiples conjuntos de datos imputados que producen estimaciones no sesgadas y también da cuenta de la variabilidad dentro y entre conjuntos de datos. Los métodos bayesianos que utilizan modelos estadísticos que suponen una distribución previa de los datos faltantes también pueden utilizarse para imputar datos [35].

Es importante señalar que ignorar los datos faltantes en el análisis supondría implícitamente que los datos son MCAR, una suposición que a menudo es difícil de verificar en la realidad.

Existen algunos enfoques estadísticos para tratar los datos faltantes que no requieren necesariamente métodos formales de imputación. Por ejemplo, en estudios que utilizan resultados continuos, se utilizan modelos lineales mixtos para medidas repetidas para analizar los resultados medidos repetidamente a lo largo del tiempo [39, 40]. Para respuestas categóricas o datos de recuento, se pueden utilizar métodos de ecuaciones de estimación generalizadas [GEE] y modelos mixtos lineales generalizados de efectos aleatorios [GLMM] [41, 42]. En estos modelos se asume que los datos faltantes son MAR. Si esta suposición es válida, entonces el análisis de caso completo mediante la inclusión de predictores de observaciones faltantes proporcionará estimaciones consistentes del parámetro.

La elección de ignorar o imputar los datos faltantes, y cómo imputarlos, puede afectar los resultados del ensayo. Aunque se debe hacer un enfoque (ignorar o imputar, y si es el último, cómo imputar) a priori, se puede realizar un análisis de sensibilidad con un enfoque diferente para ver qué tan “robusto” es el análisis primario con respecto al método elegido para manejar los datos faltantes.

Un artículo de 2011 informó los análisis de sensibilidad de diferentes estrategias para imputar datos faltantes en ECA grupales con un resultado binario utilizando el ensayo de evaluación de hipertensión comunitaria (CHAT) como ejemplo. Descubrieron que la varianza en el efecto del tratamiento se subestimaba cuando la cantidad de datos faltantes era grande y la estrategia de imputación no tenía en cuenta la correlación intragrupo. Sin embargo, los efectos de la intervención bajo varios métodos de imputación fueron similares. La intervención CHAT no fue superior a la atención habitual [43].

En un ensayo que comparó el metotrexato con el placebo en el tratamiento de la artritis psoriásica, los autores informaron un análisis por intención de tratar (utilizando múltiples técnicas de imputación para tener en cuenta los datos faltantes) y un análisis de caso completo (ignorando los datos faltantes). El análisis de caso completo, que es menos conservador, mostró una mejora marginal en el resultado primario (criterios de respuesta a la artritis psoriásica), mientras que el análisis por intención de tratar no lo hizo [44]. Un lector tendría menos confianza en los efectos del metotrexato en la artritis psoriásica, debido a la discrepancia entre los resultados con los datos imputados (ITT) y el análisis completo del caso.

Impacto de diferentes definiciones de resultados (por ejemplo, diferentes puntos de corte para resultados binarios)

A menudo, un resultado se define al alcanzar o no alcanzar un cierto nivel o umbral de una medida. Por ejemplo, en un estudio que mide las tasas de adherencia a la medicación, los niveles de adherencia se pueden dicotomizar como lograr o no alcanzar al menos el 80%, 85% o 90% de las píldoras tomadas. La elección del nivel que debe alcanzar un participante puede afectar el resultado; puede ser más difícil lograr un 90% de adherencia que un 80%. Por lo tanto, se podría realizar un análisis de sensibilidad para ver cómo la redefinición del umbral cambia el efecto observado de una determinada intervención.

En un ensayo que comparó caspofungina con anfotericina B para pacientes neutropénicos febriles, se realizó un análisis de sensibilidad para investigar el impacto de diferentes definiciones de resolución de la fiebre como parte de un criterio de valoración compuesto que incluyó: resolución de cualquier infección fúngica invasiva inicial, sin infección fúngica invasiva irruptiva , supervivencia, no suspensión prematura del fármaco del estudio y resolución de la fiebre durante 48 horas durante el período de neutropenia. Descubrieron que las tasas de respuesta eran más altas cuando se usaban definiciones de resolución de fiebre menos estrictas, especialmente en pacientes de bajo riesgo. Las definiciones modificadas de resolución de la fiebre fueron: sin fiebre durante las 24 horas anteriores a la resolución de la neutropenia sin fiebre en la visita de seguimiento de 7 días después de la terapia y eliminación completa de la resolución de la fiebre del criterio de valoración combinado. Esto implica que la eficacia de ambos medicamentos depende en cierta medida de la definición de los resultados [45].

En un ensayo de fase II que comparó la minociclina y la creatinina con un placebo para la enfermedad de Parkinson, se realizó un análisis de sensibilidad basado en otra definición (umbral) de inutilidad.En el análisis primario, se estableció un umbral de futilidad predeterminado en una reducción del 30% en el cambio medio en la puntuación de la Escala de calificación de la enfermedad de Parkinson unificada (UPDRS), derivada de los datos de control históricos. Si la minociclina o la creatinina no produjeron una reducción de al menos un 30% en la puntuación UPDRS, se considerarían inútiles y no se realizarán más pruebas. Según los datos derivados del grupo de control actual (placebo), se utilizó un nuevo umbral del 32,4% (más estricto) para el análisis de sensibilidad. Los resultados del análisis primario y del análisis de sensibilidad confirmaron que ni la creatina ni la minociclina podrían rechazarse por ser inútiles y ambos deberían probarse en ensayos de fase III [46]. Un lector estaría más seguro de estos sólidos hallazgos.

Impacto de diferentes métodos de análisis para tener en cuenta la agrupación o la correlación

Las intervenciones se pueden administrar a individuos, pero también se pueden administrar a grupos de individuos o grupos de origen natural. Por ejemplo, se podría dar una intervención a los estudiantes de una clase y comparar sus resultados con los de los estudiantes de otra clase: la clase es el grupo. Los grupos también pueden ser pacientes tratados por el mismo médico, médicos en el mismo centro de práctica u hospital, o participantes que viven en la misma comunidad. Asimismo, en el mismo ensayo, los participantes pueden reclutarse en múltiples sitios o centros. Cada uno de estos centros representará un grupo. Los pacientes o elementos dentro de un grupo a menudo tienen un grado apreciable de homogeneidad en comparación con los pacientes entre grupos. En otras palabras, es más probable que los miembros del mismo conglomerado sean similares entre sí que con los miembros de otro conglomerado, y esta similitud puede entonces reflejarse en la medida de similitud o correlación, en el resultado de interés.

Existen varios métodos para contabilizar o ajustar las similitudes dentro de los conglomerados, o "agrupamiento" en los estudios en los que se espera este fenómeno o existe como parte del diseño (por ejemplo, en los ensayos de aleatorización por conglomerados). Por lo tanto, al evaluar el impacto de la agrupación, uno puede incorporar en los planes analíticos dos formas de análisis de sensibilidad: i) análisis con y sin la agrupación en cuenta: comparar el análisis que ignora la agrupación (es decir, supone que los datos son independientes) con un análisis primario. método elegido para contabilizar la agrupación ii) análisis que compara varios métodos de contabilización de la agrupación.

Los datos correlacionados también pueden ocurrir en estudios longitudinales a través de mediciones repetidas o múltiples del mismo paciente, tomadas a lo largo del tiempo o basadas en múltiples respuestas en una sola encuesta. Ignorar la posible correlación entre varias mediciones de un individuo puede llevar a conclusiones inexactas [47].

Aquí hay algunas referencias a estudios que compararon los resultados que resultaron cuando se usaron o no diferentes métodos para dar cuenta de la agrupación. Es de destacar el hecho de que los enfoques analíticos para los ECA grupales y los ECA de múltiples sitios son similares.

Ma et al. realizaron análisis de sensibilidad de diferentes métodos de análisis de ECA grupales [48]. En este artículo, compararon tres métodos a nivel de conglomerados (regresión lineal no ponderada, regresión lineal ponderada y metarregresión de efectos aleatorios) con seis métodos de análisis de nivel individual (regresión logística estándar, enfoque de errores estándar robustos, GEE, meta-efectos aleatorios). enfoque analítico, regresión logística de efectos aleatorios y regresión bayesiana de efectos aleatorios). Utilizando datos del ensayo CHAT, en este análisis, los nueve métodos proporcionaron resultados similares, reforzando la hipótesis de que la intervención CHAT no fue superior a la atención habitual.

Peters y col. realizaron análisis de sensibilidad para comparar diferentes métodos: tres a nivel de grupo (regresión no ponderada de las probabilidades del registro de la práctica, regresión de las probabilidades del registro ponderadas por su varianza inversa y metarregresión de efectos aleatorios de las probabilidades del registro con el grupo como efecto aleatorio) y cinco métodos a nivel individual (regresión logística estándar que ignora el agrupamiento, errores estándar robustos, GEE, regresión logística de efectos aleatorios y regresión logística de efectos aleatorios bayesianos) - para analizar ensayos aleatorizados por conglomerados utilizando un ejemplo que involucra un diseño factorial [13]. En este análisis, demostraron que los métodos utilizados en el análisis de los ensayos aleatorizados por conglomerados podrían dar resultados variables, siendo la regresión logística estándar el menos conservador que ignora el conglomerado.

Cheng y col. utilizaron análisis de sensibilidad para comparar diferentes métodos (seis modelos para resultados binarios agrupados y tres modelos para resultados nominales agrupados) de analizar datos correlacionados en encuestas de elección discreta [49]. Los resultados fueron robustos a varios modelos estadísticos, pero mostraron más variabilidad en presencia de un efecto de grupo más grande (mayor correlación dentro del paciente).

Un ensayo evaluó los efectos del lansoprazol sobre la enfermedad por reflujo gastroesofágico en niños de 19 clínicas con asma. El análisis principal se basó en GEE para determinar el efecto del lansoprazol en la reducción de los síntomas del asma. Posteriormente, realizaron un análisis de sensibilidad al incluir el sitio de estudio como covariable. Su hallazgo de que el lansoprazol no mejoraba significativamente los síntomas fue sólido para este análisis de sensibilidad [50].

Además de comparar el rendimiento de diferentes métodos para estimar los efectos del tratamiento en un resultado continuo en ensayos controlados aleatorios multicéntricos simulados [12], los autores utilizaron datos de Computerization of Medical Practices for the Enhancement of Therapeutic Effectiveness (COMPETE) II [51] evaluar la solidez de los resultados primarios (basados ​​en GEE para ajustar por agrupamiento por proveedor de atención) bajo diferentes métodos de ajuste por agrupamiento. Los resultados, que mostraron que un sistema de apoyo a la toma de decisiones electrónico compartido mejoró la atención y los resultados en los pacientes diabéticos, fueron sólidos bajo diferentes métodos de análisis.

Impacto de los riesgos competitivos en el análisis de ensayos con resultados compuestos

Un evento de riesgo competitivo ocurre en situaciones en las que es probable que ocurran múltiples eventos de manera que la ocurrencia de un evento puede evitar que se observen otros eventos [48]. Por ejemplo, en un ensayo que utiliza una combinación de muerte, infarto de miocardio o accidente cerebrovascular, si alguien muere, no puede experimentar un evento posterior, o accidente cerebrovascular o infarto de miocardio; la muerte puede ser un evento de riesgo competitivo. De manera similar, la muerte puede ser un riesgo competitivo en los ensayos de pacientes con enfermedades malignas donde los eventos trombóticos son importantes. Hay varias opciones para lidiar con los riesgos en competencia en los análisis de supervivencia: (1) realizar un análisis de supervivencia para cada evento por separado, donde los otros eventos en competencia son tratados como censurados como la representación común de las curvas de supervivencia utilizando la Kaplan- En este contexto, el estimador de Meier se reemplaza por la función de incidencia acumulada (CIF) que ofrece una mejor interpretación de la curva de incidencia para un riesgo, independientemente de si los riesgos en competencia son independientes (2) para utilizar un modelo de riesgo de subdistribución proporcional (Fine & amp Gray) en el que los sujetos que experimentan otros eventos en competencia se mantienen en el conjunto de riesgos para el evento de interés (es decir, como si pudieran experimentar el evento más tarde) (3) para ajustarse a un modelo, en lugar de modelos separados, teniendo en cuenta todos los riesgos en competencia juntos (enfoque de Lunn-McNeill) [13]. Por lo tanto, el mejor enfoque para evaluar la influencia de un riesgo competitivo sería planificar un análisis de sensibilidad que se ajuste al evento de riesgo competitivo.

Un ensayo informado anteriormente comparó la heparina de bajo peso molecular (HBPM) con la terapia anticoagulante oral para la prevención de la tromboembolia venosa recurrente (TEV) en pacientes con cáncer avanzado, y un estudio posterior presentó análisis de sensibilidad que compararon los resultados del análisis de supervivencia estándar (Kaplan- Método de Meier) con los de métodos de riesgo competidores, a saber, la función de incidencia acumulada (CIF) y la prueba de Gray [52]. Los resultados con ambos métodos fueron similares. Esto fortaleció su confianza en la conclusión de que la HBPM redujo el riesgo de TEV recurrente.

Para los pacientes con mayor riesgo de enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) pero también de muerte prematura no relacionada con ESRD, como pacientes con diabetes o con enfermedad vascular, los análisis que consideran los dos eventos como resultados diferentes pueden ser engañosos si la posibilidad de morir antes no se tiene en cuenta el desarrollo de la ERT [49]. Diferentes estudios que realizaron análisis de sensibilidad demostraron que los resultados sobre los predictores de ERT y muerte por cualquier causa dependían de si se tenían en cuenta o no los riesgos competitivos [53, 54] y de qué método de riesgo competitivo se utilizaba [55]. Estos estudios destacan aún más la necesidad de un análisis de sensibilidad de los riesgos en competencia cuando están presentes en los ensayos.

Impacto del desequilibrio inicial en los ECA

En los ECA, la aleatorización se utiliza para equilibrar la distribución esperada de las características iniciales o pronósticas de los pacientes en todos los brazos de tratamiento. Por lo tanto, el análisis primario se basa típicamente en un enfoque ITT sin ajustar para las características de la línea de base. Sin embargo, todavía puede producirse un desequilibrio residual por casualidad. Se puede realizar un análisis de sensibilidad mediante el uso de un análisis multivariable para ajustar los desequilibrios de línea de base residuales hipotéticos para evaluar su impacto en las estimaciones del efecto.

Un artículo presentó un estudio de simulación en el que se varió el riesgo del resultado, el efecto del tratamiento, el poder y la prevalencia de los factores pronósticos y el tamaño de la muestra para evaluar sus efectos sobre las estimaciones del tratamiento. Los modelos de regresión logística se compararon con y sin ajuste por los factores pronósticos. El estudio concluyó que la probabilidad de desequilibrio pronóstico en ensayos pequeños podría ser sustancial. Además, el ajuste de covariables mejoró la precisión de la estimación y la potencia estadística [56].

En un ensayo que evaluó la efectividad de la terapia de comunicación mejorada para la afasia y la disartria después de un accidente cerebrovascular, los autores realizaron un análisis de sensibilidad para ajustar los desequilibrios iniciales. Tanto el análisis primario como el de sensibilidad mostraron que la terapia de comunicación mejorada no tenía ningún beneficio adicional [57].

Impacto de los supuestos distributivos

La mayoría de los análisis estadísticos se basan en supuestos de distribución para los datos observados (por ejemplo, distribución normal para resultados continuos, distribución de Poisson para datos de recuento o distribución binomial para datos de resultados binarios). Es importante no solo probar la bondad de ajuste para estas distribuciones, sino también planificar análisis de sensibilidad utilizando otras distribuciones adecuadas. Por ejemplo, para datos continuos, se puede rehacer el análisis asumiendo una distribución Student-T, que es una distribución simétrica en forma de campana como la distribución Normal, pero con colas más gruesas para los datos de recuento, una vez que se puede usar la distribución binomial negativa, que Sería útil para evaluar la solidez de los resultados si se tiene en cuenta la dispersión excesiva [52]. Los análisis bayesianos incluyen de forma rutinaria análisis de sensibilidad para evaluar la solidez de los hallazgos bajo diferentes modelos para los datos y distribuciones previas [58]. Es posible que los análisis basados ​​en métodos paramétricos, que a menudo se basan en supuestos de distribución sólidos, también deban evaluarse para determinar su solidez utilizando métodos no paramétricos. Estos últimos suelen hacer supuestos distributivos menos estrictos. Sin embargo, es esencial tener en cuenta que, en general, los métodos no paramétricos son menos eficientes (es decir, tienen menos poder estadístico) que sus contrapartes paramétricas si los datos se distribuyen normalmente.

Ma et al. realizaron análisis de sensibilidad basados ​​en métodos bayesianos y clásicos para analizar ECA grupales con un resultado binario en el ensayo CHAT. Las similitudes en los resultados después de utilizar los diferentes métodos confirmaron los resultados del análisis primario: la intervención CHAT no fue superior a la atención habitual [10].

Se utilizó un modelo de regresión binomial negativa [52] para analizar datos de resultados discretos de un ensayo clínico diseñado para evaluar la eficacia de un programa de prehabilitación para prevenir el deterioro funcional entre personas mayores físicamente frágiles que viven en la comunidad. El modelo binomial negativo proporcionó un ajuste mejorado a los datos que el modelo de regresión de Poisson. El modelo binomial negativo proporciona un enfoque alternativo para analizar datos discretos donde la dispersión excesiva es un problema [59].

Preguntas frecuentes sobre análisis de sensibilidad

P: ¿Necesito ajustar el nivel general de significancia para realizar análisis de sensibilidad?

R: No. El análisis de sensibilidad es típicamente un re-análisis del mismo resultado usando diferentes enfoques, o diferentes definiciones del resultado, con el objetivo principal de evaluar cómo estos cambios impactan las conclusiones. Esencialmente, todo lo demás, incluido el criterio de significación estadística, debe mantenerse constante para que podamos evaluar si algún impacto es atribuible a los análisis de sensibilidad subyacentes.

P: ¿Tengo que informar todos los resultados de los análisis de sensibilidad?

R: Sí, especialmente si los resultados son diferentes o llevan a una conclusión diferente de los resultados originales, cuya sensibilidad se estaba evaluando. Sin embargo, si los resultados siguen siendo sólidos (es decir, sin cambios), puede ser suficiente una breve declaración a este efecto.

P: ¿Puedo realizar análisis de sensibilidad post hoc?

R: Es conveniente documentar todos los análisis planificados, incluidos los análisis de sensibilidad en el protocolo. a priori. A veces, no se pueden anticipar todos los desafíos que pueden ocurrir durante la realización de un estudio que pueden requerir análisis de sensibilidad adicionales. En ese caso, es necesario incorporar los análisis de sensibilidad anticipados en el plan de análisis estadístico (SAP), que debe completarse antes de analizar los datos. Se necesita una justificación clara para cada análisis de sensibilidad. Esto también puede ocurrir posthoc.

P: ¿Cómo elijo entre los resultados de diferentes análisis de sensibilidad? (es decir, ¿qué resultados son los mejores?)

R: El objetivo de los análisis de sensibilidad no es seleccionar los "mejores" resultados. Más bien, el objetivo es evaluar la solidez o consistencia de los resultados bajo diferentes métodos, subgrupos, definiciones, supuestos, etc. La evaluación de la solidez a menudo se basa en la magnitud, la dirección o la importancia estadística de las estimaciones. No puede utilizar el análisis de sensibilidad para elegir una conclusión alternativa para su estudio. Por el contrario, puede establecer la conclusión basándose en su análisis principal y presentar su análisis de sensibilidad como un ejemplo de cuán seguro está de que representa la verdad. Si el análisis de sensibilidad sugiere que el análisis primario no es sólido, puede apuntar a la necesidad de investigaciones futuras que puedan abordar la fuente de la inconsistencia. Su estudio no puede responder la pregunta que resultados son los mejores? Para responder a la pregunta de qué método es mejor y en qué condiciones, Pueden ser necesarios estudios de simulación que comparen los diferentes enfoques sobre la base del sesgo, la precisión, la cobertura o la eficiencia.

P: ¿Cuándo se debe realizar un análisis de sensibilidad?

R: La posición predeterminada debe ser planificar el análisis de sensibilidad en cada ensayo clínico. Por lo tanto, todos los estudios deben incluir algún análisis de sensibilidad para verificar la solidez de los hallazgos primarios. Todos los métodos estadísticos utilizados para analizar los datos de los ensayos clínicos se basan en suposiciones, que deben probarse siempre que sea posible, y los resultados deben evaluarse para determinar su solidez a través de algunos análisis de sensibilidad. De manera similar, los datos faltantes o las desviaciones del protocolo son ocurrencias comunes en muchos ensayos y es necesario evaluar su impacto en las inferencias.

P: ¿Cuántos análisis de sensibilidad se pueden realizar para un único análisis primario?

R: El número no es un factor importante para determinar qué análisis de sensibilidad realizar. El factor más importante es la justificación para realizar cualquier análisis de sensibilidad. Comprender la naturaleza de los datos y tener cierta experiencia en contenido es útil para determinar qué análisis de sensibilidad realizar y cuántos. Por ejemplo, es poco probable que variar las formas de tratar los datos faltantes cambie los resultados si falta el 1% de los datos. Asimismo, comprender la distribución de ciertas variables puede ayudar a determinar qué puntos de corte serían relevantes. Por lo general, es aconsejable limitar los análisis de sensibilidad al resultado primario. La realización de análisis de sensibilidad múltiple sobre todos los resultados a menudo no es práctica ni necesaria.

P: ¿Cuántos factores puedo variar al realizar análisis de sensibilidad?

R: Idealmente, se puede estudiar el impacto de todos los elementos clave utilizando un diseño factorial, lo que permitiría evaluar el impacto de factores individuales y conjuntos. Alternativamente, se puede variar un factor a la vez para poder evaluar si el factor es responsable del impacto resultante (si lo hubiera). Por ejemplo, en un análisis de sensibilidad para evaluar el impacto de la suposición de Normalidad (análisis asumiendo Normalidad, por ejemplo, prueba T versus análisis sin suponer Normalidad, por ejemplo, basado en una prueba de signo) y valor atípico (análisis con y sin valor atípico), esto se puede lograr mediante diseño factorial 2x2.

P: ¿Cuál es la diferencia entre análisis secundarios y análisis de sensibilidad?

R: Los análisis secundarios suelen ser análisis de resultados secundarios. Al igual que los análisis primarios que se ocupan de los resultados primarios, dichos análisis deben documentarse en el protocolo o SAP. En la mayoría de los estudios, estos análisis son exploratorios, porque la mayoría de los estudios no tienen el poder estadístico para resultados secundarios. Sirven para respaldar que los efectos informados en el resultado primario son consistentes con la biología subyacente. Son diferentes de los análisis de sensibilidad descritos anteriormente.

P: ¿Cuál es la diferencia entre los análisis de subgrupos y los análisis de sensibilidad?

R: Los análisis de subgrupos están destinados a evaluar si el efecto es similar en grupos específicos de pacientes o si está modificado por determinadas características de los pacientes [60]. Si los resultados primarios son estadísticamente significativos, los análisis de subgrupos tienen como objetivo evaluar si el efecto observado es consistente en los subgrupos de pacientes subyacentes, lo que puede verse como una forma de análisis de sensibilidad. En general, para los análisis de subgrupos, uno está interesado en los resultados de cada subgrupo, mientras que en los análisis de "sensibilidad" de subgrupos, uno está interesado en la similitud de los resultados entre los subgrupos (es decir, la solidez entre los subgrupos). Normalmente, los análisis de subgrupos requieren la especificación de la hipótesis y el fundamento del subgrupo, y se realizan mediante la inclusión de un término de interacción (es decir, de la variable de subgrupo x variable de exposición principal) en el modelo de regresión. También pueden requerir un ajuste por alfa, el nivel general de significancia. Además, la mayoría de los estudios no suelen tener el poder estadístico suficiente para realizar análisis de subgrupos.


Discusión

Las herramientas comúnmente utilizadas para analizar datos de dosis-respuesta (como Prism) aún no son capaces de calcular las métricas de GR, que es el mejor método disponible para eliminar sesgos en la medición de la dosis-respuesta de perturbagenos en células en proliferación.El uso de métricas de GR hace posible comparar de manera confiable los datos sobre la potencia y eficacia de los medicamentos en líneas celulares que tienen diferentes tasas de división subyacentes, analizadas para diferentes períodos de tiempo o que crecen a diferentes tasas debido a cambios en las condiciones de cultivo. Con datos procesados ​​correctamente, las herramientas en línea y fuera de línea descritas aquí calculan los valores de GR, ajustan estos valores a una curva sigmoidea, evalúan la importancia del ajuste sigmoidal mediante una prueba F y generan métricas de GR. Para evitar la contaminación de los conjuntos de datos de dosis-respuesta con valores de baja confiabilidad extrapolados de ajustes deficientes, los ajustes de curva no significativos se reemplazan por una línea plana y las métricas de respuesta se establecen en valores predeterminados. Después de calcular las métricas de sensibilidad, los usuarios pueden visualizar los resultados de forma rápida y sencilla, realizar análisis básicos y producir cifras listas para publicación. Basado en R sin conexión GRcalculator Las herramientas están diseñadas para usuarios computacionalmente sofisticados y para aquellos con datos patentados. La elección de R [7] para cálculos de GR en línea y fuera de línea facilita la reutilización de las herramientas existentes para ajustar las curvas de dosis-respuesta [15] y ha permitido la creación de un GRmetrics Paquete Bioconductor [16] para facilitar la integración de métricas de GR dentro de los flujos de trabajo analíticos de R. Por ejemplo, combinando GRmetrics con el PharmacoGx [17] El paquete de bioconductores facilita el uso de métricas de GR en análisis de farmacogenómica.

La reproducibilidad se ha convertido en una preocupación importante en la investigación biomédica contemporánea y el uso de métricas de GR aumenta la reproducibilidad al corregir factores que a menudo están mal controlados en estudios a gran escala que involucran muchas líneas celulares. Estos factores incluyen la densidad de la placa y el número de divisiones celulares [3]. La estandarización de la metodología de ensayo [4] y de las herramientas computacionales y los canales para convertir los datos brutos en resultados finales [5] son ​​esenciales para hacer que la adquisición y el análisis de datos sean consistentes en todos los experimentos. GRcalculator cumple estos requisitos y ayuda a evitar artefactos en el procesamiento de datos. GRcalculator también sirve como depósito de conjuntos de datos de dosis-respuesta a gran escala que se han analizado utilizando el enfoque GR, proporcionando así un conjunto de información confiable y reutilizable para la comunidad. El número de estos conjuntos de datos es actualmente pequeño (principalmente debido a limitaciones en los datos experimentales existentes), pero los datos de dosis-respuesta futuros recopilados por el Programa NIH LINCS se publicarán en GRcalculator y anticipamos que esto también será cierto para otros esfuerzos enfocados en caracterizar las respuestas de las células a la perturbación. Anticipamos un mayor desarrollo del método GR y de otras formas de calcular la respuesta a los medicamentos a lo largo del tiempo [2, 18] y, por lo tanto, actualizaremos el GRcalculator sitio web según sea necesario.


Relaciones dosis-respuesta

Independientemente de cómo se produzca el efecto de un fármaco, a través de la unión o la interacción química, la concentración del fármaco en el sitio de acción controla el efecto. Sin embargo, la respuesta a la concentración puede ser compleja y, a menudo, no lineal. La relación entre la dosis del fármaco, independientemente de la vía utilizada, y la concentración del fármaco a nivel celular es aún más compleja (ver Farmacocinética).

Los datos de dosis-respuesta generalmente se grafican con la dosis o la función de la dosis (p. Ej., Log10 dosis) en el eje xy el efecto medido (respuesta) en el eje y. Dado que el efecto de un fármaco es función de la dosis y el tiempo, dicho gráfico representa la relación dosis-respuesta independientemente del tiempo. Los efectos medidos se registran con frecuencia como máximos en el momento del efecto máximo o en condiciones de estado estacionario (p. Ej., Durante la infusión intravenosa continua). Los efectos de los fármacos se pueden cuantificar a nivel de molécula, célula, tejido, órgano, sistema de órganos u organismo.

Una curva dosis-respuesta hipotética tiene características que varían (consulte la figura Curva dosis-respuesta hipotética):


Preguntas frecuentes

¿Cuál es la estabilidad de la higromicina B en solución?

El antibiótico es estable durante al menos 2 años a 4 ° C. Es estable durante aproximadamente un mes a 37 ° C.

¿De qué color es la solución?

El color puede variar de amarillo claro a marrón oscuro o caramelo. La solución concentrada tiende a tener un aspecto más oscuro.

¿Cuál es la concentración de trabajo para la selección?

La concentración de trabajo para la selección varía con el tipo de célula, el medio, las condiciones de crecimiento y la tasa metabólica celular. La concentración recomendada para la selección de células resistentes es de 25-1000 ug / mL. Las concentraciones comúnmente utilizadas para la selección son 200 ug / mL para células de mamíferos, 20-200 ug / mL para células vegetales y células bacterianas y 200-1000 ug / mL para hongos. Su concentración óptima debe probarse experimentalmente.

¿Cómo pueden las células no transfectadas escapar a la selección de antibióticos?

Las células pueden escapar a la selección si la concentración de antibiótico es demasiado baja o si la densidad celular en la placa es demasiado alta. Además, las células que proliferan rápidamente mueren más rápido que las que proliferan lentamente. Las células de control deben morir dentro de los 5-7 días posteriores a la adición del antibiótico, permitiendo que se formen colonias de células resistentes a los 10-14 días.

¿Cómo determino la concentración tóxica?

Se añade higromicina B al medio de cultivo a una concentración que varía con el tipo de célula transfectada. Por tanto, se puede realizar un experimento de titulación para cada tipo de célula para determinar la cantidad de higromicina B necesaria para matar las células no transfectadas. La concentración de trabajo para la selección de células de mamíferos es normalmente entre 50 ug / mL y 1 mg / mL, Células vegetales: 20-200 ug / mL, Bacterias: 20-200 ug / mL y Hongos: 200 ug-1 mg / mL. Su concentración apropiada debe probarse experimentalmente.

¿Cómo realizo una curva de respuesta a la dosis?

Para determinar la concentración mínima de antibiótico necesaria para matar su línea de células huésped no transfectadas:

    • Pruebe los rangos de concentraciones (5-6) para asegurarse de determinar la concentración mínima necesaria para su línea celular.
    • Siembre las células a aproximadamente un 20-25% de confluencia en el número apropiado de placas para cada placa de tiempo y deje que las células se adhieran durante la noche. Para las células que requieren densidades más altas para su viabilidad, aumente el número de células sembradas.
    • Al día siguiente, sustituya el medio de cultivo por un medio que contenga concentraciones variables del antibiótico.
    • Reponer el medio selectivo cada 3-4 días.
    • Cuente el número de células viables a intervalos regulares para determinar la concentración apropiada de antibiótico que previene el crecimiento de células no transfectadas. Seleccione la concentración que mata a la mayoría de las células en el número de días deseado (generalmente de 7 a 10 días).

¿Cómo mantengo el fenotipo resistente a higromicina de las líneas celulares transfectadas?

Para mantener el fenotipo resistente a higromicina de las líneas celulares transfectadas y para la eliminación de revertientes, las células pueden cultivarse regularmente en medio que contenga higromicina B a la misma concentración utilizada para la selección inicial.

¿Cuándo se requiere el reemplazo de los medios?

El reemplazo del medio de cultivo que contiene higromicina B es necesario solo si las células cultivadas consumen componentes nutricionales. La acidificación del medio de cultivo es normalmente un signo de consumo. El uso de rojo de fenol o medios que contengan rojo de fenol ayudará a detectar la acidificación. En este caso, los medios se volverán amarillos.

¿La higromicina B es sensible a los ácidos?

Es sensible a altas concentraciones de ácidos, sin embargo, una breve exposición a ácidos diluidos no afecta su estabilidad.

¿Podemos aumentar la sensibilidad de nuestras células al antibiótico?

La sensibilidad a la higromicina B se puede incrementar aumentando el pH del medio. La sensibilidad parece ser mayor con concentraciones de sal más bajas.

¿Qué enzima inactiva la higromicina B?

La higromicina fosfotransferasa (hpt) inactiva el antibiótico mediante la fosforilación. El gen de higromicina fosfotransferasa (hpt, hph o aphIV) codifica la higromicina fosfotransferasa y se utiliza como un gen marcador seleccionable para sistemas tanto vegetales como animales.

¿Cuál es el mecanismo de acción de la higromicina B?

El compuesto se une a la subunidad ribosómica 30S y afecta la fidelidad de la traducción.

¿Cómo puedo evaluar aproximadamente la pureza del compuesto?

El color de una solución de higromicina es un buen indicador: cuanto más clara es, más pura. Por lo tanto, los caramelos a las soluciones de color marrón son de calidad inferior. La diferencia de color puede no ser muy dramática con una solución de higromicina de baja concentración recién preparada.

¿Cuál es el espectro de inhibición?

Un antibiótico aminoglucósido que inhibe la síntesis de proteínas en bacterias, hongos y eucariotas superiores. El espectro también se indica como Gram (+), Gram (-) bacilos aerobios y anaerobios facultativos.

¿Es peligrosa la higromicina B?

Si. Se considera un material tóxico y peligroso. Se debe tener cuidado para evitar el contacto con la piel y los ojos. Consulte y revise la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su manipulación.


Ver el vídeo: Curva Dosis-Respuesta (Agosto 2022).