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15.23C: Gonorrea - Biología

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La gonorrea (también conocida coloquialmente como aplauso) es una infección de transmisión sexual humana común causada por la bacteria Neisseria gonorrhoeae.

Objetivos de aprendizaje

  • Describe la gonorrea

Puntos clave

  • Los síntomas habituales de la gonorrea en los hombres son ardor al orinar y secreción del pene.
  • Las mujeres con gonorrea, por otro lado, son asintomáticas la mitad del tiempo o tienen flujo vaginal y dolor pélvico.
  • Si la gonorrea no se trata, puede diseminarse localmente causando epididimitis o enfermedad inflamatoria pélvica o por todo el cuerpo, afectando las articulaciones y las válvulas cardíacas. El tratamiento es comúnmente con ceftriaxona ya que se ha desarrollado resistencia a los antibióticos a muchos medicamentos usados ​​anteriormente.

Términos clave

  • ceftriaxona: Un antibiótico de cefalosporina sintético que se usa para tratar la gonorrea.

La gonorrea (también conocida coloquialmente como aplauso) es una infección de transmisión sexual humana común. Los síntomas habituales en los hombres son ardor al orinar y secreción del pene. Las mujeres, por otro lado, son asintomáticas la mitad del tiempo o tienen flujo vaginal y dolor pélvico. Tanto en hombres como en mujeres, si la gonorrea no se trata, puede diseminarse localmente causando epididimitis o enfermedad inflamatoria pélvica o por todo el cuerpo, afectando las articulaciones y las válvulas cardíacas. El tratamiento es comúnmente con ceftriaxona ya que se ha desarrollado resistencia a los antibióticos a muchos medicamentos usados ​​anteriormente. En 2011, hubo informes de algunas cepas de gonorrea que mostraban resistencia a la ceftriaxona. La mitad de las mujeres con gonorrea son asintomáticas, mientras que otras tienen flujo vaginal, dolor en la parte inferior del abdomen o dolor durante las relaciones sexuales.

Los síntomas masculinos más comunes son la uretritis asociada con ardor al orinar y secreción del pene. Cualquiera de los dos sexos también puede adquirir gonorrea de la garganta al practicar sexo oral con una pareja infectada, generalmente un hombre. Esta infección es asintomática en el 90% de los casos y produce dolor de garganta en el 10% restante. El período de incubación es de 2 a 14 días y la mayoría de estos síntomas ocurren entre 4 y 6 días después de la infección. En raras ocasiones, la gonorrea puede causar lesiones en la piel e infección en las articulaciones (dolor e hinchazón en las articulaciones) después de viajar por el torrente sanguíneo. En muy raras ocasiones puede asentarse en el corazón causando endocarditis o en la columna vertebral causando meningitis (sin embargo, ambos son más probables en personas con el sistema inmunológico debilitado).

PORQUE

La gonorrea es causada por la bacteria Neisseria gonorrhoeae. La infección se transmite de una persona a otra a través del sexo vaginal, oral o anal. Los hombres tienen un 20% de riesgo de contraer la infección por un solo acto de coito vaginal con una mujer infectada. El riesgo para los hombres que tienen sexo con hombres es mayor. Las mujeres tienen un riesgo del 60 al 80% de contraer la infección por un solo acto de coito vaginal con un hombre infectado. Una madre puede transmitir gonorrea a su recién nacido durante el parto; cuando afecta los ojos del bebé, se denomina oftalmía neonatal. No se puede propagar por inodoros o baños.


Gonorrea - Hoja informativa de los CDC (versión detallada)

Las hojas de datos detalladas están destinadas a personas con preguntas específicas sobre enfermedades de transmisión sexual. Las hojas de datos detalladas incluyen recomendaciones específicas de pruebas y tratamientos, así como citas para que el lector pueda investigar el tema con más profundidad.

¿Qué es la gonorrea?

La gonorrea es una enfermedad de transmisión sexual (ETS) causada por una infección del Neisseria gonorrhoeae bacteria. N. gonorrhoeae infecta las membranas mucosas del tracto reproductivo, incluido el cuello uterino, el útero y las trompas de Falopio en las mujeres, y la uretra en las mujeres y los hombres. N. gonorrhoeae también puede infectar las membranas mucosas de la boca, garganta, ojos y recto.

¿Qué tan común es la gonorrea?

La gonorrea es una enfermedad infecciosa muy común. Los CDC estiman que aproximadamente 1.6 millones de nuevas infecciones gonocócicas ocurrieron en los Estados Unidos en 2018, y más de la mitad ocurren entre jóvenes de 15 a 24 años. 1 La gonorrea es la segunda infección bacteriana de transmisión sexual más comúnmente reportada en los Estados Unidos. 2 Sin embargo, muchas infecciones son asintomáticas, por lo que los casos notificados solo capturan una fracción de la verdadera carga.

¿Cómo se contagia la gonorrea?

La gonorrea se transmite a través del contacto sexual con el pene, la vagina, la boca o el ano de una pareja infectada. No es necesario que se produzca eyaculación para que la gonorrea se transmita o se adquiera. La gonorrea también se puede transmitir de manera perinatal de madre a bebé durante el parto.

Las personas que han tenido gonorrea y han recibido tratamiento pueden volver a infectarse si tienen contacto sexual con una persona infectada con gonorrea.

¿Quiénes corren el riesgo de contraer gonorrea?

Cualquier persona sexualmente activa puede infectarse con gonorrea. En los Estados Unidos, las tasas de infección más altas reportadas se encuentran entre los adolescentes sexualmente activos, los adultos jóvenes y los afroamericanos 2.

¿Cuáles son los signos y síntomas de la gonorrea?

Muchos hombres con gonorrea son asintomáticos 3, 4. Cuando están presentes, los signos y síntomas de la infección uretral en los hombres incluyen disuria o una secreción uretral blanca, amarilla o verde que suele aparecer entre uno y catorce días después de la infección 5. En los casos en que la infección uretral se complica con epididimitis, los hombres con gonorrea también pueden quejarse de dolor testicular o escrotal.

La mayoría de las mujeres con gonorrea son asintomáticas 6, 7. Incluso cuando una mujer tiene síntomas, a menudo son tan leves e inespecíficos que se confunden con una infección de la vejiga o la vagina 8, 9. Los síntomas y signos iniciales en las mujeres incluyen disuria, aumento del flujo vaginal o sangrado vaginal entre períodos. Las mujeres con gonorrea corren el riesgo de desarrollar complicaciones graves por la infección, independientemente de la presencia o la gravedad de los síntomas.

Los síntomas de la infección rectal tanto en hombres como en mujeres pueden incluir secreción, picazón anal, dolor, sangrado o evacuaciones intestinales dolorosas 10. La infección rectal también puede ser asintomática. La infección faríngea puede causar dolor de garganta, pero generalmente es asintomática 11, 12.

¿Cuáles son las complicaciones de la gonorrea?

La gonorrea no tratada puede causar problemas de salud graves y permanentes tanto en mujeres como en hombres.

En las mujeres, la gonorrea se puede diseminar al útero o las trompas de Falopio y causar enfermedad inflamatoria pélvica (EIP). Los síntomas pueden ser bastante leves o pueden ser muy graves y pueden incluir dolor abdominal y fiebre 13. La EPI puede provocar abscesos internos y dolor pélvico crónico. La EPI también puede dañar las trompas de Falopio lo suficiente como para causar infertilidad o aumentar el riesgo de embarazo ectópico.

En los hombres, la gonorrea puede complicarse con epididimitis. En casos raros, esto puede provocar infertilidad 14.

Si no se trata, la gonorrea también puede extenderse a la sangre y causar una infección gonocócica diseminada (DGI). La DGI suele caracterizarse por artritis, tenosinovitis y / o dermatitis 15. Esta condición puede poner en peligro la vida.

¿Qué pasa con la gonorrea y el VIH?

La gonorrea no tratada puede aumentar el riesgo de que una persona contraiga o transmita el VIH, el virus que causa el SIDA 16.

¿Cómo afecta la gonorrea a una mujer embarazada y a su bebé?

Si una mujer embarazada tiene gonorrea, puede contagiar la infección a su bebé a medida que el bebé pasa por el canal de parto durante el parto. Esto puede causar ceguera, infección de las articulaciones o una infección de la sangre potencialmente mortal en el bebé 17. El tratamiento de la gonorrea tan pronto como se detecta en mujeres embarazadas reducirá el riesgo de estas complicaciones. Las mujeres embarazadas deben consultar a un proveedor de atención médica para un examen, una prueba y un tratamiento adecuados, según sea necesario.

¿Quién debe hacerse la prueba de gonorrea?

Cualquier persona sexualmente activa puede infectarse con gonorrea. Cualquier persona con síntomas genitales como secreción, ardor al orinar, llagas inusuales o sarpullido debe dejar de tener relaciones sexuales y consultar a un proveedor de atención médica de inmediato.

Además, cualquier persona que tenga una pareja sexual oral, anal o vaginal que haya sido diagnosticada recientemente con una ETS debe consultar a un proveedor de atención médica para una evaluación.

Algunas personas deben hacerse la prueba de gonorrea, incluso si no tienen síntomas o conocen a una pareja sexual que tenga gonorrea 18. Cualquier persona sexualmente activa debe discutir sus factores de riesgo con un proveedor de atención médica y preguntarle si debe hacerse la prueba de gonorrea u otras ETS.

Los CDC recomiendan la detección anual de gonorrea para todas las mujeres sexualmente activas menores de 25 años, así como para las mujeres mayores con factores de riesgo como parejas sexuales nuevas o múltiples, o una pareja sexual que tenga una infección de transmisión sexual.

Las personas que tienen gonorrea también deben someterse a pruebas de detección de otras ETS.

¿Cómo se diagnostica la gonorrea?

La gonorrea urogenital se puede diagnosticar analizando muestras de orina, uretrales (para hombres) o endocervicales o vaginales (para mujeres) mediante la prueba de amplificación de ácido nucleico (NAAT) 19. También se puede diagnosticar mediante cultivo de gonorrea, que requiere muestras de torunda endocervical o uretral.

Si una persona ha tenido sexo oral y / o anal, se deben recolectar muestras de frotis de la faringe o del recto para cultivo o para NAAT (si el laboratorio local ha validado el uso de NAAT para muestras extragenitales) 20.

¿Cuál es el tratamiento para la gonorrea?

La gonorrea se puede curar con el tratamiento adecuado. Los CDC ahora recomiendan una dosis intramuscular única de 500 mg de ceftriaxona para el tratamiento de la gonorrea. Hay regímenes alternativos disponibles cuando la ceftriaxona no puede usarse para tratar la gonorrea urogenital o rectal. Aunque la medicación detendrá la infección, no reparará ningún daño permanente causado por la enfermedad. La resistencia a los antimicrobianos en la gonorrea es una preocupación cada vez mayor y el tratamiento exitoso de la gonorrea es cada vez más difícil 21. Una prueba de curación y una prueba de seguimiento ndash para asegurarse de que la infección se trató con éxito y no es necesaria para las infecciones genitales y rectales; sin embargo, si los síntomas de una persona continúan durante más de unos pocos días después de recibir el tratamiento, debe regresar a un proveedor de atención médica para ser reevaluado. Se necesita una prueba de curación entre 7 y 14 días después del tratamiento para las personas que reciben tratamiento por gonorrea faríngea (infección de la garganta).

Debido a que la reinfección es común, los hombres y mujeres con gonorrea deben volver a hacerse la prueba tres meses después del tratamiento de la infección inicial, independientemente de si creen que sus parejas sexuales fueron tratadas con éxito.

¿Qué pasa con los socios?

Si una persona ha sido diagnosticada y tratada por gonorrea, debe informar a todas sus parejas sexuales anales, vaginales u orales recientes para que puedan ver a un proveedor de salud y recibir tratamiento 20. Esto reducirá el riesgo de que las parejas sexuales desarrollen complicaciones graves a causa de la gonorrea y también reducirá el riesgo de que la persona se vuelva a infectar. Una persona con gonorrea y todas sus parejas sexuales deben evitar tener relaciones sexuales hasta que hayan completado su tratamiento para la gonorrea y hasta que ya no tengan síntomas. Para obtener consejos sobre cómo hablar con sus parejas sobre el sexo y las pruebas de ETS, visite http://www.gytnow.org/talking-to-your-partner external icon.

¿Cómo se puede prevenir la gonorrea?

Los condones de látex, cuando se usan de manera constante y correcta, pueden reducir el riesgo de transmisión de la gonorrea 22. La forma más segura de evitar la transmisión de la gonorrea u otras ETS es abstenerse de tener relaciones sexuales vaginales, anales y orales, o mantener una relación duradera y mutuamente monógama con una pareja que se haya hecho la prueba y se sepa que no está infectada.


Glicanos y glicosaminoglicanos como biomarcadores clínicos y terapéuticos - Parte A

3.2.4 Neisseria gonorrhoeae

N. gonorrhoeae es un importante patógeno de transmisión sexual y un cofactor importante en la infección por VIH-1. Curiosamente N. gonorrhoeae utiliza diferentes receptores celulares y vías de señalización para infectar a mujeres y hombres. N. gonorrhoeae sialila el terminal norte-acetillactosamina presente en su lipooligosacárido (LOS) adquiriendo CMP-Neu5Ac al entrar en células humanas durante la infección. Esto hace que el organismo sea resistente a la muerte por el complemento en el suero humano normal. 106 La infección en los hombres depende de la disponibilidad de un residuo terminal de galactosa en el LOS gonocócico. 107 Por el contrario, la invasión gonocócica de las células epiteliales cervicales primarias no se ve afectada por la sialilación de la estructura LOS. 108 Por lo tanto, norte-Los residuos de acetillactosamina en LOS deben estar libres de Neu5Ac para N. gonorrhoeae para unirse a las células epiteliales uretrales y entrar en ellas durante la infección en los hombres. Las mujeres con infecciones gonocócicas tienen niveles de sialidasas presentes en las secreciones cervicovaginales que pueden resultar en la desialilación de LOS gonocócicos (sialilados), lo que mejora la transmisión exitosa a los hombres. 109


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ETS en mujeres y bebés

Las complicaciones de las infecciones de transmisión sexual afectan de manera desproporcionada a mujeres de todas las edades, con importantes implicaciones para las mujeres en edad reproductiva. Las ETS no diagnosticadas y no tratadas pueden provocar enfermedad inflamatoria pélvica (EPI), embarazo ectópico, así como resultados fetales y neonatales adversos. La morbilidad relacionada con las ETS ocurre de manera desproporcionada en las mujeres por varias razones. Las mujeres son biológicamente más susceptibles que los hombres a contraer algunas ETS y tienen más probabilidades de sufrir complicaciones. También es importante tener en cuenta que las ETS a menudo son asintomáticas en las mujeres, lo que retrasa el diagnóstico y el tratamiento hasta que se produce una complicación sintomática. La salud sexual y reproductiva de una mujer también puede estar interrelacionada con su entorno social, cultural y económico particular, creando las condiciones para conductas sexuales de riesgo. Varios factores, incluido el uso de alcohol o drogas recreativas que inhiben la capacidad de negociar prácticas sexuales más seguras, la disminución del poder de género, los altos niveles de concurrencia, la pobreza, la falta de vivienda o la vivienda inestable y la violencia de pareja pueden contribuir a los desafíos que enfrentan las mujeres para proteger a sus hijos. bienestar sexual. 1-5 En algunas circunstancias, mantener la relación con una pareja puede tener una prioridad más alta que la reducción del riesgo de ETS, lo que afecta su salud reproductiva, así como la salud de su bebé por nacer. 6 Una mujer también puede correr riesgo de contraer una ETS a través del encuentro sexual de su pareja y su pareja con una pareja infectada. En consecuencia, incluso una mujer que solo tiene una pareja puede verse obligada a practicar sexo más seguro, como el uso de condones. 7

Impacto en las mujeres y la fertilidad

Virus del papiloma humano

El virus del papiloma humano (VPH) es una infección de transmisión sexual común en los Estados Unidos.8,9 Aunque la mayoría de las infecciones por VPH en mujeres parecen ser transitorias y pueden no dar lugar a secuelas clínicamente significativas, 10 las infecciones de tipo VPH de alto riesgo pueden causar cambios anormales en el epitelio cervical uterino, 10,11 que se detectan mediante un examen citológico de Frotis de Papanicolaou (Papanicolaou). 12 Las infecciones persistentes del tipo VPH de alto riesgo pueden dar lugar a precursores del cáncer de cuello uterino, que si no se detectan pueden provocar cáncer, 11 y el tratamiento por escisión de las lesiones del cuello uterino puede aumentar el riesgo de un parto prematuro en el futuro. 13 Otras infecciones de tipo VPH de bajo riesgo pueden causar verrugas genitales, 11,14 anomalías en la prueba de Papanicolaou de bajo grado, 11,15 papilomas laríngeos, 16 y, en raras ocasiones, papilomatosis respiratoria recurrente en niños nacidos de madres infectadas. 17,18

A partir de 2006, las vacunas contra el VPH se han recomendado para uso rutinario en mujeres estadounidenses de 11 y 12 años, con vacunación de recuperación hasta los 26 años. 19,20 La vacunación contra el VPH también se ha recomendado para uso rutinario en hombres desde 2011. 20-23 En En octubre de 2018, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) extendió la aprobación de la licencia de la vacuna para mujeres y hombres de 27 y 45 años, 24 y en junio de 2019 el Comité Asesor de Prácticas de Inmunización (ACIP) de los CDC y rsquos recomendó que los adultos no vacunados de 27 y 45 años discutieran la posibilidad de recibir la vacuna. Vacuna contra el VPH con sus proveedores de atención médica. 23 Para obtener más información sobre la vacunación contra el VPH, consulte Otras ETS.

Un metaanálisis reciente que incluyó datos de más de 60 millones de personas de 14 países de ingresos altos, incluido Estados Unidos, mostró un impacto sustancial de la vacuna contra el VPH en las infecciones genitales por VPH y las verrugas anogenitales entre las adolescentes y mujeres jóvenes, y de alto grado. lesiones cervicales entre mujeres jóvenes. 25 Se ha estimado la prevalencia cervical de cualquier tipo de vacuna tetravalente contra el VPH para mujeres civiles, no institucionalizadas, de 14 y 34 años de edad utilizando datos de la Encuesta Nacional de Examen de Salud y Nutrición (NHANES). 26 La prevalencia disminuyó significativamente desde 2003 & ndash2006 (la era anterior a la vacuna) hasta 2011 & ndash2014 en muestras de mujeres de 14 & ndash19 años y 20 & ndash24 años, los grupos de edad con más probabilidades de beneficiarse de la vacunación contra el VPH. Para obtener más información sobre las infecciones por VPH, consulte Otras ETS.

Clamidia

Las infecciones por clamidia en las mujeres suelen ser asintomáticas y es necesario realizar un cribado para identificar la mayoría de las infecciones. Los CDC recomiendan la detección sistemática de clamidia en mujeres jóvenes sexualmente activas desde 1993. 27 Las tasas de casos notificados de clamidia entre mujeres aumentaron de manera constante desde principios de la década de 1990, lo que probablemente refleje una mayor cobertura de detección y el uso de pruebas de diagnóstico más sensibles (Tabla 1) . Durante 2011 y 2013, las tasas de casos de clamidia disminuyeron de 643,4 a 619,0 casos por 100.000 mujeres y luego aumentaron un 11,9% durante los próximos cinco años, lo que resultó en una tasa de 692,7 casos por 100.000 mujeres en 2018 (Figura 1, Tabla 4).

Las tasas de clamidia son más altas entre las mujeres jóvenes, la población destinataria de la detección (Figuras 5 y 6, Tabla 10). Durante 2017 y ndash2018, las tasas de casos de clamidia notificados aumentaron un 1,3% y un 0,8% entre las mujeres de 15 a 19 años y de 20 a 24 años, respectivamente (Figura 6). A nivel regional, entre todas las mujeres, las tasas de casos de clamidia fueron más altas entre las mujeres del sur, con una tasa de 744,2 casos por cada 100.000 mujeres en 2018 (Tabla 4). Las tasas de casos notificados de clamidia excedieron las tasas de casos de gonorrea entre las mujeres en todas las regiones (Figuras A y C, Tablas 4 y 15).

Positividad de clamidia en poblaciones seleccionadas

La Red de Vigilancia de ETS (SSuN) es una colaboración continua de los departamentos de salud estatales, del condado y de la ciudad de 10 jurisdicciones participantes donde se recopilan datos demográficos, clínicos y de laboratorio de mujeres de 15 y 44 años que asisten a instalaciones que brindan servicios de planificación familiar y salud reproductiva ( Consulte la Sección A2.2 del Apéndice). Sin embargo, en el verano de 2018, la recopilación de datos en estos entornos clínicos terminó y los resultados presentados aquí solo incluyen datos obtenidos de enero a junio de 2018. La Figura B muestra las pruebas de clamidia y la positividad informada solo entre las instalaciones que evaluaron a más de 100 mujeres y más de 60% de mujeres jóvenes de 14 y 24 años. En 2018, la positividad general de clamidia entre mujeres de 14 y 24 años fue del 9,8%, pero para las mujeres de 14 y 19 años, la positividad de clamidia fue del 10,5%. Para las mujeres entre las edades de 14 y 24 años, la positividad de la clamidia entre los negros no hispanos fue aproximadamente 1,5 veces mayor que la de los blancos no hispanos o los hispanos.

Gonorrea

Al igual que la clamidia, la gonorrea suele ser asintomática en las mujeres. Por lo tanto, la detección de gonorrea es una estrategia importante para la identificación de gonorrea entre las mujeres. Los programas de detección a gran escala de la gonorrea en mujeres comenzaron en la década de 1970. Después de un aumento inicial en los casos detectados a través de exámenes de detección, las tasas de casos de gonorrea notificados tanto para mujeres como para hombres disminuyeron de manera constante a lo largo de la década de 1980 y principios de la de 1990, y luego disminuyeron más gradualmente a fines de la década de 1990 y la de 2000. Sin embargo, más recientemente, ha habido aumentos en el total de casos (Figura 14, Tabla 1).

Después de alcanzar un mínimo de 40 años en 2009 (104,5 casos por cada 100.000 mujeres), la tasa de casos notificados de gonorrea en mujeres aumentó ligeramente cada año durante 2009 y ndash2011, y luego disminuyó durante 2012 y 2014 (Figura 18). Durante 2015 y 2018, la tasa de gonorrea entre las mujeres aumentó un 37,2% a 145,8 casos por cada 100.000 mujeres (Figura 18, Tabla 15).

La tasa de casos de gonorrea entre las mujeres fue ligeramente más alta que la tasa entre los hombres durante 2009 y 2012; sin embargo, la tasa entre los hombres fue más alta que la tasa entre las mujeres durante 2013 y 2018 (Figura 18, Tablas 15 y 16). Durante 2014 y ndash2018, las tasas de gonorrea entre las mujeres fueron más altas entre las de 15 y 24 años (Figura 20, Tabla 21). Para las mujeres en este grupo de edad, las tasas fueron más altas entre las jóvenes de 19 años en 2018 (877,3 casos por cada 100.000 mujeres) (Tabla 23A).

Enfermedad pélvica inflamatoria

Los datos de los estudios sugieren que hasta el 10% de las infecciones por clamidia no tratadas progresan a una EPI diagnosticada clínicamente y el riesgo de infección gonocócica no tratada puede ser incluso mayor. 28-30 La EPI es una preocupación importante porque puede provocar inflamación y daño a las trompas de Falopio, lo que aumenta el riesgo de infertilidad y embarazo ectópico. La infertilidad por factor tubárico se encuentra entre las causas más comunes de infertilidad, y representa el 30% de la infertilidad femenina en los Estados Unidos, 31 y gran parte de este daño se debe a episodios previos de EPI. 32 Una importante medida de salud pública para prevenir la EPI y, en última instancia, la infertilidad por factor tubárico, es mediante la prevención y el control de la Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae. Se ha demostrado que las estrategias para mejorar la detección temprana y el tratamiento de la clamidia, como se demostró en ensayos controlados aleatorios, 29,33 reducen el riesgo de EPI de una mujer y, en última instancia, protegen la fertilidad de la mujer.

Es difícil obtener estimaciones precisas de la EIP y la infertilidad por factor tubárico resultante de infecciones por clamidia y gonocócicas, en parte porque los diagnósticos definitivos de estas afecciones pueden ser complejos. El Índice Nacional Terapéutico y de Enfermedades (NDTI, consulte la Sección A2.5 en el Apéndice) proporciona estimaciones de las visitas iniciales a médicos privados en el consultorio para la EIP. El NDTI estimó que durante 2007 y ndash2016 el número de visitas iniciales a dichos médicos por EPI entre las mujeres de 15 a 44 años disminuyó en un 38,3% de 146.000 a 90.000 visitas (Figura D). Se han observado disminuciones similares en los datos representativos a nivel nacional de las visitas al departamento de emergencias (ED) del Proyecto de Utilización y Costos de Atención Médica (HCUP), la mayor recopilación de datos de servicios ambulatorios, de pacientes hospitalizados y de servicios ambulatorios a nivel de encuentro con todos los pagadores en los Estados Unidos. Según un análisis que utilizó HCUP & rsquos Nationwide Emergency Department Sample (NEDS), el porcentaje de visitas al ED con un diagnóstico de EIP disminuyó durante 2006 y ndash2013 entre las mujeres de 15 y 44 años, con las mayores disminuciones entre las mujeres de 15 y 19 años (Figura E). 34 No está del todo claro qué puede estar impulsando estos descensos, aunque se han sugerido varios factores, incluida la identificación y el tratamiento tempranos de la infección por clamidia y gonorrea y la disponibilidad de terapias de dosis única que aumentan la adherencia al tratamiento. 35-37 Si bien la EPI está disminuyendo a nivel nacional, sigue siendo una de las principales causas de morbilidad en las mujeres.

En investigaciones anteriores se han observado diferencias en el diagnóstico de EPI de por vida autoinformado por raza / etnia hispana en mujeres en edad reproductiva. 38 Los datos del ciclo 2013 & ndash2014 de NHANES indican que las mujeres negras no hispanas y las blancas no hispanas que informaron un diagnóstico previo de ITS tenían una prevalencia de EIP durante la vida autoinformada casi igual (10,3% frente a 10,0%) (Figura F). 39 Sin embargo, la prevalencia de por vida de la EPI entre las mujeres negras no hispanas fue 2,2 veces mayor que entre las mujeres blancas no hispanas si no se diagnosticó una ITS previa (6,0% frente a 2,7%). Estos hallazgos sugieren que la EPI está asociada con diagnósticos previos de ITS y, por lo tanto, es importante que los médicos examinen a las pacientes en busca de clamidia y gonorrea para reducir la incidencia de EPI. Las disparidades raciales observadas en los diagnósticos de EPI son consistentes con las marcadas disparidades raciales observadas para la clamidia y la gonorrea. Sin embargo, debido a los métodos subjetivos mediante los cuales se diagnostica la EIP, los datos de disparidad racial deben interpretarse con precaución.

Impacto en el embarazo y los resultados fetales

Las infecciones de transmisión sexual implicadas en los resultados adversos del embarazo son amplias e incluyen infecciones virales, bacterianas y protozoarias. El espectro de resultados reproductivos después de las ITS no solo amenaza la salud de las mujeres y su capacidad para reproducirse, sino que puede extenderse a efectos perjudiciales sobre el feto y los recién nacidos de las personas infectadas. El acceso a la atención y la capacidad del proveedor para evaluar el riesgo, detectar y tratar las ITS son factores críticos para mejorar los resultados obstétricos.

Embarazo ectópico

El embarazo ectópico, definido como la implantación de un óvulo fertilizado en cualquier tejido que no sea el revestimiento del útero, es una afección potencialmente mortal que requiere una evaluación y tratamiento inmediatos. La capacidad de determinar el número de embarazos ectópicos que ocurren en los Estados Unidos se ha visto afectada por un cambio en el manejo clínico de un evento hospitalario a uno ambulatorio, lo que hace que las fuentes de datos de vigilancia hospitalaria no sean confiables. Como resultado, se han utilizado métodos de vigilancia alternativos, incluidos datos de grandes reclamaciones administrativas, 39,40 o departamentos de emergencia para evaluar las tendencias y evaluar la carga continua de salud pública de esta afección. Los datos de MarketScan Commercial Claims and Encounters Database, una gran base de datos de reclamos administrativos de planes de salud comerciales de los Estados Unidos, indican que la proporción de diagnósticos de embarazo ectópico a todos los nacidos vivos entre las mujeres con nacidos vivos de 15 y 44 años durante el período de 2006 y 2017 ha aumentado marginalmente en todo todos los grupos de edad (Figura G). Como en años anteriores, en 2017, las tasas de embarazo ectópico fueron más altas entre las mujeres en los grupos de edad de 35 y 44 años.

Conjuntivitis neonatal

Infección materna con C. trachomatis o N. gonorrhoeae también puede afectar al lactante, dando lugar a infecciones por conjuntivitis (denominada oftalmía neonatal en las primeras cuatro semanas de vida) y, en el caso de C. trachomatis , neumonía. Aunque la profilaxis tópica de los lactantes durante el parto puede ser eficaz para la prevención de la oftalmía neonatal gonocócica, la prevención de la neumonía neonatal requiere detección y tratamiento prenatal. La presentación clínica de la conjuntivitis puede ser variable y estas infecciones son especialmente importantes para tratarlas con prontitud, ya que pueden conducir a una discapacidad visual. 41

Durante 2014 & ndash2018, se notificaron a los CDC 438 casos de clamidia o gonorrea entre bebés de & lt1 año con una fuente de muestra de & lsquoeye & rsquo o & lsquoconjunctiva & rsquo (infecciones por conjuntivitis). La tasa global notificada de conjuntivitis por clamidia en lactantes fue relativamente estable durante 2014 y 2018, con un rango de 1,4 a 2,3 casos por 100.000 nacidos vivos (Figura H). De manera similar, la tasa de conjuntivitis gonocócica en bebés se mantuvo relativamente constante y baja durante 2014 y 2018, con un rango de 0,2 a 0,4 casos por 100.000 nacidos vivos. La tasa de casos notificados está muy influenciada por la integridad de los datos notificados sobre la fuente de la muestra. De todos los casos notificados a los CDC de clamidia o gonorrea en bebés de & lt1 año durante 2014 & ndash2018 (n = 2,348), el 81,3% no tenía una fuente de muestra de & lsquoeye & rsquo o & lsquoconjuntiva & rsquo de ellos, el 62,3% tenía una fuente de muestra de & lsquounknown & rsquo (46,6%) ), & lsquoother-not specified & rsquo (10,6%), o faltaba (5,1%). Al evaluar las tasas que incluyen estos casos, la tasa de infecciones por clamidia y gonorrea sigue tendencias similares pero es más alta en todos los años, lo que indica posibles casos omitidos para la vigilancia (Figura H).

Sífilis congénita

La sífilis es un factor de riesgo importante para los resultados adversos del embarazo. Las consecuencias de una infección materna no tratada pueden incluir muerte fetal e infantil, parto prematuro e infección congénita en una proporción de los bebés sobrevivientes, lo que resulta en discapacidades del desarrollo tanto físicas como mentales. La mayoría de los casos de sífilis congénita se pueden prevenir si las mujeres se someten a pruebas de detección de sífilis y reciben tratamiento temprano durante la atención prenatal.

Las tendencias de la sífilis congénita suelen reflejar las tendencias de la sífilis primaria y secundaria (P & ampS) entre las mujeres en edad reproductiva. Después de estabilizarse a una tasa relativamente baja (0,9 casos por 100.000 mujeres) durante 2011 & ndash2013, la tasa de casos notificados de sífilis P & ampS entre todas las mujeres ha aumentado cada año desde entonces (Figura 49). Durante 2014 y 2018, la tasa entre las mujeres aumentó un 172,7%, de 1,1 a 3,0 casos por cada 100.000 mujeres (Tabla 28). Durante este mismo período, la tasa entre las mujeres en edad reproductiva (mujeres de 15 y 44 años) aumentó un 165,4%, de 2,6 a 6,9 casos por 100.000 mujeres de 15 y 44 años (Figura 49).

De manera similar, la tasa de casos notificados de sífilis congénita ha aumentado cada año desde 2012 (Tabla 1). En 2018, se notificaron 1.306 casos de sífilis congénita, con una tasa de 33,1 casos por cada 100.000 nacidos vivos, la tasa más alta registrada desde 1995. Este aumento en 2018 representa un aumento del 39,7% con respecto a 2017 y un aumento del 291,0% con respecto a 2012 (Cuadro 41).

En 2018, las tasas más altas de casos notificados de sífilis P & ampS entre las mujeres y las tasas más altas de casos notificados de sífilis congénita se observaron en Occidente y en el Sur (Figuras I y J, Tablas 28 y 41). La tasa de sífilis P & ampS entre las mujeres aumentó en todas las regiones durante 2017 y 2018. Durante 2017 y 2018, el mayor aumento de la tasa entre las mujeres se produjo en el oeste (41,2%), seguido por el noreste (40,0%), el sur (30,8%) y el medio oeste (30,8%) (Tabla 28). La tasa de sífilis congénita aumentó 49,5% en el sur, 44,1% en el noreste, 30,5% en el medio oeste y 29,3% en el oeste durante 2017 y 2018 (Tabla 41).

Aunque la mayoría de los casos de sífilis congénita ocurren entre bebés cuyas madres han recibido algún tipo de atención prenatal, la atención prenatal tardía o limitada se ha asociado con la sífilis congénita. El hecho de que los proveedores de atención médica no se adhieran a las recomendaciones de detección prenatal de sífilis, así como la adquisición de una infección durante el embarazo después de la prueba de detección inicial, también contribuyen a la aparición de sífilis congénita.

Virus del herpes simple neonatal

El virus del herpes simple (VHS) se encuentra entre las infecciones de transmisión sexual más prevalentes, 8 y puede tener graves consecuencias para las mujeres embarazadas y sus bebés. 42 La mayoría de las infecciones genitales por HSV en los Estados Unidos son causadas por HSV tipo 2 (HSV-2), mientras que las infecciones por HSV tipo 1 (HSV-1) son típicamente orolabiales y se adquieren durante la niñez. 43,44 Los datos de NHANES muestran que la seroprevalencia de HSV-1 ha disminuido significativamente entre los adolescentes, lo que indica una disminución de la infección bucolabial 44 La seroprevalencia de HSV-2 en este grupo de edad fue mucho menor. 44 Aquellos que carecen de anticuerpos contra el HSV-1 en el inicio sexual son más susceptibles a la infección genital por HSV-1, 44,45 y también tienen un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad sintomática por una infección genital por HSV-2 recién adquirida (es decir, primaria). 46 Por lo tanto, es cada vez más probable que las mujeres jóvenes adquieran por primera vez la infección por HSV-1 genitalmente, o adquieran una infección genital primaria por HSV-2, durante la edad fértil 45,47 El primer episodio de infección genital primaria por HSV durante el embarazo aumenta el riesgo de padecer infecciones neonatales. Transmisión del VHS, 45,48 particularmente si la madre adquiere la infección hacia el final de su embarazo. 45,49 Otro análisis de los datos de NHANES encontró que entre las mujeres embarazadas con tres o menos parejas sexuales de por vida, la seronegatividad tanto para HSV-1 como para HSV-2 aumentó de 1999 & ndash2006 a 2007 & ndash201450, lo que aumenta la posibilidad de que las mujeres embarazadas con menos parejas sexuales puedan tener mayor riesgo de adquirir HSV genital durante el embarazo y transmitir HSV verticalmente a sus recién nacidos. Para obtener más información sobre las infecciones genitales por VHS, consulte Otras ETS.

Las infecciones neonatales por VHS, aunque relativamente raras, causan una morbilidad y mortalidad significativas. 42 El herpes neonatal puede ser una enfermedad grave que se presenta con lesiones vesiculares en la piel, ojos o boca, convulsiones, colapso respiratorio y / o insuficiencia hepática, después del contacto con secreciones cervicales o vaginales infectadas durante el parto. 42,49 La mayoría de las infecciones neonatales por VHS son el resultado de la transmisión perinatal de la madre al recién nacido, 49 pero puede producirse una infección posnatal. 51 Aunque en algunas jurisdicciones se requiere la notificación de la infección neonatal por VHS, 52,53 no es una enfermedad de notificación obligatoria a nivel nacional.

Un examen de los registros de pacientes hospitalizados de bebés de 60 días o menos en el momento de la admisión utilizando la base de datos de pacientes hospitalizados (KID) de HCUP Kid & rsquos mostró una incidencia general de 9,6 casos por cada 100.000 nacidos vivos en 2006. 54 Las tasas no variaron significativamente por región o raza / hispano Sin embargo, la prevalencia fue significativamente mayor entre los casos en los que el pagador primario esperado era Medicaid (15,1 casos por 100.000 nacidos vivos) en comparación con el seguro privado o la atención médica administrada (5,4 casos por 100.000 nacidos vivos). Un estudio reciente que utilizó la Muestra Nacional de Pacientes Internos (NIS) de HCUP encontró que la incidencia de infección por VHS neonatal por cada 100.000 nacidos vivos aumentó significativamente de 2003 a 2014, de 7,9 durante 2003 & ndash2005 a 10,0 durante 2012 & ndash2014. 55

En la ciudad de Nueva York, se identificaron 76 casos de infección neonatal por VHS mediante vigilancia poblacional durante un período de 4,5 años (abril de 2006 y septiembre de 2010), con una incidencia anual media de 13,3 casos por 100.000 nacidos vivos. 47 El 41% de los casos confirmados estaban infectados con HSV-1.Una revisión de los certificados de defunción o mortinato emitidos en la ciudad de Nueva York durante 1981 y 2013 identificó 34 muertes debido a la infección neonatal por VHS, o 0,82 muertes por cada 100.000 nacidos vivos. 53

Resumen

Las ETS son una prioridad sanitaria importante y su morbilidad y mortalidad sustanciales relacionadas con las secuelas a menudo pueden pasarse por alto en las mujeres. Esto es particularmente cierto para las mujeres en edad reproductiva y sus bebés. La tasa general de casos notificados de clamidia femenina ha aumentado un 11,4% en los últimos cuatro años, gran parte de la cual se atribuye al aumento de las pruebas de detección y la notificación nacional más completa. Las infecciones por gonorrea entre las mujeres también han aumentado un 45,2% a 145,8 casos por cada 100.000 mujeres en los últimos años. Los datos de vigilancia continúan mostrando que la cantidad y las tasas de casos de clamidia y gonorrea son más altas en mujeres entre las edades de 15 y 24, y ciertas razas / etnias se ven afectadas de manera desproporcionada. A pesar de los aumentos en los casos notificados de clamidia y gonorrea, los datos disponibles sugieren una disminución general en la incidencia de EPI, atribuida en gran medida a un aumento en la detección y el tratamiento eficaces de las infecciones por clamidia y gonorrea en adolescentes y mujeres jóvenes. En contraste con la disminución de las tasas de EPI, los datos sugieren que las tasas de embarazo ectópico han aumentado marginalmente con el tiempo.

La transmisión de las ETS de madre a hijo puede tener graves consecuencias adversas. Los posibles resultados neonatales adversos incluyen oftalmía neonatal, neumonía neonatal y prematuridad. La tasa de sífilis congénita en los Estados Unidos ha aumentado cada año desde 2013. En 2018, se notificaron 935 casos de sífilis congénita y la tasa nacional de sífilis congénita fue de 23,7 casos por cada 100.000 nacidos vivos, la tasa más alta en dos décadas. A pesar de las pruebas de detección de ETS recomendadas actualmente durante el embarazo, es posible que algunas mujeres no reciban tratamiento para sus infecciones durante el embarazo debido a la falta o la atención prenatal limitada.


Resultados

Purificación de norte. Gonorrhoeae OMV

Estudiar el papel de norte. Gonorrhoeae OMV secretadas, primero establecimos métodos para la purificación de OMV en condiciones óptimas de crecimiento para minimizar la autólisis bacteriana y la contaminación con materiales membranosos y citosólicos, todos los cuales se ven afectados por las condiciones de cultivo [30]. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM) de norte. Gonorrhoeae recolectados de cultivos de fase logarítmica media demostraron que la membrana bacteriana permanecía en gran parte intacta (Fig. 1A). TEM y SEM también detectaron vesículas que parecían estrechamente asociadas con la membrana externa de norte. Gonorrhoeae y emergiendo de la superficie bacteriana (Fig. 1A). OMV recopilados de norte. Gonorrhoeae los medios de crecimiento por centrifugación contenían membranas intactas y variaban en tamaño (20-200 nm de diámetro), forma (de esférica a tubular) y en el número de membranas (mono o bicapas) de dos cepas diferentes (Fig 1B). Las OMV granuladas también contenían partículas densas en electrones, que pueden reflejar agregados de proteínas (Fig. 1B). Para purificar aún más las OMV con una composición definida y un tamaño uniforme de los sobrenadantes de cultivo, empleamos gradientes OptiPrep del 25 al 50%. Después de la centrifugación, las fracciones 4, 5 y 6 contenían varias proteínas en las que la proteína dominante era probablemente la porina de la membrana externa, PorB, según el peso molecular y la detección inmune con suero anti-PorB (Fig 1C). El análisis TEM de las fracciones 4, 5 y 6 contenía OMV con un tamaño uniforme de 50-100 nm de diámetro y una sola bicapa en ausencia de restos celulares (Fig. 1D). Por el contrario, las fracciones 1-3 y 7-10 contenían estructuras densas en electrones, así como vesículas de membrana con diferentes formas y tamaños (Fig. 1D). Para el análisis posterior, las fracciones 4, 5 y 6 se obtienen de la fase logarítmica norte. Gonorrhoeae Los cultivos después de la ultracentrifugación OptiPrep se utilizaron como poblaciones altamente enriquecidas de OMV intactas, mientras que las vesículas totales de los sobrenadantes de cultivo se designaron como preparaciones de OMV crudas.

(A) norte. Gonorrhoeae La MS11-A se analizó mediante microscopía electrónica (EM) de transmisión (paneles superiores) y de barrido (paneles inferiores). Las flechas indican OMV. Barra de escala = 0,5, 0,2 y 0,1 μm. (B) Las preparaciones crudas de OMV de cultivos FA1090 y MS11-A se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (los paneles de la derecha muestran imágenes de mayor aumento) (C) norte. Gonorrhoeae Las OMV derivadas de MS11-A se fraccionaron mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad OptiPrep y se analizaron 11 fracciones y proteínas mediante tinción de coomassie coloidal. Densitometría de la banda prominente que corresponde a PorB (mostrada en la parte superior). Análisis de inmunotransferencia de cada una de las fracciones probadas con anti-PorB (abajo). Los marcadores de peso molecular (kDa) se indican a la izquierda. (D) Imágenes TEM de las fracciones agrupadas teñidas negativamente del gradiente de densidad OptiPrep como se indica en la parte inferior. Barra de escala = 0,2 μm.

Las proteínas se enriquecen u omiten selectivamente en norte. Gonorrhoeae OMV secretadas

Las OMV se originan en las membranas externas bacterianas [23]. Para determinar si el contenido de proteínas de las OMV purificadas se comparte con las membranas externas en norte. Gonorrhoeae, las membranas interna y externa se separaron mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa discontinua. Las fracciones 10 y 5 se enriquecieron para las membranas externa e interna, respectivamente, ya que contenían proteínas de membrana externa PorB y BamA (fracción 10) y la proteína de membrana interna F1β (fracción 5) (figura 2A). El análisis de inmunotransferencia confirmó que las proteínas de la membrana externa, BamA y PorB, están presentes en la OMV purificada y en las fracciones de la membrana externa, mientras que F1β fue detectable en las fracciones de la membrana interna pero ausente de las fracciones de la membrana externa de dos diferentes norte. Gonorrhoeae cepas (Fig 2B). Esto confirma que las proteínas de la membrana externa son componentes principales de las OMV. Sin embargo, las proporciones relativas de proteínas identificadas con la tinción de coomassie coloidal indicaron diferencias en la composición de proteínas específicas de la membrana externa y las OMV (Fig. 2C). Esto incluye tanto la sobrerrepresentación como la ausencia selectiva de diferentes proteínas. En general, esto demuestra que las OMV secretadas por norte. Gonorrhoeae comparten proteínas con la membrana externa, pero la composición proteica relativa de las OMV difiere de la membrana externa.

(A) Membranas totales de norte. Gonorrhoeae se separaron mediante ultracentrifugación en gradiente de sacarosa y las fracciones se sondaron con anti-PorB y anti-BamA para detectar fracciones con membranas externas y anti-F1-β con membranas internas. Las fracciones 10 y 5 se usaron como fracciones de membrana externa e interna, respectivamente, en análisis posteriores. (B) Las OMV, la membrana externa (OM), la membrana interna (IM), la membrana total (TM) y el lisado bacteriano completo (WBL) se sondaron en busca de dos proteínas de la membrana externa (BamA y PorB) y la proteína de la membrana interna, F1-β. (C) Tinción de coomassie coloidal de proteínas de norte. Gonorrhoeae vesículas de membrana externa secretadas (OMV), membrana externa (OM) y membrana interna (MI). Las posiciones de los marcadores de tamaño molecular (kDa) se muestran a la izquierda. PorB (36 kDa) se indica a la derecha y las proteínas sobrerrepresentadas en las OMV mediante asteriscos.

El proteoma de purificado norte. Gonorrhoeae OMV secretadas

Para obtener información sobre la función de norte. Gonorrhoeae OMV, determinamos el contenido de proteína con más detalle mediante espectrometría de masas. Esto identificó 110 proteínas con alta confianza en las OMV purificadas, en comparación con 291 en las fracciones de OMV crudas de los sobrenadantes de cultivo (Tabla S1). Sobre la base de la participación porcentual de los espectros de masas de los péptidos identificados, las 25 proteínas más abundantes (que constituyen el 75% del espectro total de péptidos emparejados) identificadas en la preparación de OMV purificada se enumeran y representan en la Fig. 3A. Los espectros de MS / MS emparejados con péptidos PorB agregaron hasta un 35% de los espectros emparejados con péptidos de todas las proteínas identificadas en la preparación de OMV purificada y PorB fue la proteína más dominante basada en el recuento espectral, seguida de las proteínas P.III y Opa (opacidad). Este conocido grupo de norte. Gonorrhoeae Las proteínas de la membrana externa comprendían la mayoría (

60%) de todos los espectros coincidentes de péptidos derivados de OMV (Fig. 3A). Las OMV contenían proteínas de la membrana externa adicionales, incluida la proteína de adhesión MafA, la maquinaria de ensamblaje de barril β BamA, las proteínas de división celular FtsN y AmiC, pero también varias proteínas periplásmicas (por ejemplo, SurA, NlpD, NlpA y metalopeptidasa). Algunas proteínas citoplasmáticas muy abundantes, como GroEL, la proteína ribosómica S2 30S y el factor de elongación Tu estaban presentes (Fig. 3A, Tabla S1). Además, detectamos 10 proteínas no caracterizadas en OMV purificadas (Tabla S1). En contraste, la fracción de OMV cruda contenía proteínas adicionales asociadas con la formación de pili y fimbrias, maquinaria de traducción y transcripción, transporte, así como proteínas de unión al hierro y catalasa citosólica (Tabla S1).

(A) Proteoma de purificado norte. Gonorrhoeae Las OMV de MS11-A identificadas por LC-MS / MS abundancia relativa basada en espectros de péptidos emparejados. (B) Localización subcelular prevista del número de proteínas identificadas en OMV purificadas y crudas. (C) Localización subcelular prevista de proteínas identificadas en OMV purificadas y crudas en función de la abundancia relativa de péptidos identificados. (D) El porcentaje relativo de proteínas que contienen péptidos señal en OMV purificados y crudos, según el análisis de SignalP v.4.1. (E) Todas las proteínas identificadas en las OMV purificadas se clasificaron funcionalmente según la base de datos COG utilizando el servidor WebMGA.

El análisis comparativo de la localización subcelular de proteínas reveló que se excluyen casi 100 proteínas citoplasmáticas después de la purificación de OMV (Fig. 3B y Tabla S2). Además, solo se identificó una supuesta proteína de la membrana interna (D1DJS8, anotada como "sulfatasa") en las OMV purificadas en comparación con 24 proteínas de la membrana interna en las fracciones crudas (Fig. 3B y Tabla S1). De manera similar, se identificaron 6 y 16 proteínas de localización subcelular desconocida en la preparación de OMV purificada y cruda, respectivamente (Fig. 3B). Además, la anotación para la localización subcelular de la proteína identificada en OMV purificados y crudos basada en la abundancia relativa de péptidos identificados reveló que la mayoría de las proteínas en las preparaciones de OMV purificadas se derivan de las membranas externas, que comprenden el 55% del proteoma total de OMV. En particular, las proteínas de la membrana externa constituían solo el 33% de las proteínas totales identificadas en la preparación de OMV cruda (Fig. 3C). La purificación de OMV también aumentó la abundancia relativa de proteínas que contienen señales de secreciones canónicas (38% en comparación con 28% en preparaciones de OMV crudas) (Fig. 3D). Finalmente, se predijo que la mayoría de las proteínas identificadas en las OMV purificadas estaban involucradas en la biogénesis de la pared celular, la membrana y la envoltura (Fig. 3E). Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que los OMV altamente purificados de norte. Gonorrhoeae contienen abundantes niveles de proteínas de la membrana externa, incluida PorB, y muestran niveles reducidos de proteínas citoplasmáticas y de la membrana interna, comúnmente asociadas con las OMV obtenidas de sobrenadantes de cultivos crudos.

PorB está asociado con la membrana de norte. Gonorrhoeae OMV

Habiendo establecido que PorB era la proteína principal encontrada en las OMV purificadas, investigamos a continuación si estaba plegada y asociada con la membrana de la OMV o empaquetada como una cadena de aminoácidos desplegada dentro de las vesículas. Para ello, la localización de PorB en células bacterianas completas y OMV purificadas se determinó mediante microscopía de superresolución (microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa, dSTORM). Como se esperaba, las señales de una sola molécula de PorB se concentraron alrededor de la periferia de las células bacterianas completas, de acuerdo con la localización de la membrana externa (Fig. 4A). De manera similar, se detectó PorB en OMV, por lo que las vesículas de mayor tamaño (alrededor de 100 nm de diámetro) mostraron estructuras en forma de anillo (Fig. 4A). El análisis de la intensidad de la señal fluorescente a través de las OMV marcadas con PorB fue consistente con la localización de la membrana (Fig. 4A). La mayoría de las OMV, sin embargo, no mostraron una tinción de membrana distinta, probablemente debido al tamaño pequeño y la resolución limitada (Fig. 4A). Por tanto, la localización de PorB se determinó mediante TEM después del marcaje inmunológico con suero anti-PorB. La microscopía electrónica de secciones ultrafinas fue consistente con la localización de la membrana externa de PorB en norte. Gonorrhoeae (Figura 4B). De manera similar, las partículas de oro se asociaron principalmente con las membranas más que con el contenido luminal de las OMV (Fig. 4B).

(A) Microscopía de superresolución (dSTORM) de norte. Gonorrhoeae (izquierda) y vesículas de la membrana externa (centro y ampliada a la derecha) sondeadas con suero anti-PorB. El panel de la derecha muestra la intensidad de la fluorescencia a lo largo de la línea a través de las vesículas. Barra de escala = 500 nm. (B) Microscopía electrónica de transmisión de norte. Gonorrhoeae (panel izquierdo) y OMV (panel derecho) sondeados para PorB usando anticuerpos conjugados de oro de 10 nm. Distribución de partículas de oro alrededor de la superficie de bacterias y vesículas representadas por una flecha. Barra de escala = 0,2 μm. (C) Las OMV purificadas hervidas y no hervidas se solubilizaron con concentraciones crecientes de detergente (dodecilsulfato de sodio, SDS) como se indica y se analizaron mediante tinción de coomassie coloidal después de electroforesis en gel semi-nativo. El complejo proteico PorB monomérico y de peso molecular de orden superior se indica mediante flechas. (D) Análisis de inmunotransferencia de OMV y membranas totales bacterianas aisladas de norte. Gonorrhoeae con concentraciones crecientes de detergente (SDS) como se indica y con sonda para PorB después de electroforesis en gel semi-nativo. Se indican el complejo proteico PorB monomérico (ɵ) y de peso molecular de orden superior (*).

A continuación, determinamos si PorB existía como un complejo proteico en OMV, como se demostró recientemente en la membrana externa de norte. Gonorrhoeae [15]. Un complejo proteico de PorB (

75 kDa) fue fácilmente detectable en OMV y fracciones de membrana total mediante electroforesis en gel de poliacrilamida semi-nativa después de tinción con Coomassie o análisis de inmunotransferencia (Fig. 4C y 4D). Como se esperaba, el aumento de la concentración de SDS o la ebullición antes del análisis disociaba el complejo PorB aislado de las OMV y las fracciones de membrana totales en su forma monomérica (36 kDa) (Fig. 4C y 4D). Esto demuestra que PorB adopta una conformación nativa similar en OMV como se observa en la membrana externa de norte. Gonorrhoeae.

Las OMV secretadas permiten que el PorB se dirija a las mitocondrias en los macrófagos

Dado que PorB era una proteína abundante en OMV y que la expresión ectópica de PorB en células de mamíferos resultó en la localización de mitocondrias, determinamos si norte. Gonorrhoeae las vesículas permitieron el tráfico mitocondrial de la porina. Para ello, expusimos macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) con norte. Gonorrhoeae OMV purificadas y co-localización determinada de PorB con Tom20, una proteína de la membrana mitocondrial externa, por microscopía confocal. En puntos de tiempo tempranos (2, 4 y 8 horas), PorB se localizó principalmente en regiones perinucleares, con poca evidencia de co-localización con Tom20 (Fig 5A). Mientras que a las 12 y 24 horas posteriores al tratamiento, el PorB permaneció en un patrón punteado, se dispersó por toda la celda (Fig. 5A). En estos puntos de tiempo, la señal de PorB apareció en las proximidades de las mitocondrias, pero resultó en sólo una co-localización parcial con Tom20 por microscopía confocal (Fig 5A). Se obtuvieron resultados similares con macrófagos THP-1 humanos, por lo que PorB se detectó en un patrón punteado en estrecha proximidad a las mitocondrias después de la exposición a OMV (Fig. S1). Para aumentar la detección de niveles bajos de PorB que podrían haberse dirigido a las mitocondrias, la red mitocondrial se visualizó aún más mediante microscopía de superresolución, utilizando dSTORM. En BMDM tratadas con OMV, PorB se localizó como parches discretos en la red mitocondrial teñida con Tom20 a las 12 horas después del tratamiento (Fig. 5B). Usando una rápida velocidad de video 3D, la localización de una sola molécula de súper resolución resolvió las membranas mitocondriales externas basándose en la tinción de Tom20 (Fig 5C). Además, las moléculas de PorB se incrustaron dentro de una membrana teñida con Tom20 (Fig. 5C). Nuevamente, la señal de PorB permaneció en grupos distintos en lugar de dispersarse por toda la membrana mitocondrial. Esto sugirió que las OMV pueden apuntar a PorB directamente a las mitocondrias. De acuerdo con esto, observamos OMV dentro del citosol de los macrófagos mediante microscopía electrónica a las 24 horas después del tratamiento, ya que las OMV carecían de membranas del huésped circundantes (Fig. 6A). Además, las OMV fueron detectables en las proximidades de las mitocondrias (Figura 6B), y las membranas de las OMV y las mitocondrias se tiñeron positivas para PorB (Figura 6C). El fraccionamiento bruto de las mitocondrias del citoplasma restante indicó además que PorB se asoció con las mitocondrias (Fig. 6D). Como se observó por microscopía electrónica, una proporción de PorB se asoció con la fracción citoplasmática restante (Fig. 6D). Curiosamente, el PorB dirigido a las mitocondrias era exclusivamente monomérico, como lo demuestra la electroforesis en gel de poliacrilamida semi-nativa (Fig. 6D). PorB en la fracción citoplásmica restante fue detectable como un complejo oligomérico que era sensible al tratamiento térmico (Fig. 6D). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las OMV pueden transferir directamente PorB a las mitocondrias y potencialmente a otras proteínas de carga de OMV. De hecho, también detectamos BamA dentro de la fracción enriquecida en mitocondrias de BMDM tratadas con OMV (Fig. 6D). Para imitar el objetivo de OMV de las mitocondrias, aislamos mitocondrias de BMDM no tratadas y las incubamos con OMV purificadas. in vitro. Como se observó en las células tratadas con OMV, una proporción detectable de PorB y BamA fraccionada con mitocondrias aisladas in vitro, pero no pudo sedimentar en ausencia de mitocondrias (Fig. 6E). Esto sugiere que norte. Gonorrhoeae Las OMV se dirigen al citosol de los macrófagos y se asocian estrechamente con las mitocondrias para administrar PorB y otras proteínas OMV.

(A) Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) se trataron con purificado norte. Gonorrhoeae OMV y analizados mediante microscopía de barrido láser confocal para la localización de PorB (rojo) y Tom20 (verde) en los momentos indicados. Las células se tiñeron con DAPI (azul) para visualizar los núcleos. Barra de escala = 10 μm. Imágenes representativas de más de 200 células de tres muestras biológicas. (B) Las BMDM tratadas con OMV purificadas durante 12 horas se analizaron mediante imágenes de superresolución de doble color reconstruidas con RapidSTORM para la localización de PorB (rojo) y Tom20 (verde). (C) Las BMDM tratadas con OMV (12 horas) se sondaron con anticuerpos anti-PorB (verde) y Tom20 (rojo) y se analizaron mediante microscopía de superresolución de localización de una sola molécula 3D.

(A, B y C) Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) se trataron con norte. Gonorrhoeae OMV durante 24 horas y obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión mediante tinción negativa y (C) anticuerpos conjugados con oro de 10 nm contra PorB. (D) Se obtuvieron mitocondrias crudas (P) y fracciones citoplásmicas (S) de BMDM tratadas con OMV y se analizaron para PorB y BamA y mitocondrias (Tim23, Tom40 y F1β) y marcadores citosólicos (GAPDH) por análisis de inmunotransferencia después de electroforesis en gel semi-nativo.(E) Las fracciones enriquecidas en mitocondrias se incubaron con OMV o PBS purificados y las fracciones posteriores de sobrenadante (S) y sedimento (P) se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-PorB, BamA y Tim23 después de electroforesis en gel SDS.

La orientación de PorB a los macrófagos depende de la biogénesis de OMV

La biogénesis de las OMV sigue estando poco caracterizada, pero varios estudios han identificado factores bacterianos que repercuten en la tasa de secreción de vesículas [23]. En parte, la biogénesis de OMV depende de la interacción de la membrana externa con el peptidoglicano subyacente. Por lo tanto, razonamos que el producto genético de norte. Gonorrhoeae NGFG_01788 puede afectar la biogénesis de OMV ya que contiene un motivo de lisina de unión a carbohidratos (LysM) y fue fácilmente detectable en OMV purificadas (Fig. 3A). La deleción genética de NGFG_01788 no afectó norte. Gonorrhoeae crecimiento en medios de cultivo ricos o la formación de diplococos (Fig. 7A y 7B). Los mutantes NGFG_01788 también produjeron OMV, pero la secreción de PorB mediada por OMV se redujo en un 40% en comparación con la cepa de tipo salvaje parental, según lo determinado por PorB teñido con coomassie de OMV y fracciones de lisado de células completas (Fig. tasa reducida de biogénesis de OMV (Fig. S2B). A continuación, incubamos bacterias de tipo salvaje y mutantes en transpozos que permiten la separación física de las BMDM, pero permiten que las pequeñas vesículas se muevan libremente. Después de 24 horas, recolectamos macrófagos y determinamos la localización de PorB por microscopía confocal. Como se observó con las OMV purificadas, pudimos detectar PorB en un patrón punteado en las proximidades de las mitocondrias en BMDM (Fig 7D). Comparado con el tipo salvaje norte. Gonorrhoeae, PorB se detectó a velocidades reducidas en BMDM después de la incubación con el mutante NGFG_01788 (Fig. 7F). Esto demuestra que norte. Gonorrhoeae es capaz de administrar PorB a las células huésped en ausencia de unión bacteriana y sugiere que esto depende de la biogénesis de OMV.

(A) El tipo salvaje (WT) y el mutante de deleción ΔNGFG_01788 se cultivaron en medio GC y el crecimiento se controló mediante densidad óptica a 600 nm. Desviación estándar y media de experimentos por triplicado. (B) Microscopía electrónica de transmisión del mutante ΔNGFG_01788 que muestra diplococos y secreción de OMV. (C) Las OMV purificadas y los lisados ​​de bacterias completas se analizaron mediante tinción de Coomassie después de la electroforesis en gel SDS y la cantidad de PorB dentro de las OMV en relación con las células bacterianas completas se determinó mediante densitometría. La secreción relativa de PorB mediada por OMV en el mutante se basa en los niveles de tipo salvaje (100%). Se muestran la desviación estándar y media de tres experimentos independientes. (D) BMDM se incubaron con tipo salvaje norte. Gonorrhoeae o (E) mutante ΔNGFG_01788 en transpozos y analizado para la localización de PorB (rojo) y Tom20 (verde) mediante análisis de inmunofluorescencia después de 24 horas. DAPI (azul) indica núcleo celular. (F) El número de señales de PorB (puntos) se cuantificó a partir de células & gt100 y dos experimentos independientes.

Norte. Gonorrhoeae Las OMV inducen la apoptosis de los macrófagos

Dado que el PorB derivado de OMV se dirigió a las mitocondrias, a continuación determinamos la salud mitocondrial de las BMDM expuestas a OMV. Para ello, las BMDM se trataron con diferentes concentraciones de OMV y la actividad mitocondrial se midió mediante la reducción del bromuro de T (3 [4, 5 dimetiltiazol-2-il] -2, 5-difenil tetrazolio (MTT). En comparación con el vehículo de control (PBS) BMDM tratadas, las células expuestas a 20 y 40 μg / mL de OMV purificadas mostraron una disminución significativa de la actividad metabólica (66,62% +/- 5,34 y 57,29% + / - 3,04, respectivamente p & lt0,05) (Fig 8A). Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) , según lo determinado por la tinción TMRM, se redujo en un 50% en BMDM tratadas con OMV (Fig 8B). La translocación de PorB a las mitocondrias y la disipación de ΔΨm nos llevan a investigar más a fondo si la exposición a OMV resultó en citocromo C liberación y activación de la apoptosis intrínseca. Como era de esperar, el citocromo C se encontró en las fracciones que contienen mitocondrias, y no en el citosol, en BMDM no tratadas (Fig. 8C). Por el contrario, el tratamiento con estaurosporina (STS), que induce la apoptosis, provocó que el citocromo C liberar en el citosol (Fig 8C). Del mismo modo, el citocromo C se asoció notablemente con la fracción citosólica en las BMDM tratadas con OMV, mientras que la proteína de la membrana mitocondrial interna, TIM23, permaneció asociada con las fracciones mitocondriales (Figura 8C).

(A) BMDM tratados con norte. Gonorrhoeae Las OMV (20 y 40 μg / ml) durante 48 horas se analizaron mediante el ensayo MTT para determinar la viabilidad celular y la actividad mitocondrial en relación con las células tratadas con PBS. Se muestran la media y la DE de 3 experimentos independientes (los asteriscos indican p & lt0.01). (B) Las BMDM se marcaron con TMRM y se trataron con OMV purificadas (40 μg / ml) durante 48 horas para determinar el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) en comparación con las células tratadas con PBS. Media y SD de tres experimentos independientes, que contienen muestras biológicas por triplicado con más de 500 células (los asteriscos indican p & lt0,001). (C) Las BMDM se trataron con estaurosporina (STS), OMV y PBS durante 24 horas y las mitocondrias y la fracción citosólica se analizaron mediante inmunotransferencia para el citocromo. C y Tim23. Una banda inespecífica (NS) de anticitocromo C El anticuerpo se utilizó como control para la carga. (D) Las BMDM se trataron con PBS, OMV, STS, ABT-737 y cicloheximida (CHX) durante 24 horas y se analizaron mediante inmunotransferencia para caspasa-3 escindida (p17 kDa). Se utilizaron anti-PorB y anti-tubulina como control para las células tratadas con OMV y la carga, respectivamente. Datos representativos de tres experimentos independientes. (E) Cuantificación de caspasa-3 escindida (p17 kDa) del panel D por densitometría. Se muestran la media y la DE de tres experimentos independientes. (F) Las BMDM tratadas con OMV se incubaron con Draq7 (azul) para teñir los núcleos de las células muertas y se analizaron mediante imágenes de lapso de tiempo. Se muestran los períodos de tiempo. Las flechas indican células con ampollas. Barra de escala = 100 μm.

Citocromo citosólico C causa la escisión proteolítica y la activación de las caspasas ejecutoras de la muerte celular, caspasa-3 y 7. La caspasa-3 escindida solo fue detectable en BMDM después del tratamiento con STS y cicloheximida (CHX), inductores conocidos de apoptosis, pero no en células tratadas con control de PBS ( Figura 8D). De manera similar, la exposición a OMV desencadenó la escisión de caspasa-3 en BMDM, que contenían PorB (Fig. 8D). De acuerdo con la activación de la caspasa-3, la formación de ampollas en la membrana, que es característica de la muerte por apoptosis, fue detectable alrededor de las 15 horas después de la incubación de las BMDM con las OMV (figura 8F). El tratamiento conjunto de BMDM con OMV y STS aumentó aún más los niveles de caspasa-3 escindida, lo que indica que actúan sinérgicamente para inducir la apoptosis (Fig. 8D y 8E). De manera similar, las OMV desencadenaron niveles aumentados de caspasa-3 escindida en presencia de CHX, lo que sugiere que la síntesis de al menos una proteína huésped puede limitar la señalización de apoptosis en estas condiciones (Fig. 8D y 8E). Para probar si esto dependía de los miembros de la familia BCL-2 pro-supervivencia que previenen la apoptosis mediada por mitocondrias, las BMDM se trataron con ABT-737 para inhibir las proteínas BCL-2, BCL-XL y BCL-W. Como se mostró recientemente [31], ABT-737 por sí solo no condujo a la escisión de la caspasa-3 debido a la presencia de proteínas relacionadas con BCL-2 pro-supervivencia que son resistentes al compuesto. Sin embargo, ABT-737 condujo a un aumento de la escisión de caspasa-3 en macrófagos tratados con OMV (Fig.8D y 8E), lo que sugiere que norte. Gonorrhoeae Las OMV son captadas por macrófagos e inducen daño mitocondrial y apoptosis mediada por BCL-2.

Las OMV que contienen PorB causan daño mitocondrial y apoptosis con el tiempo

Para seguir la salud de los macrófagos y las mitocondrias a nivel de una sola célula a lo largo del tiempo, establecimos imágenes de lapso de tiempo de BMDM tratadas con OMV que permitieron la visualización de la morfología celular, el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) a través de la fluorescencia de TMRM, la actividad de caspasa-3/7 utilizando sondas fluorescentes. y viabilidad de macrófagos mediante tinción con el tinte de ADN impermeable a la membrana, Draq7, en tiempo real. Las BMDM tratadas con PBS permanecieron viables (& gt 90% Draq7 negativo y TMRM positivo) durante 48 horas de formación de imágenes cada 30 minutos (Fig. 9A y 9B). Por el contrario, el 40% de los BMDM tratados con OMV perdieron la señal de TMRM en 10 horas (Fig. 9B y vídeos S1 y S2). La exposición a OMV también provocó la ruptura de la membrana plasmática y la muerte de los macrófagos con el tiempo a partir de las 15 horas posteriores al tratamiento (Fig. 9A). De acuerdo con la muerte apoptótica, la mayoría de los macrófagos muertos mostraron actividad caspasa-3/7 (Fig. 9C y video S1). Es de destacar que la actividad de la caspasa-3/7 es transitoria (1 a 2 horas), en contraste con la tinción Draq7 (estable durante 48 horas) y, por lo tanto, indica el número de células con caspasas activas en cada marco de tiempo en lugar de durante períodos prolongados. de tiempo. El análisis de células individuales confirmó que la muerte de los macrófagos está precedida por la pérdida de la señal de TMRM y la actividad de caspasa-3/7 (Fig. S3). Además, el inhibidor de pan-caspasa Q-VD-PH (QVD), que inhibe la actividad de caspasa apoptótica, previno la muerte celular inducida por OMV y la actividad de caspasa-3/7, pero no la pérdida de ΔΨm, en BMDM (Fig. 9A, 9B y 9C).

BMDM tratados con PBS, norte. Gonorrhoeae Las OMV purificadas y el inhibidor de pan-caspasa, Q-VD-PH (QVD) se analizaron mediante imágenes de células vivas cada 30 minutos durante 48 horas para determinar (A) la muerte celular (células Draq7 positivas), (B) el potencial de membrana mitocondrial ( ΔΨm, células positivas a TMRM) y (C) actividad caspasa-3/7 (células positivas al sustrato fluorogénico de caspasa). Se muestran la media y el error estándar de la media (SEM) para tres experimentos independientes, que contienen muestras biológicas por triplicado.

PorB es suficiente para desencadenar la apoptosis en macrófagos

Dado que las OMV contienen más de 100 proteínas, queríamos confirmar que PorB es el principal factor bacteriano que causa la apoptosis. No pudimos reducir o agotar induciblemente PorB en norte. Gonorrhoeae, en consonancia con la noción de que el gen es esencial [16]. Alternativamente, expresamos ectópicamente PorB nativo en células HeLa bajo un promotor inducible por doxiciclina (ya que enfoques similares no tuvieron éxito en macrófagos). PorB se co-localizó con el marcador mitocondrial, Tom20, dentro de las 2 horas posteriores a la inducción de doxiciclina y causó fragmentación mitocondrial a las 8 horas en células que contenían PorB detectable (Fig. S4A). La expresión de PorB desencadenó la escisión de la caspasa-3, como se observó después del tratamiento con OMV (Fig. S4B). La escisión de la caspasa-3 no se detectó en ausencia de plásmidos que contengan doxiciclina o PorB (Fig. S4B). También determinamos si PorB era detectable como proteína monomérica o si formaba un complejo oligomérico. Solo detectamos PorB nativo expresado ectópicamente como una proteína monomérica (Fig. S4C), similar al PorB asociado a mitocondrias después del tratamiento con OMV. Esto demuestra que PorB es suficiente para inducir la apoptosis y sugiere que PorB adopta una conformación monomérica, en lugar de oligomérica, en las mitocondrias.

Para verificar aún más que PorB entregado por OMV es capaz de causar apoptosis, expresamos norte. Gonorrhoeae PorB en no patógeno Escherichia coli. La microscopía electrónica indicó que las OMV de PorB que expresan mi. coli (CE PorB OMV) contenía porinas asociadas a la membrana, como se observó con norte. Gonorrhoeae OMV purificadas (Fig. 10A y 10B). Tratamiento de BMDM con CE PorB OMV causó la muerte de macrófagos después de un retraso de 15 horas en un grado similar a norte. Gonorrhoeae OMV (Figura 10C). CE PorB OMV también provocó la activación de caspasas apoptóticas, imitando norte. Gonorrhoeae OMV (figura 10D). A diferencia de, mi. coli OMV (CE OMV) que carecían de PorB solo causaron bajas tasas de muerte de macrófagos y activación de caspasa-3/7 a lo largo del tiempo (Fig. 10C y 10D). Juntos, esto demuestra que norte. Gonorrhoeae utiliza OMV para transportar PorB a las células huésped y para inducir la apoptosis mediada por mitocondrias en los macrófagos.

(A y B) norte. Gonorrhoeae PorB se expresó en mi. coli y OMV de mi. coli (Ec OMV) y PorB expresando mi. coli (Ec PorB OMV) analizada por microscopía electrónica de transmisión y marcaje inmunológico anti-PorB. (C y D) BMDM se trataron con PBS y OMV de norte. Gonorrhoeae (Ng OMV), expresión de PorB mi. coli (Ec PorB OMV) o control mi. coli (Ec OMV) y (C) muerte celular (Draq7) y (D) actividad caspasa-3/7 (sustrato fluorogénico) se determinó cada 30 minutos durante 48 horas usando imágenes de células vivas. Se muestran la desviación estándar y media de dos experimentos independientes con tres repeticiones biológicas.


MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño del estudio.

Para este estudio anidado, utilizamos muestras y datos de participantes no infectados por el VIH de 18 a 35 años en el estudio HC-HIV (n = 823) matriculados en clínicas de planificación familiar en Uganda y Zimbabwe (7). El estudio anidado incluyó a 199 mujeres (51 ugandesas y 148 zimbabuenses) que se infectaron con el VIH, muestreadas en la visita del estudio justo antes de aquella en la que se documentó la seroconversión del VIH (mediana de 3 & # x000a0 meses). Estas muestras se emparejaron con muestras de 633 controles (160 ugandeses y 473 zimbabuenses), que permanecieron sin VIH durante un seguimiento de 6 meses. Las características de la población de la cohorte estudiada aquí se presentan en detalle en otro lugar (66). Brevemente, la designación del grupo de anticonceptivos se basó en el método anticonceptivo principal que usaron las mujeres durante el tiempo transcurrido entre la visita del estudio anterior y la visita seleccionada. Las mujeres del grupo de anticonceptivos no hormonales (sin HC) usaron solo condones o no usaron anticonceptivos. Las mujeres que optaron por usar anticonceptivos hormonales recibieron de los médicos del estudio DMPA (150 & # x000a0 mg inyectados cada 3 & # x000a0 meses) o AOC (30 & # x000a0 & # x000b5g de etinilestradiol [EE] y 150 & # x000a0 & # x000b5g de levonorgestrel). Se pidió a todas las mujeres que se abstuvieran de tener relaciones sexuales 48 & # x000a0h antes de la recogida de muestras con torunda cervical. No se recolectaron muestras durante el sangrado menstrual, y rara vez se registró sangre visible / cérvix friable durante la recolección de hisopos.

Los casos y controles se emparejaron por sitio de estudio, edad, una variable compuesta de infección de transmisión sexual (ITS) (ver más abajo) y tiempo en el estudio, con hasta 4 controles emparejados para cada caso. La variable compuesta de ITS se estableció en 1 si a un participante se le diagnosticó C. & # X000a0trachomatis, N. & # x000a0gonorrhoeae (ambos confirmados por PCR), o tenían vaginosis bacteriana (VB) en la visita en la que se detectó la infección por VIH o en la visita anterior (la última visita sin VIH). La variable compuesta de ITS se estableció en 0 para las mujeres que dieron negativo en las 3 de estas afecciones en ambas visitas. La variable compuesta de ITS se eligió para controlar las exposiciones en lugar de detectar interacciones entre patógenos específicos.

Declaración de Ética.

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki). El estudio principal HC-HIV se llevó a cabo con el consentimiento informado de los sujetos y la aprobación de la Junta de Revisión Institucional para la investigación con sujetos humanos en las instituciones participantes en los Estados Unidos y África. El protocolo del subestudio de biomarcadores recibió una determinación de sujeto no humano (uso de datos no identificados) de la Oficina de Ética de Investigación Internacional en FHI 360 y la Junta de Revisión Institucional del Hospital Brigham and Women & # x02019s.

Diagnóstico clínico y de laboratorio de la infección.

Un estado libre de IVC se definió como no tener una infección diagnosticada por laboratorio. El diagnóstico de laboratorio de IVC incluyó PCR (Roche Amplicor) para C. & # X000a0trachomatis y N. & # x000a0gonorrhoeae, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de anticuerpos para el virus del herpes simple 2 (HSV-2), montaje en húmedo para T. & # x000a0vaginalis y Candiday puntuación de Nugent para BV. El estado serológico negativo se determinó mediante PCR.

Los signos clínicos de IVC se definieron como positivos (+) cuando los médicos registraron cualquiera de los siguientes hallazgos en un examen físico: inflamación o úlceras de la vulva amarillo / verde, blanco / cremoso / gris, o flujo vaginal mixto, prueba de olor positiva presencia de células clave epitelio vaginal anormal epitelio cervical anormal o moco cervical amarillo / verde.

La información sobre los síntomas de las IVC se obtuvo a través de una entrevista estructurada durante la cual se preguntó a los sujetos si tenían flujo vaginal anormal, picazón genital, dolor en la parte inferior del abdomen o dolor durante las relaciones sexuales y se les dio la opción de responder con & # x0201cyes, & # x0201d & # x0201cno, & # x0201d o & # x0201cdon & # x02019t know. & # x0201d Los síntomas se definieron como positivos (+) cuando se reportó flujo vaginal anormal, picazón genital, dolor abdominal bajo o dolor durante las relaciones sexuales. El sangrado entre períodos no se consideró un síntoma de IVC. Para este análisis, solo aquellos que respondieron & # x0201cno & # x0201d a todo lo anterior se consideraron libres de síntomas (aquellos que respondieron & # x0201cdon & # x02019t know & # x0201d fueron excluidos).

Biomarcadores de inmunidad cervical.

Para los biomarcadores de la inmunidad cervical, utilizamos hisopos de Dacron cervical, que se recolectaron en tampón de lisis Amplicor (Roche Diagnostics) y se procesaron como se describió anteriormente (67).

Se midieron simultáneamente ocho biomarcadores (IL-1 & # x003b2, IL-1RA, IL-6, IL-8, RANTES, MIP-3 & # x003b1, VEGF y sICAM-1) utilizando la plataforma multiplex Meso Scale Discovery (MSD) y Sector Imager 2400 (MSD, Gaithersburg, MD). Esta plataforma de detección de MSD ha sido validada para la exactitud y precisión de la recuperación de citocinas utilizando estándares internacionales mediante comparaciones con ELISA tradicional (68) y ha demostrado una alta validez de contenido clínico para los ocho biomarcadores en grandes cohortes clínicas (69, & # x0201378). El MSD 8-plex se diseñó y optimizó a medida para permitir la detección de cada biomarcador dentro del rango de concentración de linealidad de las muestras de torunda cervical eluidas. SLPI y BD2 se midieron mediante ELISA (ensayo de SLPI humano Quantikine de R & # x00026D Systems, Minneapolis, MN, y ensayo de defensina 2 humana & # x003b2 de Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Burlingame, CA).

Cada muestra se analizó por duplicado, y el valor promedio se normalizó a la concentración promedio de miligramos de proteína total obtenida de la medición por duplicado utilizando el ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) de Pierce (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Los ensayos de ELISA y BCA se leyeron usando un lector Victor2 (PerkinElmer, Boston, MA). Los porcentajes de coeficiente de variación (CV) de los valores duplicados obtenidos por este método fueron & # x0003c10%. Un conjunto de muestras de control de calidad que mostraba valores dentro del rango de linealidad se dividió en alícuotas, y se probó una alícuota en cada placa de ensayo que mostraba una variación entre placas de & # x0003c25% para todos los inmunoensayos y proteínas. La adición de tampón de lisis Amplicor y diluyente con concentraciones conocidas de las proteínas de prueba confirmó que no hubo interferencias en el ensayo en las diluciones de muestra más bajas elegidas (2 veces para MSD 8-plex, 80 veces para SLPI y 25 veces para BD2). Todas las muestras mostraron valores por encima de los límites bajos de detección (LLD) para cada ensayo de la siguiente manera: IL-1 & # x003b2, 1,2 & # x000a0pg / ml IL-1RA, 0,16 & # x000a0ng / ml IL-6, 1,7 & # x000a0pg / ml IL-8, 0.8 & # x000a0pg / ml RANTES, 1.8 & # x000a0pg / ml MIP-3 & # x003b1, 16.4 & # x000a0pg / ml VEGF, 0.12 & # x000a0pg / ml y sICAM-1, 3.6 & # x000a0pg / ml .Para SLPI, el LLD fue 0,46 & # x000a0ng / ml, y para BD2, el LLD fue 12,2 & # x000a0pg / ml.

Análisis estadístico.

El enfoque de transformación de potencia de Box-Cox se utilizó para transformar las concentraciones de biomarcadores en distribuciones normales para análisis de modelos estadísticos. Se utilizaron estadísticas descriptivas, incluidas medianas y rangos, para resumir los niveles de biomarcadores. Las asociaciones entre los niveles de mediadores y CVI, los signos y síntomas clínicos de CVI y el uso de HC se evaluaron mediante las pruebas de Wilcoxon y Kruskal-Wallis. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para evaluar la asociación entre los IVC, el uso de HC y las características de las mujeres. Se utilizaron análisis bivariados y multivariables que controlan otros CVI a través de modelos lineales generalizados para examinar los efectos de los CVI individuales y el uso de HC en los niveles de mediadores. Este estudio se basó en un análisis de datos secundarios para explorar el impacto de las IVC en la relación entre el uso de HC y los biomarcadores de seguridad / inmunidad cervical. Debido a la post hoc la naturaleza del cálculo del poder de análisis no fueron aplicables (79). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SAS versión 9.3 (SAS Institute, Cary, NC).


RESULTADOS

Aplicación a un único conjunto de datos simulado

Para demostrar el uso de nuestra metodología bayesiana, primero simulamos un solo conjunto de datos, que consta de 100 individuos, muestreados a intervalos regulares entre el año 2000 y 2010. La genealogía se extrajo del modelo coalescente heterocrónico (Ecuación 2) con unidad de tiempo coalescente igual a α = nortemigramo = 5 años (Figura 1A). El modelo de reloj molecular estricto (Ecuación 3) se aplicó a esta genealogía con una tasa media de μ = 5 sustituciones por año para obtener un árbol de entrada filogenético sin raíces (Figura 1B). También consideramos las fechas de muestreo como parte de la entrada, excepto que cada individuo tenía un 10% de probabilidad de tener una fecha de muestreo desconocida. Primero realizamos un análisis de regresión lineal de la distancia de la raíz a la punta frente a las fechas de muestreo (cuando se conocen), con la posición de la raíz seleccionada para optimizar la señal temporal. Esto dio como resultado una frecuencia de reloj ligeramente subestimada de μ = 4,38 sustituciones por año, y una raíz ubicada en la rama correcta como en la Figura 1A, pero con una fecha estimada del 21 de febrero de 1996, subestimada en comparación con la fecha raíz correcta el 28 de diciembre de 1996. Esta regresión lineal tuvo una alta fracción de varianza explicada por el modelo, R 2 = 0.86, con todos los puntos dentro o muy cerca de los intervalos de confianza del 95% (Figura 1C), y un valor p altamente significativo de PAG & lt 10 −4 basado en una prueba de permutación (48).

Aplicación a un único conjunto de datos simulado. (A) la genealogía fechada correcta. (B) la filogenia desarraigada utilizada como entrada. (C) Regresión lineal de raíz a punta (eje y) versus fechas de muestreo (eje x). (D) Genealogía fechada estimada, con barras azules que indican el IC del 95% para las fechas ancestrales y barras rojas que representan el IC del 95% para las fechas de muestreo desconocidas.

Aplicación a un único conjunto de datos simulado. (A) la genealogía fechada correcta. (B) la filogenia desarraigada utilizada como entrada. (C) Regresión lineal de raíz a punta (eje y) versus fechas de muestreo (eje x). (D) Genealogía fechada estimada, con barras azules que indican el IC del 95% para las fechas ancestrales y barras rojas que representan el IC del 95% para las fechas de muestreo desconocidas.

La frecuencia del reloj y la raíz del árbol estimada por la regresión lineal se utilizaron como punto de partida para nuestro procedimiento MCMC. El tiempo de ejecución para las 105 iteraciones predeterminadas fue de ∼10 min en una computadora de escritorio estándar. Los valores entre corchetes a continuación representan los intervalos creíbles del 95% (IC del 95%) de los parámetros estimados. La distribución posterior de la unidad de tiempo coalescente α tenía una media de 4,69 años [3,66-5,98], que incluye el valor correcto de 5 años utilizado en la simulación. La tasa de sustitución μ tuvo una media de 4,96 por año [4,46–5,47], que también incluye el valor correcto de 5 por año. La probabilidad posterior de la ubicación de la raíz fue la más alta para la rama correcta, pero solo igual a 0,56 y la probabilidad restante se compartió entre las dos ramas directamente debajo de la rama corta que proviene de la raíz real (Figura 1A). Debido a lo corto de esta rama, no es sorprendente que exista incertidumbre sobre la ubicación exacta de la raíz. También se estimaron la media posterior y el IC del 95% para las fechas de todos los nodos ancestrales y hojas cuyas fechas de muestreo se desconocían (Figura 1D). En particular, la raíz del árbol tenía una fecha media del 24 de septiembre de 1996 [30 de octubre de 1995 a 4 de agosto de 1997], que corresponde a la fecha correcta del 28 de diciembre de 1996.

Aplicación a múltiples conjuntos de datos simulados

Repetimos el procedimiento descrito anteriormente para 100 conjuntos de datos simulados, cada uno de los cuales se generó con la misma unidad de tiempo coalescente α = 5 años pero con la tasa de sustitución μ que varía entre 0,1 y 10 por año. Para cada conjunto de datos, estimamos la media y el IC del 95% de los dos parámetros α y μ (Figura 2A). Encontramos que los valores estimados para α permanecieron alrededor del valor correcto de 5, con la mayoría de los IC del 95% cubriendo 5, mientras que las estimaciones de μ aumentaron con el valor correcto de μ, y una vez más la mayoría de los IC del 95% cubriendo los valores correctos. Luego repetimos el procedimiento nuevamente para otros 100 conjuntos de datos simulados, pero esta vez manteniendo μ = 5 fijo y variando α entre 0.1 y 10 años. Como era de esperar, encontramos que en estas condiciones los valores estimados de μ permanecieron constantes y que los valores estimados de α siguieron los valores correctos usados ​​en las simulaciones (Figura 2B).

Aplicación a múltiples conjuntos de datos simulados con un reloj estricto. (A) Se analizaron cien conjuntos de datos simulados, cada uno de los cuales utilizó parámetros α = 5 y 0,1 & lt μ & lt 10 (eje x), y para ambos parámetros la media inferida (eje y, punto) y los intervalos de IC del 95% (y- eje, línea) se muestran. (B) Igual que el panel A, pero usando un conjunto diferente de 100 simulaciones para las cuales los parámetros verdaderos fueron 0.1 & lt α & lt 10 (eje x) y un fijo μ = 5.

Aplicación a múltiples conjuntos de datos simulados con un reloj estricto. (A) Se analizaron cien conjuntos de datos simulados, cada uno de los cuales utilizó parámetros α = 5 y 0.1 & lt μ & lt 10 (eje x), y para ambos parámetros la media inferida (eje y, punto) y los intervalos de IC del 95% (y- eje, línea) se muestran. (B) Igual que el panel A, pero usando un conjunto diferente de 100 simulaciones para las cuales los parámetros verdaderos fueron 0.1 & lt α & lt 10 (eje x) y un fijo μ = 5.

Las simulaciones consideradas hasta ahora se generaron usando un reloj molecular estricto (Ecuación 3) y se infirieron usando una mezcla 50-50 de los modelos de reloj estricto y relajado (cf Métodos). Los factores de Bayes inferidos siempre estuvieron abrumadoramente a favor del modelo estricto correcto, con la excepción de solo las dos primeras simulaciones en la Figura 2A, para las cuales μ = 0.1 y μ = 0.2 sustituciones por año, respectivamente. La frecuencia de reloj estricta utilizada en esta simulación era demasiado baja para descartar un modelo de reloj relajado, y hacerlo requeriría un intervalo de muestreo de más de 10 años. Ahora consideramos un nuevo conjunto de 100 simulaciones realizadas bajo el modelo de reloj relajado (Ecuación 6), en el que la unidad de tiempo coalescente es α = 5, la tasa promedio es μ = 5 por año y la desviación estándar de la frecuencia de reloj σ varía entre 0,1 y 10. La inferencia se realizó una vez más bajo el modelo mixto, exactamente en las mismas condiciones en las que se encontraban anteriormente. Las estimaciones de la unidad coalescente α y la frecuencia de reloj promedio μ se mantuvieron alrededor del valor correcto de 5, con la mayoría de los IC del 95% cubriendo este valor, pero observamos que a medida que la desviación estándar σ aumentó, también lo hizo la incertidumbre en μ (Figura 3 ). Los valores inferidos de σ siguieron los valores correctos, excepto cuando σ era & lt2, en cuyo caso a menudo se infirió que σ era cero (Figura 3). Esto corresponde a conjuntos de datos en los que se infirió incorrectamente que el modelo era el modelo de reloj estricto (σ = 0) en lugar del modelo de reloj relajado (σ & gt 0). Se espera este comportamiento, ya que cuando la desviación estándar σ de las frecuencias de reloj por rama es pequeña (en relación con su media μ), la relajación del reloj tiene poco efecto y, por lo tanto, los datos son difíciles de diferenciar de los datos generados bajo el reloj estricto. modelo. Por lo tanto, esta selección incorrecta del modelo no es un problema, y ​​otras estimaciones de parámetros como la unidad de tiempo coalescente α y la tasa de evolución μ no se ven afectadas (Figura 3). Sin embargo, este comportamiento demuestra que nuestro algoritmo es relativamente conservador al llamar al reloj relajado, como resultado de nuestra elección de un previo muy poco informativo sobre σ en el modelo de reloj relajado, lo que tiene un impacto directo en la selección del modelo (53).

Aplicación a múltiples conjuntos de datos simulados con un reloj relajado. Se analizaron cien conjuntos de datos simulados, cada uno de los cuales utilizó los parámetros α = 5, μ = 5 y 0.1 & lt σ & lt 10 (eje x), y para estos parámetros la media inferida (eje y, punto) y los intervalos de IC del 95% (eje y, línea) se muestran.

Aplicación a múltiples conjuntos de datos simulados con un reloj relajado. Se analizaron cien conjuntos de datos simulados, cada uno de los cuales utilizó los parámetros α = 5, μ = 5 y 0.1 & lt σ & lt 10 (eje x), y para estos parámetros la media inferida (eje y, punto) y los intervalos de IC del 95% (eje y, línea) se muestran.

Tomados en conjunto, estos resultados en datos simulados indican que nuestro procedimiento MCMC es correcto y que existe un poder estadístico significativo para estimar los parámetros clave de los modelos y, por lo tanto, para realizar con precisión la inferencia bayesiana en las fechas ancestrales de una filogenia, al menos en las condiciones utilizadas para simular estos conjuntos de datos. El rango de parámetros utilizados en las simulaciones anteriores se seleccionó para ser representativo de situaciones típicas que surgen en la epidemiología genómica de poblaciones bacterianas. En particular, la tasa de sustitución de todo el genoma varía entre especies en el mismo orden de magnitud considerado anteriormente entre 0,1 y 10 sustituciones por año (2, 24, 54). La secuenciación de una muestra de 100 genomas también se puede lograr hoy en día gracias a la reciente reducción en el costo y el tiempo necesarios para secuenciar genomas bacterianos completos (55). El supuesto de un marco muestral imparcial uniforme durante 10 años representa un buen escenario, que no siempre es factible. Cuando no es así, es probable que se reduzca el poder estadístico para fechar con precisión un árbol filogenético y, por lo tanto, aumenta la incertidumbre en las reconstrucciones, lo que nuestro método bayesiano es muy adecuado para capturar.

Comparación con otros métodos en datos de referencia

Los conjuntos de datos simulados descritos anteriormente se diseñaron para emular conjuntos de datos genómicos bacterianos reales, y se utilizó el mismo modelo tanto para la simulación como para la inferencia. Para probar la solidez de nuestro método frente a las desviaciones en el modelo subyacente y compararlo con otros métodos, también aplicamos BactDating a los conjuntos de datos simulados descritos anteriormente (12). Estas simulaciones estaban destinadas a emular la evolución del VIH entre hospedadores, basándose en un proceso de nacimiento-muerte con tiempos de muestreo periódicos, una frecuencia media de reloj de 0,006 sustituciones por sitio por año y secuencias de 1000 pb de longitud (12). Se consideraron dos esquemas de muestreo: 25 individuos muestreados en 3 momentos separados por 10 años y 10 individuos muestreados en 11 momentos separados por 2 años. Se utilizaron dos modelos de reloj molecular para generar los conjuntos de datos: un modelo de reloj estricto y un reloj relajado lognormal no correlacionado. Para cada una de las cuatro combinaciones resultantes de esquemas de muestreo y modelos de reloj, se simularon 100 conjuntos de datos y los resultados se muestran en la Figura suplementaria S1 (primer esquema de muestreo, reloj estricto), Figura suplementaria S2 (primer esquema de muestreo, reloj relajado), Suplementario Figura S3 (segundo esquema de muestreo, reloj estricto) y Figura complementaria S4 (segundo esquema de muestreo, reloj relajado). Usamos BactDating para estimar la frecuencia de reloj y la fecha de la raíz en base a las filogenias sin raíz publicadas previamente estimadas usando PhyML (19). Comparamos nuestros resultados con los resultados publicados anteriormente de un análisis de raíz a punta similar a TempEst (13), LSD (12) y BEAST utilizando un modelo de reloj estricto o relajado (6). Los mismos datos simulados publicados anteriormente también se han utilizado para comparar treedater (16) y TreeTime (17). En los conjuntos de datos de reloj estrictos, encontramos que BactDating se desempeñó al menos tan bien como todos los demás métodos (Figuras complementarias S1 y S3). En los conjuntos de datos de reloj relajado, BactDating funcionó de manera similar a otros métodos, aunque hubo una ligera tendencia a subestimar la frecuencia media del reloj (Figuras complementarias S2 y S4). Esto probablemente se deba a la saturación de las ramas con una alta tasa de mutación, lo que explicaría por qué el LSD tiene un sesgo similar. Sin embargo, tal saturación no ocurriría en la genómica bacteriana debido a tasas evolutivas por sitio mucho más bajas (2). En general, estos resultados muestran que BactDating funciona bien incluso en condiciones para las que no fue diseñado, con un impacto negativo mínimo de la aproximación en el paso de reconstrucción filogenética y una alta robustez a la especificación incorrecta del árbol y los modelos evolutivos.

Aplicación a un patógeno bacteriano antiguo utilizando aDNA

Mycobacterium leprae es el agente causante de la lepra, una enfermedad debilitante que era endémica en toda Europa en la Edad Media y que sigue siendo una amenaza crítica para la salud en algunas partes del mundo en desarrollo (56). Aquí volvemos a analizar los datos publicados anteriormente de (31), incluidos diez genomas recientes (muestreados entre 1982 y 2012) y cinco genomas antiguos (muestreados entre 990 y 1369). Se reconstruyó un árbol filogenético sin raíces utilizando PhyML (19) (Figura complementaria S5). Después de seleccionar la raíz que maximiza el coeficiente de determinación R 2 = 0,9, encontramos una fuerte correlación entre las fechas de muestreo y las distancias de la raíz a la punta (Figura 4A), con una tasa estimada de sustitución de 0,0353 por genoma por año y una fecha de raíz estimada de 928 a. Todas las distancias de la raíz a la punta caen dentro del intervalo esperado bajo un reloj molecular estricto (Figura 4A) y, a pesar del bajo número de hojas de los árboles, una prueba de aleatorización de fechas (48) encontró que la señal temporal es significativa (PAG & lt 10 −4).

Análisis de Mycobacterium leprae conjunto de datos. (A) Regresión lineal de raíz a punta (eje y) versus fechas de muestreo (eje x). (B) Genealogía fechada estimada, con barras azules que indican un IC del 95% para las fechas ancestrales.