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¿Diferencia entre 'etiquetar' y 'conjugar' un fluorocromo a un anticuerpo?

¿Diferencia entre 'etiquetar' y 'conjugar' un fluorocromo a un anticuerpo?



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La entrada de Wikipedia sobre fluorescencia afirma repetidamente que "un fluorocromo debe estar etiquetado o conjugado con el anticuerpo".

¿En qué se diferencia el etiquetado o conjugado? ¿Es esto un error o son conceptos diferentes?


Conjugado y etiquetado significan lo mismo aquí, aunque desaconsejaría el uso de etiquetado aquí.

En el contexto de los anticuerpos, etiquetado significa la adición de una secuencia de péptidos (corta) a una proteína. Ya sea para hacer algo útil (etiqueta de degradación, etiqueta HHHHHH) o simplemente como epítopo de un anticuerpo.


Preguntas frecuentes - Anticuerpos conjugados con tinte en tándem

Encuentre respuestas científico-técnicas sobre preguntas frecuentes relacionadas con:

  • Conjugados de anticuerpos de tinte en tándem
  • Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o de Forster (FRET)
  • Tintes FRET o pares FRET
  • Efecto de cambio de trazo
  • Fotoblanqueo de tintes tándem
  • Degradación de tintes en tándem
  • Controles de compensación

¿Qué son los tintes en tándem?
Un tinte en tándem, también llamado par FRET o tinte FRET, es un par de moléculas fluorescentes unidas covalentemente (fluorocromos o fluoróforos) que contienen un donante y una molécula aceptora (Figura 1A). Una molécula donante es generalmente un tinte a base de proteínas [p. Ej. Ficoeritrina (PE)] o un tinte sintetizado químicamente con un gran coeficiente de extinción (es decir, capacidad para absorber energía en forma de luz / fotones). Una molécula aceptora es un tinte sintético [p. Ej. Cyanine-7 (Cy7)] que absorbe la energía emitida por la molécula donante a través de un fenómeno llamado transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o de Forster (FRET) (Beavis et al. 1996, Forman y Gupta, 2007). Los ejemplos de tintes en tándem incluyen PE-Cy7, PE-Cy5.5, PE-Atto 594 y APC-Cy7.

Figura 1: Colorantes en tándem A. Representación esquemática de la transferencia de energía entre moléculas donantes y aceptoras en un colorante en tándem PE-Cy7. B. Imagen espectral del colorante en tándem PE-Cy7 que muestra el espectro de excitación (línea de puntos) y el espectro de emisión (área sombreada con línea continua). Pruebe Spectra Viewer de Novus para explorar los espectros de excitación y emisión de varios tintes en tándem y no tándem.

¿Cómo funcionan los tintes en tándem?
Como se indicó anteriormente, los tintes en tándem generan una señal de fluorescencia a través de FRET, un fenómeno fisicoquímico que implica la transmisión de energía entre dos moléculas fluorescentes colocadas en estrecha proximidad (a distancias interatómicas de 1 a 10 nm). Para que ocurra un FRET exitoso, el espectro de emisión del donante debe coincidir con el espectro de excitación del fluorocromo aceptor. Tras la excitación, la molécula donante de un tinte en tándem absorbe energía de la luz en una longitud de onda específica y transfiere esta energía a la molécula aceptora adjunta, que emite luz en forma de fluorescencia (Figura 1A, 1B). Un par tándem o FRET se comporta como un fluorocromo único que tiene las propiedades máximas de excitación de la molécula donante y las propiedades máximas de emisión de una molécula aceptora. Por ejemplo, con el colorante en tándem PE-Cy7, el PE es el donante que absorbe la energía luminosa (excitación) y la energía que de otro modo se liberaría cuando la fluorescencia de PE se transfiera a Cy7 a través de FRET. Cy7 luego emite la energía absorbida como fluorescencia roja, es decir, emisión (Figura 2A y 2B). Cabe señalar que la eficiencia FRET (una medida de la transferencia de energía entre el donante y el aceptor) nunca es del 100% y en la detección por citometría de flujo, siempre hay algún nivel de derrame o efecto de sangrado en el canal del donante. Como regla general, una mayor eficiencia de FRET se evidencia por una señal de emisión más fuerte en el canal aceptor con una señal de emisión más débil en el canal donante.

Figura 2: Propiedades espectrales de los tintes PE, Cy7 y PE-Cy7: A. Diagrama espectral de los espectros de excitación y emisión de PE (amarillo) y Cy7 (rojo). B. Diagrama espectral del colorante en tándem PE-Cy7 que muestra el espectro de excitación (línea de puntos) y el espectro de emisión (área sombreada con línea continua). NOTA: El PE tiene tres máximos de absorción (498nm, 544nm, 566nm) y todos se pueden utilizar (el óptimo dependerá de la aplicación). Las líneas láser de excitación sugeridas para PE son 488, 532 y 561, y su máxima emisión de fluorescencia es de 700 nm. Explore los diagramas espectrales de los fluorocromos de su elección con el visor de espectros de Novus
La luz emitida por un fluorocromo tiene una longitud de onda más larga que la que fue absorbida durante la excitación. Esta diferencia entre la absorbancia máxima y las longitudes de onda de emisión está definida por el desplazamiento de Stokes. Un cambio de Stokes más grande significa que hay menos superposición entre las dos longitudes de onda, es decir, los máximos de absorción y emisión. Los tintes en tándem amplían el rango espectral detectado mediante la excitación de un solo láser y, por lo tanto, amplían el número de parámetros que se pueden analizar en experimentos de citometría de flujo multicolor. Por ejemplo, el láser de 488 nm se puede utilizar para excitar simultáneamente DyLight® 488, PE y la proteína de clorofila de peridinina (PerCP) -Cy5.5, que luego generan emisiones verdes, amarillas y rojas, respectivamente.

  • Fotodegradación o Fotoblanqueo: La iluminación repetida de fluorocromos en tintes en tándem y / o la exposición a la luz directa durante el almacenamiento o la experimentación pueden romper un enlace covalente entre los dos tintes en el par en tándem. Por lo tanto, es muy importante proteger los conjugados de anticuerpos de tinte en tándem de la exposición a la luz durante el almacenamiento y cuando están en uso. Se ha demostrado que almacenar los conjugados de tinte en tándem en botellas oscuras aumenta la durabilidad o la vida útil de los pares tándem (Forman y Gupta, 2007).
  • Condición de almacenamiento: Los conjugados de anticuerpos colorantes en tándem NUNCA deben almacenarse a -20 ° C u otras temperaturas de congelación. La congelación provoca la desnaturalización del fluorocromo donante en un tinte y una pérdida de la señal de fluorescencia. Para conocer las condiciones de almacenamiento adecuadas, se recomienda verificar la información proporcionada en la hoja de datos del producto.
  • Incubación de la muestra: Algunas moléculas de colorante en tándem (por ejemplo, APC) son susceptibles al desacoplamiento celular de las moléculas aceptora y donante. Por lo tanto, cuando se trabaja con células no fijadas, es muy recomendable realizar una incubación de muestra de células y anticuerpos conjugados a 4 ° C o colocando la placa de cultivo celular sobre hielo picado en un balde. La baja temperatura ralentiza el metabolismo celular, lo que en última instancia ayuda a preservar la estabilidad intraensayo del colorante en tándem.
  • Duracion: Los tintes en tándem y los anticuerpos conjugados en tándem son relativamente menos estables en comparación con sus correspondientes componentes de tinte individuales. Le recomendamos encarecidamente que revise las hojas de datos del producto para obtener información sobre las condiciones de almacenamiento recomendadas y la declaración de garantía (en la sección Limitaciones).

¿Son los tintes en tándem sensibles a los fijadores y agentes de permeabilización?
Sí, la fijación (fijadores) y la permeabilización (agentes permeabilizantes como los detergentes) pueden provocar la degradación de los tintes en tándem. Si los pasos de fijación / permeabilización son absolutamente necesarios en su ensayo, su tiempo debe ser lo más corto y suave posible.

¿Qué debe considerar al preparar controles de compensación para tintes en tándem en citometría de flujo?
Para la compensación, se necesita una sola muestra teñida para cada fluorocromo en un experimento de citometría de flujo multicolor. El control de compensación debe coincidir exactamente con el fluorocromo, el tipo de muestra y la condición experimental. Debido a las diferencias significativas en la química del colorante en tándem, el anticuerpo conjugado en tándem utilizado en el experimento debe ser el mismo (del mismo tubo) que el utilizado para la compensación. El uso exacto del mismo tinte en tándem (fluorocromo) pero conjugado con otro anticuerpo, o incluso el uso de un lote diferente de la misma preparación de anticuerpo, puede dar lugar a imprecisiones en los cálculos de compensación.

¿Por qué no se recomiendan los tintes en tándem para la tinción intracelular?
Los anticuerpos conjugados en tándem tienen dificultad para cruzar la membrana celular para alcanzar las proteínas diana intracelulares debido a su gran tamaño. Por lo tanto, no se recomiendan los conjugados de anticuerpos de tinte en tándem para teñir antígenos intracelulares.


Abstracto

Fondo

El receptor activador del miembro D (NKG2D) del miembro del grupo asesino natural 2 se expresa típicamente en células NK, linfocitos T CD8, células T γδ y pequeños subconjuntos de linfocitos T CD4. Durante el curso de un fenotipado extenso por citometría de flujo de células inmunes en la sangre periférica de pacientes con glioblastoma multiforme (GBM), notamos una expresión inesperada del receptor NKG2D en granulocitos usando el anticuerpo clon 149810 conjugado con ficoeritrina (PE).

Métodos

Se analizaron muestras de sangre periférica de 35 pacientes con GBM y 22 donantes de control sano (HC) de la misma edad mediante citometría de flujo, citometría de imágenes y PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real para validar la expresión observada del receptor NKG2D en las células mieloides.

Resultados

La reactividad con PE-149810 se observó principalmente en granulocitos de pacientes con GBM en tratamiento con dexametasona, donde se correlacionó con tasas de supervivencia inferiores. Sorprendentemente, tal expresión de NKG2D en granulocitos no se observó usando el conjugado de aloficocianina (APC) del mismo anticuerpo del clon 149810 o un procedimiento de tinción indirecta con el anticuerpo del clon 149810 no conjugado. Además, el conjugado PE de un clon anti-NKG2D diferente (1D11) tampoco tiñó los granulocitos. La citometría de imágenes indicó la superficie celular y la localización intracelular de PE-149810 pero no de PE-1D11 en granulocitos.

Conclusión

Nuestros resultados revelan una reactividad errónea y falsa positiva del anticuerpo anti-NKG2D 149810 marcado con PE (pero no marcado con APC o no conjugado) en granulocitos de pacientes con GBM tratados con dexametasona y plantean una nota de precaución para los estudios de expresión de NKG2D en pacientes no conjugados. células linfoides.


¿Diferencia entre 'etiquetar' y 'conjugar' un fluorocromo a un anticuerpo? - biología

Aquí presentamos una descripción en profundidad de la estructura del anticuerpo y varios fragmentos de anticuerpos. Analizamos las principales aplicaciones de los anticuerpos, así como las ventajas y desventajas del uso de anticuerpos de tamaño completo frente a los fragmentos. Luego proporcionamos una descripción general de los estudios que utilizan fragmentos de anticuerpos y una discusión sobre los receptores de anticuerpos llamados receptores Fc.

Los anticuerpos son glicoproteínas de inmunoglobulina (Ig) producidas por células plasmáticas (células B) en respuesta a moléculas antigénicas extrañas (inmunógenos). La función principal de los anticuerpos es unirse específicamente a estos antígenos extraños para inhabilitarlos y / o marcarlos para que los destruya el sistema inmunológico, protegiendo así al huésped de la infección. Hay varias clases de anticuerpos. La primera parte de este resumen se centra en los anticuerpos convencionales de tamaño completo, los anticuerpos de clase IgG e IgM, que se utilizan mucho en una multitud de aplicaciones biomédicas de investigación, diagnóstico y terapéuticas.

La unidad básica de un anticuerpo convencional es una unidad de cuatro polipéptidos que consta de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas unidas por enlaces disulfuro. Las cadenas ligeras son más cortas, con pesos moleculares más bajos que las cadenas pesadas. La forma general de un anticuerpo es una Y, con una región de bisagra flexible (interdominio) en el centro de la Y. La flexibilidad de la región de bisagra entre dominios es importante para la unión bivalente de un anticuerpo [2], lo que permite los dos bolsillos de unión para interactuar con sitios antigénicos a distancias variables. Cada cadena polipeptídica tiene una región constante, que no varía significativamente entre anticuerpos, y una región variable, que es específica para cada anticuerpo en particular. La notación común para la región variable de la cadena ligera es VL y para la región constante de la cadena ligera es CL (Figura 1). La notación es similar para la variable de cadena pesada (VH) y las regiones constantes (CH) con CH1, CH2 y CH3 que denota los diferentes dominios de la región constante de la cadena pesada. Los carbohidratos normalmente se unen a la CH2 dominios de las cadenas pesadas. La región cristalizable del fragmento (Fc) contiene solo regiones constantes de las cadenas pesadas (CH), pero la región de unión al antígeno del fragmento (Fab) incluye tanto un dominio constante como los dominios variables de las cadenas pesada y ligera (VH y CL). La región variable del fragmento FV región contiene solo los dos dominios variables (Figura 1). Ver anticuerpo de ratón para una discusión sobre los isotipos de inmunoglobulina, subclases y el número de dominios de inmunoglobulina.

Cada anticuerpo completo tiene dos bolsas de unión a antígeno, ubicadas en el FV regiones, y puede unirse a dos antígenos (unión bivalente). Sin embargo, si los dos antígenos están demasiado cerca (≤3 nm) o demasiado separados (≥29 nm), el anticuerpo solo puede unirse a un antígeno (unión monovalente) [2]. Existe un cambio de afinidad significativo entre las uniones monovalentes y bivalentes con un cambio de 1.500 veces en los valores de Kd [2].

La estructura de anticuerpos específicos está disponible en la base de datos de anticuerpos estructurales (SAbDab), una base de datos curada de estructuras de anticuerpos disponibles públicamente, así como herramientas de modelado estructural, que se actualiza semanalmente en el Protein Data Bank (PDB) [3].

Los anticuerpos convencionales de tamaño completo se han utilizado en la investigación para la detección de proteínas mediante análisis de transferencia Western [4], inmunohistoquímica [5] y ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) [6] durante décadas. También se han desarrollado anticuerpos de tamaño completo para aplicaciones de diagnóstico como pruebas de embarazo y detección de bacterias y virus en sangre, como un ELISA que detecta el VIH. Además, los anticuerpos convencionales de tamaño completo se utilizan comúnmente en la terapéutica de enfermedades. Por ejemplo, infliximab es uno de los muchos anticuerpos disponibles que reconocen el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) y se utiliza en el tratamiento de la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide [7, 8]. El trastuzumab, o Herceptin, es un anticuerpo que se une al receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico y se utiliza en el tratamiento del cáncer de mama metastásico [9]. También existen varias terapias basadas en anticuerpos, incluido Muromonab [10], que se administra a los receptores de trasplantes para prevenir el rechazo del aloinjerto.

Aunque los anticuerpos convencionales de tamaño completo se pueden usar para aplicaciones terapéuticas, existen ventajas y desventajas al usar el anticuerpo completo. Una ventaja importante de los anticuerpos convencionales es el hecho de que la región Fc activa la respuesta inmunitaria del cuerpo y puede apuntar a los antígenos unidos para su destrucción. Esta región Fc también puede ser una desventaja en algunas aplicaciones clínicas porque la respuesta inmune que provoca típicamente puede ser perjudicial para la salud del paciente. Además, los anticuerpos de tamaño completo no pueden penetrar bien en ciertos tejidos debido a su tamaño relativamente grande [11]. En algunos casos, cuando se usan anticuerpos de tamaño completo para aplicaciones de diagnóstico, el dominio Fc puede causar una unión inespecífica significativa, lo que puede afectar las aplicaciones de detección.

Para muchas aplicaciones, se prefieren los fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos se pueden producir mediante mecanismos químicos o genéticos. La fragmentación química utiliza agentes reductores para romper los enlaces disulfuro dentro de la región bisagra y la digestión del anticuerpo con proteasas que incluyen pepsina, papaína y ficina. La construcción genética de fragmentos ofrece la capacidad de crear una multitud de moléculas que contienen fragmentos, cada una con características funcionales y de unión únicas.

La digestión química y con proteasas de anticuerpos IgG o IgM de tamaño completo produce fragmentos de unión a antígeno (Fab Figura 1) y fragmentos Fc, compuestos únicamente por los dominios CH2 y CH3 de cadena pesada. Los métodos bioquímicos para generar fragmentos de anticuerpos producen herramientas útiles para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas, pero es bastante laborioso y requiere una gran cantidad de material de partida de anticuerpos.

Los fragmentos de unión a antígeno producidos por digestión bioquímica incluyen Fab, (Fab & # 39) 2, Fab & # 39 y FV, todos los cuales carecen de la región Fc. Los fragmentos F (ab) monovalentes tienen un sitio de unión al antígeno, mientras que los fragmentos divalentes (Fab & # 39) 2 tienen dos regiones de unión al antígeno que están unidas por enlaces disulfuro. Se producen dos fragmentos F (ab) individuales cuando se digiere un anticuerpo de tamaño completo con enzima papaína. Un fragmento F (ab & # 39) 2, que retiene una porción de la región bisagra, es producido por digestión con pepsina de anticuerpos IgG o IgM. La reducción de los fragmentos F (ab ') 2 produce 2 fragmentos Fab & # 39 monovalentes, que tienen un grupo sulfhidrilo libre que es útil para la conjugación con otras moléculas. FV Los fragmentos son el fragmento más pequeño elaborado a partir de la escisión enzimática de anticuerpos de clase IgG e IgM (Figura 1). FV Los fragmentos tienen el sitio de unión al antígeno formado por VH y VL regiones, pero carecen de las regiones constantes de Fab (CH1 y CL) regiones (Figura 1, panel derecho). La VH y VL se mantienen juntos en FV fragmentos por interacciones no covalentes. Los fragmentos se pueden generar a través de kits disponibles comercialmente, por ejemplo, F (ab & # 39) 2 Fragmentation Kit de G-Biosciences [12].

Los métodos de ingeniería genética permiten la producción de fragmentos variables de cadena única (scFv), que son FV fragmentos de tipo que constan de la VH y VL dominios enlazados por un péptido enlazador flexible diseñado (Figura 1) [13]. La manipulación de la orientación de los dominios V y la longitud del enlazador crea diferentes formas de FV moléculas [14]. Cuando el enlazador tiene al menos 12 residuos de longitud, los fragmentos scFv son principalmente monoméricos (como se muestra en la Figura 1) [14]. Los enlazadores que son de 3-11 residuos producen moléculas scFv que no pueden plegarse en un F funcionalV dominio. Estas moléculas se asocian con una segunda molécula scFv, que crea un diacuerpo bivalente [15]. Si la longitud del conector es inferior a tres residuos, las moléculas scFv se asocian en triacuerpos o tetracuerpos [14]. Por ejemplo, Tao Y et al generaron un diacuerpo VH-VL con un enlazador GGGGS corto y un scFv con un enlazador GTTAASGSSGGSSSGA largo [16]. Los scFv multivalentes poseen una mayor afinidad de unión funcional a sus antígenos diana como resultado de tener dos sitios de unión de antígenos diana más, lo que reduce la tasa de inactividad del fragmento de anticuerpo [17]. Los minicuerpos son scFv-CH3 proteínas de fusión que se ensamblan en dímeros bivalentes [18].Se pueden generar pequeños fragmentos scFv con dos dominios variables diferentes para producir fragmentos bis-scFv biespecíficos capaces de unirse a dos epítopos diferentes al mismo tiempo [19]. Los métodos genéticos también se utilizan para crear dímeros Fab biespecíficos (Fab2) y trímeros Fab triespecíficos (Fab3) [19]. Estos fragmentos de anticuerpos son capaces de unirse simultáneamente a 2 o 3 antígenos diferentes, respectivamente. Los investigadores a menudo utilizan fragmentos scFv para estabilizar complejos de proteínas en estudios de estructura de proteínas [20].

Además de los anticuerpos convencionales, las especies de camélidos y tiburones (squalidae) contienen un subconjunto de anticuerpos de cadena pesada peculiares (hcAb) compuestos exclusivamente por homodímeros de cadena pesada que carecen de cadenas ligeras [21, 22]. Las porciones Fab de estos anticuerpos, llamadas VHH en los camélidos y VNAR en los tiburones, son las regiones de unión a antígenos más pequeñas que se encuentran de forma natural [23]. Los nanocuerpos son dominios recombinantes derivados de VHH capaces de unirse a antígenos, a menudo clonados a partir de bibliotecas de fagos de VHH, como las que protegen contra las proteínas betacoronarivus S [24] o contra el dominio RBD de la proteína espiga del SARS-CoV-2 [25]. Se han estudiado su termodinámica y estructuras de unión ([26] y su referencia en el mismo). Los nanocuerpos son muy estables y pueden producirse fácilmente en grandes cantidades mediante el uso de sistemas de expresión de proteínas simples comunes como las bacterias (los anticuerpos funcionales convencionales de tamaño completo son difíciles de expresar correctamente en un sistema bacteriano), lo que representa una herramienta prometedora para fines de investigación y terapéuticos. , especialmente en las áreas de microscopía de superresolución, espectrometría de masas y degradación de proteínas dirigida [27]. Los nanocuerpos también pueden administrarse dentro de las células vivas mediante conjugados con péptidos [28, 29] o in vivo [30], o expresarse directamente in vivo y reconocer sus objetivos in vivo. Los nanocuerpos contra RFP o GFP, cuando se conjugaron con tintes Atto de color rojo lejano, alcanzaron un aumento de 118 veces de las señales fluorescentes sobre GFP o RFP, y se utilizaron para generar conectividad neuronal de ratón de cuerpo entero [31]. También se han utilizado para estabilizar el estado activo de las proteínas en estudios estructurales [32]. Se está examinando un sistema de expresión con múltiples nanocuerpos concatenados contra diferentes cepas de influenza como un medio para generar una vacuna universal contra la influenza [33]. Los nanocuerpos secundarios anti-IgG recombinantes tienen un gran potencial para reemplazar los anticuerpos secundarios policlonales ampliamente utilizados producidos con animales [34].

Los nanocuerpos tienen la capacidad única de cruzar la barrera hematoencefálica [35, 36], sin embargo, los nanocuerpos tienden a procesarse y eliminarse muy rápidamente del cuerpo [37]. Los nanocuerpos se pueden utilizar para métodos como la inmunoprecipitación, por ejemplo, RFP-Trap MA de Chromotek [38], o acoplarse a proteínas fluorescentes para rastrear objetivos intracelulares en células vivas en tiempo real [39].

Aproximadamente el 10% de las inmunoglobulinas bovinas contienen una tercera región determinante de complementariedad de cadena pesada inusualmente larga (CDR 3H) con un gran número de residuos de cisteína [40-42]. Estas cisteínas se emparejan para formar enlaces disulfuro que conducen a una estructura similar a un tallo y un botón en el dominio de unión al antígeno [42]. Este dominio CDR3H excepcionalmente largo con el tallo largo contribuye a la diversidad de la especificidad del anticuerpo bovino.

Los intracuerpos, o anticuerpos intracelulares, se refieren a anticuerpos o sus fragmentos (generalmente de diseño scFv) expresados ​​directamente dentro de las células o en animales in vivo a través de un vector de expresión. Por ejemplo, Dong JX et al desarrollaron varios nanocuerpos contra proteínas neuronales para la expresión intracelular como intracuerpos [43]. Una consideración / advertencia importante es el entorno intracelular reductor que disminuye la afinidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo cuya unión con el antígeno depende de enlaces disulfuro intradominio. Otra consideración es que los intracuerpos tienden a agregarse. Kabayama H et al diseñaron intracuerpos con una carga de ingurgitación neta incluso al pH citoplasmático más bajo de 6,6 para generar anticuerpos citoplasmáticos ultraestables [44]. Los intracuerpos se utilizan como alternativas a los inhibidores farmacológicos para dirigirse a participantes endocíticos específicos. Por ejemplo, la expresión de un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado del anticuerpo monoclonal 3B12A contra la señal de exportación nuclear de TDP-43 en células HEK293A o después de la electroporación in utero de su vector de expresión promovió la proteólisis de agregados de TDP-43 en cultivos células y cerebro embrionario de ratón [45]. La entrega mediada por virus en el sistema nervioso de un anticuerpo scFv contra el motivo de reconocimiento de ARN 1 de TDP-43 redujo la microgliosis en un modelo de ratón de neuroinflamación aguda y deterioro cognitivo mitigado, defectos motores, proteinopatía de TDP-43 y neuroinflamación en ratones transgénicos que expresan Mutaciones de TDP-43 relacionadas con la esclerosis lateral amiotrófica [46]. El potencial de los intracuerpos como modalidad terapéutica aún está por emerger.

Un fragmento de anticuerpo también se puede enlazar con una etiqueta de importación de células, como una etiqueta IPTD [47], para facilitar su entrada en las células.

Los fragmentos de anticuerpos ofrecen ciertas ventajas sobre un anticuerpo de tamaño completo para algunas aplicaciones. Este tema fue revisado por Nelson [48]. Una ventaja de los fragmentos sobre los anticuerpos de tamaño completo es que los fragmentos de anticuerpos son más pequeños que los anticuerpos convencionales y generalmente carecen de glicosilación, lo que permite su producción en sistemas de expresión procarióticos, lo que permite ahorrar tiempo y dinero. Además, los fragmentos son lo suficientemente pequeños como para infiltrarse en algunos tejidos que los anticuerpos de tamaño completo no pueden penetrar, lo que ayuda en muchos procedimientos terapéuticos e inmunohistoquímicos [11]. Además, la falta de dominio Fc es una ventaja sustancial para los anticuerpos primarios usados ​​en inmunohistoquímica y otras aplicaciones de detección porque han reducido en gran medida la unión no específica al receptor Fc. Un scFv que se usa comúnmente en el diagnóstico es el anticuerpo NC10 contra la neuraminidasa de la influenza. El anticuerpo MOC-31 contra la molécula de adhesión de células epiteliales Ep-CAM es un scFv comúnmente utilizado como terapia contra el cáncer. Los diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos tienen usos potenciales en aplicaciones tales como radioinmunoterapia y diagnóstico por imagen in vivo [49]. Sin embargo, los fragmentos que carecen del dominio Fc se degradan en el cuerpo mucho más rápidamente que los anticuerpos convencionales [50] y no pueden desencadenar procesos citotóxicos mediados por Fc a menos que estén conjugados con un resto efector [51], lo que requiere una mayor optimización para terapias basadas en fragmentos de anticuerpos.

Aunque varios fragmentos de anticuerpos ofrecen ciertas ventajas, no se utilizan comúnmente en experimentos. En los más de 60.000 artículos seleccionados manualmente por Labome, solo unos pocos artículos citaron aplicaciones de fragmentos Fab de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpo Fab anti-digoxigenina de Roche (11093274910) y los fragmentos de anticuerpo Fab anti-fluoresceína (11426338910) se generan en ovejas y se producen mediante digestión con papaína. Se utilizaron fragmentos Fab anti-digoxigenina para hibridaciones in situ ya que las sondas de ARN están marcadas con digoxigenina [52-54]. También se utilizaron para realizar análisis de plegamiento de proteínas para estudiar el proceso de plegamiento de una sola molécula de calmodulina mediante espectroscopia de fuerza de una sola molécula [55]. Los fragmentos F (ab) de anticuerpos secundarios anti-ratón se utilizan a menudo para bloquear la Ig endógena de ratón durante la inmunotinción, por ejemplo, el fragmento AffiniPure Fab IgG anti-ratón de burro de Biozol (JIM-715-007-003) [56].

B Shen et al realizaron la tinción de montaje completo de la mitad de los huesos de ratón con Alexa Fluor 647-AffiniPure F (ab & # 39) 2 fragmentos de burro anti-pollo IgY a 1: 250, Alexa Fluor 488-AffiniPure F (ab & # 39) 2 fragmentos de burro IgG anti-conejo a 1: 250, Alexa Fluor 488-AffiniPure F (ab & # 39) 2 fragmentos de IgG anti-conejo de burro (a 1: 250 (todos de Jackson ImmunoResearch) [57]. Invitrogen Alexa Fluor 546 conjugado con anti-cabra -fragmento F (ab & # 39) 2 de IgG de conejo se utilizó para realizar inmunohistoquímica para investigar el papel de sFLT-1 en el mantenimiento de la capa de fotorreceptores avasculares en modelos de ratón [58] y el fragmento Invitrogen Alexa Fluor 488 (Fab & # 39) 2 de conejo anti-IgG de cabra (H + L) se utilizó en inmunohistoquímica para investigar el mecanismo de regeneración del enlace de punta en las células ciliadas auditivas [59].

Los receptores Fc (FcR) son moléculas que se expresan principalmente en las células inmunitarias innatas, que reconocen y se unen al dominio Fc de los anticuerpos y, por lo tanto, inician una respuesta inmunitaria basada en células. Las diversas funciones de los FcR reflejan la amplia gama de funciones protectoras o moduladoras de los anticuerpos, incluida la mediación de la neutralización y el aclaramiento de sustratos objetivo, así como la programación de la inmunidad adaptativa [60]. Las funciones biológicas de los FcR están reguladas por motivos de activación inmunorreceptores basados ​​en tirosina (ITAM) y motivos inhibidores inmunorreceptores basados ​​en tirosina (ITIM), que actúan como interfaz del receptor con las vías de señalización activadora e inhibidora, respectivamente. Por tanto, la señalización por los ITAM puede provocar la activación celular, la fagocitosis y la endocitosis, mientras que la señalización por los ITIM tiene un efecto inhibidor sobre la activación celular [61]. Se han descrito FcR para todas las clases de inmunoglobulinas y algunas de ellas se describen a continuación.

Esta familia incluye FcγRI, FcγRII, FcγRIII y sus isoformas. Son responsables de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ACDP) [60].

Otro receptor que se une a IgG es el receptor Fc neonatal (FcRn), que participa en la transferencia de inmunidad humoral pasiva de una madre a su feto. El FcRn también protege a la IgG de la degradación in vivo, lo que explica su larga vida media en el suero [62]. Este fenómeno ha llevado al desarrollo de mejores anticuerpos terapéuticos al introducir alteraciones en la región Fc para promover la interacción Fc-FcRn.

Incluyen el FcεRI de alta afinidad, que es capaz de unirse a IgE monomérica, y la lectina de tipo C de baja afinidad FcεRII, que interactúa preferentemente con el complejo IgE. FcεRI media la respuesta de hipersensibilidad inmediata de muchas reacciones alérgicas al estimular la desgranulación y la liberación de una serie de mediadores inflamatorios en mastocitos y basófilos [63]. El FcεRII existe tanto en una forma unida a la membrana que entrega una señal de regulación a la baja para la síntesis de IgE [63], como también a fragmentos solubles que generan una regulación al alza opuesta en la síntesis de IgE [64]. Su papel en la transcitosis de los complejos IgE-alérgeno en las vías respiratorias humanas y el epitelio intestinal se está investigando activamente como un objetivo potencial para la inflamación alérgica de las vías respiratorias como resultado de las alergias alimentarias [65, 66].

El único miembro del grupo de receptores de IgA, FcαRI, se expresa solo en células del linaje mieloide. Desempeña un papel tanto en las respuestas proinflamatorias como en las antiinflamatorias, según el estado de unión de IgA. Si bien la unión de IgA secretora (SIgA) presente en los sitios de la mucosa tiene efectos antiinflamatorios que incluyen la prevención de la invasión de patógenos, la unión de IgA sérica conduce a respuestas inflamatorias. El FcαRI también regula la viabilidad de los neutrófilos en función del microambiente inflamatorio [67].

TRIM21 se puede distinguir de otros FcR porque muestra una amplia especificidad de anticuerpos. Puede unirse a IgG, IgM e IgA [68-70]. También se expresa en células de la mayoría de los linajes histogénicos [71]. TRIM21 participa en la interferencia mediada por anticuerpos de la replicación viral al dirigirse a complejos virus-anticuerpo citosólicos para la degradación proteasomal.

La unión de dominios Fc a FcR puede tener efectos no deseados en métodos analíticos basados ​​en anticuerpos monoclonales tales como inmunohistoquímica (IHC), clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). La unión no específica a FcR puede introducir ruido de fondo que puede conducir a la detección de falsos positivos. Las soluciones para abordar este problema incluyen el uso de (i) controles de isotipo para la activación, (ii) suero para competir ampliamente por los receptores implicados en la unión no específica o (iii) IgG purificada para bloquear específicamente los receptores Fc [72]. El bloqueador del receptor Innovex Fc # NB309 se puede utilizar para bloquear la parafina o secciones congeladas durante experimentos de IHC o IC [73] o BD Biosciences # 553142 [73, 74], bloque del receptor Miltenyi Biotec Fc [75, 76] para la citometría de flujo. Por ejemplo, Chopra S et al bloquearon la unión de FcγR con 5 μg / ml TruStain fcX (anti-ratón CD16 / 32, clon 93) de BioLegend durante la citometría de flujo y la clasificación celular [77].

La Dra. Macarena Fritz Kelly de São José dos Campos, SP, Brasil, contribuyó con la sección sobre receptores Fc en septiembre de 2018.


Anticuerpos Anti His tag

Al igual que la MBP (proteína de unión a maltosa) y la etiqueta GST, la etiqueta His es una pequeña etiqueta de epítopo que consta de entre seis y nueve residuos de histidina, que se clona en un vector de expresión aguas arriba o aguas abajo de un gen de interés. A continuación, el vector se introduce en un sistema de expresión como bacterias, levaduras o células de insectos. El resultado es la expresión de una proteína recombinante que lleva una etiqueta de polihistidina en su extremo N o C terminal.

Para purificar la proteína recombinante se realiza cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). Esta técnica se basa en el hecho de que un cordón de residuos de histidina se une a metales inmovilizados como el níquel.

Pueden usarse anticuerpos anti-histidina para controlar el progreso de la purificación y la fracción que contiene la proteína recombinante mediante transferencia Western, y para verificar que no tiene lugar degradación proteolítica de la proteína recombinante.


Protocolo de citometría de flujo

Si bien los laboratorios de todo el mundo continúan optimizando el protocolo de citometría de flujo, convencionalmente incluye los siguientes pasos:

  1. Las células se fijan con formaldehído para inmovilizar las proteínas de interés y sus eventos transitorios de señalización. o se agrega detergente al tubo de ensayo para hacer que las células sean permeables a los anticuerpos que luego pueden ingresar a sus espacios intracelulares. se añaden y deben elegirse con cuidado para permitir una orientación óptima de los epítopos y una detección de antígenos adecuada cuando se tiñen múltiples proteínas de superficie e intracelulares, simultáneamente.
  2. El tubo de ensayo se coloca en el citómetro de flujo y se permite que el líquido alcance & # 8211 y luego salga a través & # 8211 de la cámara de flujo, una celda a la vez.
  3. A medida que cada celda cruza el rayo láser, la luz que rebota se transmite a los detectores de luz / color.
  4. Los datos recuperados de este experimento finalmente pueden ser analizados para desentrañar las facetas únicas de las propias células y sus patrones de señalización celular.

La tinción de anticuerpos también puede variar:

  • Con tinción directa, las células se incuban con un anticuerpo conjugado directamente con un fluorocromo (por ejemplo, FITC). Esta es una incubación de un solo paso y es particularmente útil para la tinción intracelular.
  • En indirectotinción, el anticuerpo primario no está marcado, sino que es detectado por un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo. Este método significa que se pueden generar anticuerpos primarios no conjugados contra muchos objetivos diferentes, lo que amplía la elección de proteínas objetivo para el investigador.
  • Tinción intracelular se refiere a una tinción de antígenos intracelulares.
  • Finalmente, las proteínas secretadas por una célula se pueden marcar y rastrear con un bloqueo de Golgi, seguido de tinción intracelular.

Conjugación covalente y específica de Fc de una proteína fluorescente a un anticuerpo nativo a través de una estrategia de fotoconjugación para la fabricación de un nuevo anticuerpo fluorescente fotoestable

Los conjugados fluoróforo-anticuerpo con alta resistencia al fotoblanqueo, alta estabilidad química y unión específica de Fc son una gran ventaja para la obtención de imágenes por inmunofluorescencia. Aquí, una proteína de unión a Fc (dominio Z) que lleva un foto-reticulante (pag-benzoilfenilalanina, Bpa) fusionada con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), concretamente Z fotoactivableBpa–EGFP recombinante, se generó directamente usando la técnica de aminoacil-tRNA sintetasa / supresor tRNA sin ninguna modificación adicional. Empleando el fotoactivable ZBpa–EGFP, se desarrolló con éxito un enfoque óptimo que permitió a EGFP unirse de manera selectiva y covalente al anticuerpo nativo (IgG) con aproximadamente un 90% de eficiencia de conjugación. Después de caracterizar la forma covalente y específica de Fc del anticuerpo fotoconjugado con EGFP, se demostró su excelente resistencia al fotoblanqueo para la obtención de imágenes de inmunofluorescencia en un estudio modelo mediante el seguimiento de la expresión del receptor 4 tipo toll (TLR4) en células HepG2. El enfoque propuesto aquí para la preparación de un nuevo anticuerpo fluorescente está disponible y es confiable, que desempeñaría un papel importante en el inmunoensayo de fluorescencia, y se espera que se extienda a la generación de otros anticuerpos fotoconjugados con biomoléculas, como otras proteínas fluorescentes para multiplex. imágenes de inmunofluorescencia o enzimas informadoras para inmunoensayos enzimáticos de alta sensibilidad.

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Figuras complementarias y síntesis orgánicas. Los siguientes están disponibles en línea en https://www.mdpi.com/1424-8247/14/3/247/s1, Figura S1: Estructuras químicas de cargas útiles Exatecan y DXd, Figura S2: Estructuras de fármaco-anticuerpo basado en trastuzumab conjugados, Figura S3: Caracterización RPLC-QToF representativa de ADC, Figura S4: Parámetros farmacocinéticos (estudio PK en ratas Sprague-Dawley), Figura S5: Curva de supervivencia del estudio de xenoinjerto SCID / NCI-N87.

L.C. y W.V. diseñó y realizó los experimentos, interpretó los resultados y redactó el manuscrito. E.F., A.M. y E.-L.M. realizó los experimentos. B.J. y G.F. diseñó y realizó los experimentos e interpretó los resultados. CD. diseñó los experimentos, interpretó los resultados y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.


Nanopartículas conjugadas con anticuerpos para aplicaciones biomédicas

La nanociencia y la nanotecnología se han abierto camino en los campos de la biotecnología y la medicina. Las nanopartículas por sí mismas ofrecen propiedades fisicoquímicas específicas que no exhiben a granel, donde los materiales muestran propiedades físicas constantes independientemente del tamaño. Los anticuerpos son productos biológicos de tamaño nanométrico que forman parte del sistema inmunológico específico. Además de sus propias propiedades como patógenos o neutralizadores de toxinas, así como en el reclutamiento de elementos inmunes (complemento, mejora de la fagocitosis, citotoxicidad dependiente de anticuerpos por células asesinas naturales, etc.), podrían portar varios elementos (toxinas, fármacos, fluorocromos , o incluso nanopartículas, etc.) y ser utilizado en varios procedimientos de diagnóstico, o incluso en terapia para destruir un objetivo específico. La conjugación de anticuerpos a nanopartículas puede generar un producto que combine las propiedades de ambos. Por ejemplo, pueden combinar el tamaño pequeño de las nanopartículas y sus características especiales térmicas, de imagen, portadoras de fármacos o magnéticas con las capacidades de los anticuerpos, como el reconocimiento específico y selectivo. El producto híbrido mostrará versatilidad y especificidad. En esta revisión, analizamos tanto los anticuerpos como las nanopartículas, centrándonos especialmente en los desarrollos recientes de las nanopartículas conjugadas con anticuerpos, ofreciendo al investigador una visión general de las diferentes aplicaciones y posibilidades de estos vehículos híbridos.

1. Introducción

Según Lux Research, en 2006, los gobiernos, corporaciones y capitalistas de riesgo de todo el mundo gastaron $ 12.4 mil millones en investigación y desarrollo de nanotecnología, casi un 30% más que en 2005. Para 2014, Lux estima $ 2.6 billones o aproximadamente el 15% de la producción global total en productos manufacturados. incorporará nanotecnología [1].

Como muchas otras industrias, la nanociencia y la nanotecnología también se han abierto camino en los campos de la biotecnología y la medicina. La producción mundial estimada de nanomateriales artificiales aplicados en biotecnología alcanzará en 2010 1 Tn / año, y en 2020 ese valor aumentará a 10 Tn / año [2]. La nanotecnología ya está presente en muchos productos médicos comercializados. Sin embargo, muchos de ellos no están disponibles directamente para el consumidor, sino que se utilizan con fines de investigación [1].

Las nanopartículas por sí mismas ofrecen propiedades fisicoquímicas específicas que no exhiben a granel donde los materiales muestran propiedades físicas constantes independientemente de sus tamaños. Estas propiedades hacen que las nanopartículas sean aplicables en muchas aplicaciones biomédicas. En comparación con las micropartículas, las nanopartículas muestran una mayor proporción de área superficial a volumen, lo que implica que pueden producir una mayor eficiencia de unión. Además, las partículas más grandes pueden bloquear regiones de unión específicas en las células que obstaculizan los receptores celulares. Sin embargo, algunas propiedades físicas se mejoran mediante el uso de micropartículas en comparación con las nanopartículas. Por ejemplo, si son magnéticas, se prefieren las partículas más grandes debido a su respuesta más rápida a un gradiente magnético. Sin embargo, para cualquier en vivo Las micropartículas no biodegradables de aplicación biomédica serán excluidas debido a su potencial acumulación en el bazo y los riñones debido a la capacidad de exclusión de tamaño de esos órganos.

La conjugación de diferentes restos a las nanopartículas amplía sus campos de aplicación y les proporciona propiedades nuevas o mejoradas. Se puede conjugar una variedad de biomoiedades a las nanopartículas, incluidos ligandos de bajo peso molecular (ácido fólico, tiamina, ácido dimercaptosuccínico), péptidos (RGD, LHRD, péptidos antigénicos, péptidos de internalización), proteínas (BSA, transferrina, anticuerpos, lectinas, citocinas, fibrinógeno, trombina), polisacáridos (ácido hialurónico, quitosano, dextrano, oligosacáridos, heparina), ácidos grasos poliinsaturados (ácido palmítico, fosfolípidos), ADN, plásmidos, ARNip, etc.

La mayoría de los restos mencionados muestran una selectividad probada y claras ventajas como la capacidad de atravesar membranas biológicas. Por ejemplo, ciertas regiones del péptido TAT conocidas como dominios de transducción de proteínas pueden atravesar las membranas biológicas mediante mecanismos que son independientes de los transportadores y la endocitosis mediada por receptores. La susceptibilidad de los péptidos a ser desnaturalizados por proteasas y su corta duración de la circulación vascular son sus principales inconvenientes. Las moléculas sintéticas de ADN o ARN conocidas como aptámeros también son capaces de reconocer proteínas específicas. La principal ventaja de utilizar aptámeros en comparación con los anticuerpos es su in vitro proceso de selección sin utilizar animales, además de su pequeño tamaño, falta de inmunogenicidad y facilidad de aislamiento. Las principales desventajas del uso de aptámeros en comparación con los anticuerpos son el alto costo de generarlos, especialmente en grandes cantidades, y su susceptibilidad a la degradación enzimática.

La conjugación de nanopartículas con anticuerpos combina las propiedades de las propias nanopartículas con la capacidad de reconocimiento específico y selectivo de los anticuerpos frente a los antígenos. Además, la mejora en la captación celular así como la mayor estabilidad intracelular pueden ser dos de las principales ventajas del uso de nanopartículas conjugadas con anticuerpos.

En esta revisión analizamos los desarrollos alcanzados mediante el uso de nanopartículas conjugadas con anticuerpos, ofreciendo al lector un alcance general de las diferentes aplicaciones y posibilidades de esos vehículos híbridos. Además, describimos brevemente las posibilidades de conjugación para aquellos interesados ​​en la química específica involucrada. En esta revisión no se han considerado las nanopartículas conjugadas con péptidos y proteínas distintas de los anticuerpos. Los dendrímeros conjugados, los polímeros dendríticos, los puntos cuánticos, los nanotubos de carbono y las micelas se han excluido de esta revisión porque cada uno merece lo suyo.

2. Anticuerpos: estructura y función

Las inmunoglobulinas o anticuerpos son un grupo de glicoproteínas que constituyen uno de los mecanismos de defensa específicos más importantes en los animales vertebrados. Todos ellos tienen una estructura muy similar en forma de Y (Figura 1) de moléculas bifuncionales con dos dominios idénticos para el reconocimiento de antígenos (fragmento Fab), y dos dominios idénticos con funciones efectoras (fragmento Fc). La región de unión al antígeno es muy específica y varía entre los anticuerpos. Se pueden generar miles de millones de anticuerpos diferentes, cada uno con una especificidad distinta.


Estructura de una molécula de Ig que lleva dos cadenas pesadas y dos ligeras unidas por puentes de disulfuro. Se muestran los productos resultantes de la acción de las enzimas (papaína y pepsina).

Los anticuerpos tienen dos cadenas ligeras idénticas de 24-25 kD (ya sea,

) y dos cadenas pesadas, también idénticas, de 55-70 kD (

) unida por puentes de disulfuro [3-6]. El tipo de inmunoglobulina generada depende del tipo de cadena pesada y, por tanto, en los animales vertebrados se pueden distinguir cinco clases o isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgD, IgA e IgM), cada una con una funcionalidad distinta. Además de los puentes de disulfuro entre las cadenas, existen puentes de disulfuro intracatenarios que proporcionan estabilidad a la molécula [7]. La cadena ligera (L) está formada por dos dominios de alrededor de 100 residuos, conocidos como dominio variable (

), en su extremo aminoterminal, y el dominio constante (CL). La cadena pesada (H) contiene un dominio variable (

) y tres o cuatro dominios constantes (

), en función del isotipo [8]. Las regiones variables son las zonas de la molécula implicadas en la unión del antígeno, donde las regiones hipervariables más divergentes, o regiones determinantes complementarias (CDR), son tres en el dominio VL y tres en el dominio VH [9, 10]. Estas regiones están separadas por regiones estructurales llamadas marco (FRW), que tienen secuencias altamente conservadas.

Las inmunoglobulinas (Igs) se encuentran como receptores de membrana en los linfocitos B, que son una subpoblación de leucocitos. Después de la activación mediada por antígenos (virus, bacterias, parásitos) y en colaboración con otras células inmunitarias (como los linfocitos T), los linfocitos B se convierten en células plasmáticas que secretan anticuerpos. Luego, los anticuerpos pueden liberarse de la célula y tener diferentes funciones efectoras.

Entre sus funciones más importantes se encuentran las siguientes:

(1) neutralización y bloqueo de patógenos y toxinas (2) activación del complemento: las IgM e IgG activan una cascada proteolítica, que conduce eventualmente a la apertura de poros en la membrana de los patógenos o células diana (3) opsonización y fagocitosis: los IgG son el principal tipo de anticuerpos capaces de facilitar la fagocitosis de patógenos, uniéndose a receptores de macrófagos y células dendríticas (4) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), células asesinas naturales (NK) y macrófagos que lisan células en presencia de anticuerpos dirigidos a las células diana, para lograr esto, la porción Fc del anticuerpo se une a las células diana, que secretan proteínas granulares que median en las funciones citolíticas (5) respuestas a parásitos y respuestas alérgicas: la IgE está involucrada en respuestas alérgicas a través de la activación de los mastocitos, que liberan sus gránulos cargados (de histamina, prostaglandinas, etc.). También participa en la eliminación de parásitos, con la ayuda de eosinófilos (6) Protección de las mucosas: la IgA se encarga de la protección de las mucosas (respiratoria, digestiva) y está presente en las secreciones, como la leche materna.

3. Anticuerpos monoclonales

En 1975, César Milstein y George Köhler inmortalizaron células B productoras de anticuerpos mediante su fusión con células tumorales para obtener células híbridas o hibridomas (Figura 2).


Estas células son capaces de producir un solo tipo de anticuerpo en grandes cantidades ya que derivan de una sola célula que se divide en células idénticas, el anticuerpo que generan se conoce como anticuerpo monoclonal. Los dos investigadores fueron galardonados con el Premio Nobel de Medicina o Fisiología en 1984, por hacer posible el uso de anticuerpos dirigidos contra objetivos específicos en gran número, lo que ha supuesto una revolución en muchos campos del conocimiento, especialmente en la biomedicina.

La producción de anticuerpos monoclonales comienza con la inmunización repetida de animales de laboratorio (generalmente ratones o ratas), a los que se les inyecta a intervalos el antígeno, contra el cual se pretende desarrollar el correspondiente anticuerpo. Después de varias inmunizaciones, cuando los linfocitos B comienzan a proliferar en respuesta al antígeno, se elimina el órgano linfoide activado, generalmente el bazo, que se ha convertido en una fuente primaria de linfocitos B específicos de antígeno. Posteriormente, los linfocitos se fusionan con células tumorales B de ratón (mielomas), que son capaces de proliferar indefinidamente cuando se cultivan. in vitro bajo condiciones específicas. Sin embargo, carecen de algunas de las enzimas necesarias para la síntesis de nucleótidos y, además, son incapaces de secretar su propia Ig endógena. El resultado es un hibridoma, una célula que combina la capacidad del linfocito B de producir un anticuerpo específico con la capacidad de la célula de mieloma de reproducirse indefinidamente. Los hibridomas se pueden congelar y descongelar, lo que permite conservarlos por tiempo indefinido. Esto significa, entre otros atributos, la disponibilidad de una fuente inagotable de anticuerpos específicos y homogéneos.

Sobre todo, los anticuerpos monoclonales (mAb) han supuesto una revolución en el campo del diagnóstico clínico, para la depuración de productos (factores de coagulación, interferón), para el diseño de nuevas tecnologías, y también se han introducido activamente en el tratamiento de diversas enfermedades. En diagnóstico e investigación, han contribuido a incrementar el conocimiento de una gran variedad de moléculas, a definir las etapas de la leucemia, a identificar tumores y factores de transcripción, a definir especies, a cuantificar hormonas, a estudiar grupos sanguíneos, a caracterizar agentes infecciosos, además de una enorme cantidad de dianas que ahora se conocen gracias a los anticuerpos monoclonales. Con el fin de estandarizar la denominación de los anticuerpos producidos contra la membrana celular, especialmente la de los leucocitos, se ha acordado agrupar en un mismo grupo o numerar todos aquellos anticuerpos que reconocen una misma molécula de membrana. El concepto de diferenciación de clústeres (DC) ha surgido como consecuencia de este acuerdo, en el que, hasta la fecha, se han clasificado más de 300 moléculas diferentes. Estos se revisan y actualizan cada cuatro años en un taller internacional de CD. Como ejemplos, un linfocito T colaborador se conoce como CD3 + CD4 + por presentar esas moléculas de membrana, que son reconocidas por anticuerpos específicos, un linfocito T citotóxico es CD3 + CD8 + y un linfocito B es CD19 + CD20 +. Estos y muchos otros marcadores han mejorado el estudio de subpoblaciones celulares, han permitido una mejor definición de los estados de diferenciación y han ayudado en la identificación de leucemias, linfomas, tumores de mama, etc.

Además de los anticuerpos dirigidos contra moléculas de la membrana celular, existe una larga lista de anticuerpos que reconocen factores de transcripción, agentes patógenos, hormonas que ahora son imprescindibles en los laboratorios de Inmunología, Microbiología, Fisiología, Virología, Patología, Biología Celular, y muchas otras, y se utilizan principalmente en técnicas de diagnóstico, como ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, Western blot, inmunocromatografía o flujo lateral, nefelometría, métodos de aglutinación y precipitación, como algunos ejemplos.

4. Anticuerpos monoclonales en terapia

El enorme potencial terapéutico de los mAb se vio inicialmente socavado por ciertas dificultades "técnicas", que explican la gran brecha entre la obtención de mAb en cantidades suficientemente grandes en 1975 y el comienzo de su aplicación clínica. Esto comenzó en 1986, con el uso del anticuerpo anti-CD3 para evitar el rechazo en el trasplante de corazón, y no fue hasta 1997 que los mAbs ingresaron al campo de la onco-hematología, cuando la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) aprobó el Rituximab. (un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado) como el primer anticuerpo para la terapia antitumoral (http://www.fda.gov/).

En la terapia antitumoral, en comparación con los agentes quimioterapéuticos convencionales, los mAb son proteínas de alto peso molecular con una cinética de distribución lenta y una capacidad limitada de penetración en los tejidos. Sin embargo, su enorme ventaja es que son específicos, minimizando así los efectos secundarios, ya que estarían dirigidos a sus dianas tumorales (antígenos) sin afectar o con un mínimo efecto sobre los tejidos sanos. La capacidad de los anticuerpos monoclonales para penetrar en los tumores o acceder a los sitios de inflamación es baja [11, 12]. En particular, en la terapia antitumoral, la expresión de antígenos y la irrigación sanguínea son los factores que limitan la eficacia de los mAb. Por lo tanto, para una eficacia óptima, el antígeno diana debe ser específico del tumor, expresarse intensamente y su expresión no debe ser susceptible de ser reducida. Los requisitos de mAbs para lograr una respuesta máxima serían: una vida media prolongada, el poder de penetrar, no inducir una respuesta inmune, y una eficacia citotóxica máxima [13].

4.1. Anticuerpos monoclonales de primera generación

Los primeros ensayos clínicos se realizaron con mAb de ratón o rata contra receptores en la superficie de células humanas, como linfocitos T (anti-CD3), linfocitos B (anti-CD20), etc. Sin embargo, dado que las secuencias de estos anticuerpos son murinas, su eficacia se vio afectada por la producción de Anticuerpos Humanos Anti-Ratón o Anti-Rata, HAMA o HARA, respectivamente, en pacientes que recibieron esta terapia. La generación de esta respuesta inmune es el principal impedimento para el éxito terapéutico con mAb murinos, ya que pueden provocar reacciones alérgicas importantes en tratamientos continuos, o una reducción de su eficacia terapéutica. Otras limitaciones son su corta vida media y la dificultad de interacción entre anticuerpos murinos y células humanas del sistema inmunológico.

En un intento por resolver parcialmente este problema, se utilizaron fragmentos de anticuerpos en lugar de un anticuerpo intacto. En concreto, cabe mencionar el uso de Fabs (fragmento de unión al antígeno), que incluyen las regiones variables tanto de las cadenas pesadas (Hv) como de las cadenas ligeras (Lv), así como el primer dominio constante de ambas cadenas (CH y CL ). Estos fragmentos no incluyen la región Fc, y esto significa que la inmunogenicidad que se puede producir es menor que si se usara un anticuerpo intacto. Los fragmentos Fab, que proporcionan la especificidad del anticuerpo, podrían usarse para bloquear o impedir estéricamente la función del antígeno diana, o para modular la función celular (mediante la unión de un antígeno diana capaz de traducir la señal intracelular). Sin embargo, la falta del fragmento Fc en el anticuerpo impide las diversas funciones específicas de esta región (facilitar la fagocitosis, activación del complemento, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), por lo que, dependiendo del objetivo deseado, la terapia podría volverse inútil.

4.2. Anticuerpos monoclonales de segunda generación

Las respuestas HAMA o HARA podrían evitarse si los anticuerpos monoclonales fueran completamente humanos. Sin embargo, diferentes dificultades técnicas no permitieron obtener anticuerpos monoclonales completamente humanos utilizando la técnica tradicional de fusión celular para producir hibridomas. A mediados de la década de 1980, las técnicas de biología molecular proporcionaron una herramienta muy importante, que permitió la producción de lo que se ha denominado “anticuerpos monoclonales de segunda generación” o “anticuerpos recombinantes”[14]. Estos anticuerpos se producen mediante la inmortalización de los genes que codifican la molécula de anticuerpo monoclonal, en lugar de inmortalizar la célula productora de anticuerpos monoclonales.

Dos características de estas proteínas han facilitado el modelado conceptual, el diseño y la ingeniería de moléculas artificiales basadas en Ig. A nivel genético, los genes estructurales que codifican las Ig son aptos para trabajar en Biología Molecular. Estos genes están organizados como exones discretos, que corresponden a dominios completos en la proteína, separados por regiones intrónicas. Por tanto, es sencillo manipular las secuencias intrónicas añadiendo cambios que permitan la introducción en el gen de nuevas secuencias en localizaciones específicas y previamente seleccionadas, sin riesgo de alterar la secuencia codificante presente en los exones. De igual forma, a nivel proteico, la organización estructural-funcional de las Igs se estructura en módulos discretos con dominios variables (V) y constantes (C) tanto en la cadena pesada (H) como en la ligera (L), lo que ha hecho que el logro de estos objetivos más fáciles.

Por lo tanto, es posible clonar dos regiones y, responsables de una especificidad requerida, y ensamblarlas como un anticuerpo funcional en cualquier clase o subclase de Ig humana [15]. Actualmente se dispone de un número considerable de sistemas de expresión para este fin [16]. Varias líneas de células eucariotas apoyan adecuadamente todos los procesos necesarios y asociados para la expresión, síntesis, ensamblaje y modificaciones posteriores a la traducción de los anticuerpos recombinantes [17].

En organismos procariotas, el conocimiento detallado del genoma, la arquitectura y el ciclo de vida de los bacteriófagos filamentosos [18, 19] y del fago lambda [20, 21] también ha permitido la expresión eficiente del ADN que codifica los anticuerpos en estos fagos y la posterior infección. de bacterias [22, 23]. Gracias a estos fagos, ha sido posible generar repertorios de anticuerpos (bibliotecas) muy grandes [24, 25] y, por lo tanto, ha sido posible imitar artificialmente la estrategia de selección empleada por el sistema inmunológico humoral. Actualmente, esta tecnología ofrece una de las formas más poderosas para crear anticuerpos artificiales con inmunogenicidad reducida y para la creación de repertorios de anticuerpos en bancos de genes combinatorios con un tamaño similar a los repertorios naturales.

4.2.1. Moléculas de anticuerpos completas

Estos anticuerpos son muy similares a los naturales, con los dos elementos estructurales presentes, lo que permite la funcionalidad de la molécula con las porciones Fab y Fc. Los anticuerpos primatizados, humanizados y quiméricos (Figura 3) se incluyen bajo este título. Un anticuerpo quimérico es una combinación de secuencias de diferentes especies, las más comunes son aquellas con una secuencia humana completa excepto las regiones variables, que son de origen murino. En los anticuerpos humanizados, solo algunas regiones pequeñas de los dominios variables (llamadas regiones hipervariables o CDR) pertenecen a la especie original y el resto tiene secuencias humanas. Por último, los anticuerpos primatizados se componen de regiones variables de los primates y regiones constantes de origen humano [26].


Esta variedad de anticuerpos requiere una nueva nomenclatura para identificar su origen. Por tanto, el sufijo-momab indica un origen murino, el sufijo-ximab implica que es un anticuerpo monoclonal quimérico y -zumab designa anticuerpos monoclonales humanizados. En muchos casos, una complicación adicional son las letras minúsculas que los preceden, como h o hu (humanizado), r (recombinante), o C (quimérico).

Anticuerpos quiméricos
Un anticuerpo quimérico es una molécula artificial donde las porciones constantes de las cadenas pesada y ligera son de una Ig humana, y las regiones variables, y, se obtienen de un anticuerpo monoclonal de ratón o rata. El objetivo de esta construcción es reducir la inmunogenecidad de los anticuerpos de ratón o rata, sin afectar la especificidad del anticuerpo original. Las regiones más inmunogénicas de la molécula de anticuerpo están asociadas a la porción constante de la molécula, la porción Fc [27]. Estas regiones son reemplazadas por equivalentes de origen humano para que la molécula resultante sea menos “extraña” para los humanos y, por tanto, haga su uso. en vivo más fácil para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades humanas. El término "quimérico", derivado de quimera, El mítico monstruo nacido de la unión de Typhon y Echidna con la cabeza de un león, el cuerpo de una cabra y la cola de una serpiente, fue elegido para este tipo de anticuerpo, ya que proceden de dos especies diferentes (humanos y ratones). .
La quimerización desarrollada por Morrison et al. [28] y Boullianne et al. [29] a mediados de la década de 1980 se basó en la clonación de genes murinos y su inserción en vectores de expresión eucariotas.Anteriormente, los genes codificantes de la porción constante de las cadenas pesadas y ligeras humanas se habían incorporado a estos vectores de expresión eucariotas, con aproximadamente el 34% de la secuencia siendo murina y el resto de origen humano [27, 30]. Estos vectores finalmente se transfectan de forma estable en una línea celular seleccionada. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se utiliza para clonar los genes y. El ARN mensajero o total obtenido de un hibridoma secretor de la especificidad requerida se usa como molde, y oligonucleótidos complementarios en el

extremos / terminales de cada gen como iniciadores. Se ha demostrado que el producto proteico generado por estas construcciones es capaz de reconocer y unirse al antígeno y mediar eficazmente en las funciones efectoras, como la activación del complemento y la interacción con los receptores Fc, al tiempo que muestra una inmunogenicidad reducida [31]. Actualmente, casi la mitad de los anticuerpos aprobados para terapia por la FDA son del tipo quimérico [32].

Anticuerpos humanizados
Desafortunadamente, algunas moléculas quiméricas aún pueden inducir una respuesta inmune humoral cuando se administran a humanos. Se han encontrado respuestas importantes de anticuerpos anti-quiméricos humanos (HACA) en el 40% de los productos utilizados en seres humanos [32]. Los esfuerzos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos llevaron a la creación, entre 1988 y 1991, de anticuerpos "humanizados". Esta tecnología incluye una variedad de procedimientos, como injerto de CDR, remodelación de Ab y revestimiento / revestimiento de Ab [33-35], basados ​​en la sustitución de los residuos de los dominios de anclaje o "estructura" de la región variable murina por secuencias humanas. , hasta que sólo las tres regiones hipervariables (5-10% de la secuencia) son de origen murino y el resto de origen humano [36]. El problema es que la manipulación de las regiones hipervariables murinas y su inserción en los dominios de anclaje humanos, generalmente conlleva una reducción en la afinidad del anticuerpo [33, 37], ya que su configuración tridimensional está alterada, pero los anticuerpos humanizados tienen la ventaja de ser menos inmunogénicos, más eficaces y tienen una vida media más larga (entre 3 y 24 días) que los anticuerpos quiméricos (entre 4 y 15 días) [11, 13].

Anticuerpos primatizados
Los anticuerpos primatizados son el resultado de una estructura quimérica de origen humano y de primates, como una copia casi exacta del anticuerpo humano con inmunogenicidad reducida y la posibilidad de utilizar dosis repetidas y una terapia a largo plazo [26]. Las regiones variables provienen de Macaca fascicularis (Macaca irus, macaco Cynomolgus), que son casi indistinguibles de los equivalentes humanos, y las regiones constantes son de origen humano. Keliximab y Clenoliximab son ejemplos de este tipo de anticuerpos, ambos en fase de prueba [38, 39], y están dirigidos contra una molécula presente en los linfocitos T auxiliares. Lumiliximab es otro anticuerpo de este tipo, un anticuerpo anti-CD23 que inhibe la producción de IgE y es una terapia potente en procesos alérgicos [40].

4.2.2. Moléculas recombinantes derivadas de anticuerpos

También se ha utilizado la biología molecular (Figura 3) para desarrollar un grupo más heterogéneo de nuevas proteínas, todas basadas en la estructura de los anticuerpos, ya sea como entidades recombinantes autónomas (Fragmentos de tipo Fab, Fv de la forma de cadena simple de scFv, diacuerpos, triacuerpos, biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de fagos), o como proteínas de fusión o anticuerpos conjugados, en los que la parte Fc o Fab se combina con nuevas propiedades que tienen una toxina, una enzima, un receptor celular, una citocina, etc.

Fragmentos de anticuerpos
Los fragmentos de anticuerpos ofrecen algunas ventajas sobre los anticuerpos intactos en terapia, especialmente contra tumores sólidos. La velocidad de penetración de un fragmento frente a una molécula intacta es la ventaja más notable. En 1988, Jain [11] estableció que una molécula intacta de IgG tardó 54 horas en penetrar 1 mm en un tumor sólido, mientras que un fragmento Fab logró la misma distancia en 16 horas.
Aunque la expresión de anticuerpos quiméricos y humanizados se ha llevado a cabo en células eucariotas, las bacterias (Escherichia coli) se han utilizado con mayor frecuencia para la producción de fragmentos de anticuerpos recombinantes [41]. La expresión de fragmentos de anticuerpos en el periplasma de las bacterias sigue una ruta de ensamblaje similar a la de la producción de anticuerpos convencionales en el retículo endoplásmico de una célula B [41]. Esto permite producir moléculas en un volumen pequeño y en un compartimento subcelular relativamente libre de enzimas proteolíticas activas.

Fv de cadena única (scFv)
Dos estudios publicados en 1988 mostraron la producción en E. coli de una versión recombinante del fragmento Fv en el que los dominios y estaban unidos físicamente por un péptido enlazador pequeño y flexible [42, 43]. Este enlazador, de alrededor de 15 aminoácidos, tiene la longitud y flexibilidad necesarias para permitir una adecuada orientación espacial de los dominios y, generando un Fv funcional de alrededor de 25 kD. Tales construcciones se denominaron Fv monocatenario (scFv), que son más estables que los Fv convencionales y conservan la capacidad de reconocer y unirse al antígeno. Su pequeño tamaño significa que su aclaramiento renal es rápido, por lo que son potencialmente útiles como moléculas marcadas radiactivamente [44, 45].
El establecimiento de bancos de genes de anticuerpos ha permitido la generación de repertorios de anticuerpos de tal tamaño y diversidad que es posible suponer que dentro de ellos se puede encontrar todo el repertorio natural. El uso del bacteriófago lambda y, posteriormente, de los bacteriófagos filamentosos como vectores ha sido la clave en la construcción de estos enormes y versátiles bancos de genes.

Diacuerpos, anticuerpos biespecíficos y tricuerpos
Los fragmentos Fab y svFv pueden tener un uso limitado para determinadas aplicaciones en las que se requiere una alta afinidad, ya que son moléculas que tienen un solo sitio de combinación de antígenos (univalentes). Las versiones multivalentes de estos fragmentos deben mostrar una afinidad funcional o una mayor avidez. Además, los anticuerpos recombinantes que combinan dos especificidades distintas son particularmente atractivos para ciertas aplicaciones, como el inmunodiagnóstico y la inmunoterapia, y se han empleado varias estrategias para producir dímeros o polímeros de anticuerpos recombinantes. Aunque algunos utilizan el cruzamiento químico de dos fragmentos individuales [46, 47], previamente preparados y purificados por separado, pero con la desventaja de un bajo rendimiento y problemas en la purificación del fragmento requerido, recientemente se han desarrollado otras estrategias más efectivas, basadas en Técnicas de ADN recombinante. Una de estas estrategias se basa en la construcción scFv en la que el enlazador es más pequeño que el original, lo que imposibilita la formación de un Fv funcional entre los dominios y en la misma molécula. Esto conduce a la interacción de dos moléculas del scFv, formando un dímero, que tiene dos sitios de combinación de antígeno. Si los dominios y tienen la misma especificidad, el producto obtenido es un homodímero bivalente conocido como Diabody [48]. Usando la misma técnica, es posible producir moléculas recombinantes con dos especificidades diferentes, llamadas Anticuerpos biespecíficos [49]. Si el polipéptido que sirve como enlazador entre los dominios y se elimina completamente y ambas regiones se expresan como un polipéptido continuo, el resultado es la formación de un trímero funcional con la capacidad de unirse a tres determinantes de antígeno. Estos fragmentos han sido llamados Triacuerpos [50, 51].

Minicuerpos
En 1994, Tramontano et al. [52] describió el diseño de un polipéptido artificial con una estructura basada en el dominio IgV, que se denominó Minicuerpo. Este polipéptido tiene una longitud de 61 residuos de aminoácidos y adopta una conformación que tiene una capacidad de unión a antígenos, y parece mostrar excelentes propiedades farmacocinéticas en tumores [53, 54].

Anticuerpos "camélidos"
La presencia de moléculas de anticuerpos compuestas por dímeros de cadena pesada desprovistos de cadena ligera se descubrió en sangre de camello [55, 56]. Esto motivó a un grupo de investigación a crear anticuerpos con un solo dominio. Para simular la estructura de los anticuerpos de camello, se introdujeron mutaciones en un dominio humano preseleccionado, y esos cambios fueron suficientes para evitar la interacción del humano mutado con el humano homólogo. Posteriormente, se "aleatorizó" la secuencia de la tercera región hipervariable del dominio y el repertorio obtenido se expresó como un banco de genes de fagos filamentosos recombinantes en E. coli. De este modo, fue posible obtener dominios solubles capaces de unirse al antígeno de alta afinidad [57].

Proteínas de fusión o inmunoconjugados
La tecnología del ADN recombinante ha hecho posible la creación, diseño y producción de moléculas denominadas proteínas de fusión, en las que se combinan diferentes motivos funcionales y / o estructurales, derivados de dos o más proteínas naturales. Existe un número importante de proteínas de fusión, donde se combinan fragmentos de diferentes moléculas de anticuerpos con toxinas, citocinas, moléculas de adhesión, componentes de la matriz extracelular, hormonas, factores de crecimiento, moléculas de CD, receptores celulares y lípidos.

Aptámeros
Tanto los aptámeros de oligonucleótidos (secuencias de oligonucleótidos) como de péptidos (secuencia de péptidos variable insertada en una proteína de andamio constante) también se están probando para determinar su potencial uso terapéutico [58]. Tienen la ventaja de que son más pequeños que los anticuerpos y más fáciles de diseñar.

5. Anticuerpos monoclonales humanos

Las ventajas de poder utilizar anticuerpos monoclonales completamente humanos se pueden resumir como sigue.

(i) Para reducir la posibilidad de una respuesta inmune: la administración de inmunoglobulinas humanas no conducirá al desarrollo de respuestas inmunes fuertes, como las observadas contra Ig de ratón, aunque podrían aparecer respuestas antiidiotípicas. (ii) El repertorio de epítopos antigénicos se reconoce de forma distinta entre las diferentes especies. (iii) Las inmunoglobulinas humanas interactúan mejor con sistemas efectores humanos, receptores Fc, opsonización, etc., que los anticuerpos de origen murino. (iv) Existen diferencias asociadas a los distintos patrones de glicosilación entre diferentes especies, que pueden afectar la eficacia del anticuerpo como agente terapéutico. (v) La vida media de estos anticuerpos es más larga. Los anticuerpos humanos tienen una vida media de 11 a 24 días.

5.1. Inmortalización de linfocitos B humanos

La producción de anticuerpos monoclonales humanos con la técnica clásica del hibridoma, utilizando mielomas humanos o fusiones híbridas entre células B humanas y células de mieloma de ratón (heteromielomas), encontró numerosos problemas, sobre todo la inestabilidad de los hibridomas y la baja producción de anticuerpos. Esto hizo imperativa la búsqueda de nuevos métodos para obtener anticuerpos totalmente humanos.

Los primeros esfuerzos fueron realizados por Steinitz en 1997, mediante la transformación tumoral de linfocitos B humanos utilizando el virus de Epstein-Barr (EBV), un virus del herpes oncogénico humano responsable de la mononucleosis infecciosa y el linfoma de Burkitt. In vitro Los estudios han demostrado que la infección por este virus induce la activación y el crecimiento de los linfocitos B, con secreción de anticuerpos, aunque en pequeñas cantidades.

5.2. Transfección de células de mamíferos

Otra posibilidad es la producción de anticuerpos monoclonales completamente humanos, mediante la clonación de las cadenas ligera y pesada, y su posterior transfección a células de mamífero [59]. La perfección de los vectores de expresión, la identificación dentro del genoma de los sitios de integración apropiados y la capacidad de acumular biomasa significan que los sistemas de cultivo celular producen 1-2 g / L de anticuerpos [60]. Las líneas celulares de mieloma de ratón NSO y SP2 / 0 son las más utilizadas [61], aunque se han encontrado diferencias en la glicosilación de los anticuerpos producidos. Por lo tanto, por ejemplo, estas células pueden agregar galactosas terminales con un enlace 1,3 que es muy inmunogénico. Es por eso que actualmente se utilizan CHO y células de mono, ya que pierden la enzima responsable del enlace 1,3-galactosilo [62].

5.3. Uso de ratones SCID / Trimera

Otra técnica se basa en el uso de ratones inmunodeficientes, como los ratones con Inmunodeficiencia Combinada Severa (SCID), que presentan una inmunodeficiencia combinada severa debido a una alteración autosómica recesiva de la enzima responsable de los reordenamientos de los receptores de antígenos de los linfocitos B y T . Varios grupos de investigación [63-65] demostraron que los tejidos hematopoyéticos fetales y las células mononucleares de la sangre periférica humana se asentaron en este tipo de ratón.

Otro enfoque es el desarrollo de Trimera ratones, donde los ratones se someten a irradiación corporal total seguida del trasplante de médula ósea de ratones SCID para, posteriormente, recibir tejido hematopoyético humano. Ambos tipos de ratones se han utilizado para obtener anticuerpos monoclonales humanos mediante la introducción de células de linfocitos humanos específicos de antígeno, la posterior inmunización del ratón y la producción de hibridomas mediante la técnica convencional [66]. Sin embargo, mantener a estos ratones es difícil y requiere de equipos especiales y condiciones estériles específicas, que están fuera del alcance de muchos laboratorios, ya que estos ratones tienden a sufrir agammaglobulinemia, linfocitopenia severa e infecciones frecuentes debido a su inmunodeficiencia. Por el contrario, se utilizan para estudiar enfermedades o implantar tejidos de otras especies animales, ya que el funcionamiento de los monocitos, granulocitos y células NK es normal.

5.4. Uso de huevos de gallina

Recientemente se ha descrito la producción de anticuerpos monoclonales humanos utilizando huevos de gallina. La técnica se basa en la inserción de los genes codificantes del anticuerpo humano en células embrionarias y luego en la introducción de estas células en embriones de pollo [67]. Los anticuerpos producidos tienen características biológicas y físicas similares a los anticuerpos convencionales. Además, estos anticuerpos pierden su residuo mucoso, aumentando su citotoxicidad dependiente de anticuerpos frente a otros tipos de anticuerpos.

5.5. Uso de plantas

Científicos del Jefferson Medical College, Filadelfia, EE. UU. Y del Centro Cubano para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos (CECMED) (Centro Estatal de Control de Calidad de Medicamentos) han probado con éxito, en experimentos de laboratorio, anticuerpos monoclonales obtenidos de plantas de tabaco transgénicas, que reconocen y destruyen las células de cáncer de mama y las de cáncer de colon y recto.

Las plantas de tabaco se han transformado genéticamente con el anticuerpo humano contra el antígeno Y de Lewis, que se encuentra en las células tumorales, lo que las convierte en fábricas de producción de anticuerpos humanos. Se ha demostrado que los anticuerpos recombinantes son al menos tan eficaces como los de cultivos de células de mamíferos obtenidos mediante métodos convencionales, con las ventajas de tener costes de producción mucho más bajos, permitir una eventual producción en masa y ser más seguros frente a una posible contaminación.

Los ensayos clínicos de estos anticuerpos se llevarán a cabo durante los próximos 5 a 10 años.

5.6. Uso de ratones transgénicos para inmunoglobulinas humanas: el XenoMouse

Dados los problemas mencionados en la obtención de anticuerpos completamente humanos, otra posibilidad propuesta por los científicos fue el desarrollo de ratones transgénicos con secuencias de genes productores de inmunoglobulinas humanas, que, por tanto, fueran capaces de generar anticuerpos específicos humanos. En la década de 1990, y gracias al desarrollo de técnicas en Biología Molecular, microinyección y manipulación de células embrionarias, se inició una carrera entre varios grupos de investigación para producir ratones genéticamente modificados que pudieran producir anticuerpos humanos. Este tipo de ratón se conoce como XenoMouse y tiene transgenes de inmunoglobulina humana que contienen una gran parte del repertorio de genes V en la línea terminal, lo que apoya el desarrollo de una gran población de linfocitos B y la formación de un repertorio inmunológico primario amplio y diverso. secretando anticuerpos humanos [68, 69]. Los genes humanos son compatibles con los factores que median el reordenamiento de los genes y con las enzimas de ratón que median el cambio de clase, la introducción de mutaciones (hipermutación somática) y la madurez por afinidad [70].

Los vectores que han sido utilizados por diferentes autores para la introducción de Ig humanas en ratones han sido fundamentalmente miniloci, vectores P1 y cromosomas artificiales de levadura (YAC) y, más recientemente, cromosomas completos o casi completos. Mientras que los miniloci pueden incorporar unos pocos Kb de ADN, los vectores YAC pueden incluir grandes segmentos de ADN exógeno (hasta 1-2 Mb) y pueden modificarse de forma rápida y eficaz mediante procesos de recombinación. Las ventajas fundamentales de utilizar la fusión de esferoblastos que contienen YAC son que no requieren procesos de purificación de ADN y que la metodología es similar a los procesos estándar de fusión somática de esplenocitos de ratón para la obtención de anticuerpos monoclonales. Utilizando anticuerpos humanos secretores de xenratón, nuestro grupo ha desarrollado varios anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra células leucocitarias humanas [71-75].

6. Usos terapéuticos de los anticuerpos monoclonales

Actualmente, la terapia con anticuerpos monoclonales es el área de mayor crecimiento en la industria farmacéutica. El desarrollo de la Ingeniería Genética e Inmunología en los últimos años, con la posterior producción de todos los tipos de anticuerpos descritos, está abriendo la puerta a la esperanza de muchas terapias.

Numerosos pacientes ya se están beneficiando del uso de anticuerpos monoclonales como terapias contra diversas enfermedades, y hay muchos más donde los anticuerpos aún se encuentran en diferentes fases de ensayos clínicos, antes de su aprobación para terapia comercial.

La terapia antitumoral destaca entre los tratamientos de enfermedades en las que actualmente se utilizan anticuerpos monoclonales. Algunas de las razones que han impulsado la búsqueda de nuevas armas terapéuticas son: la alta incidencia en la población de diferentes tipos de cáncer la naturaleza extremadamente severa de muchos de estos cánceres sin un tratamiento adecuado la resistencia de las células tumorales a muchos tratamientos la ausencia de terapias efectivas y la extrema toxicidad de ciertos tratamientos actuales. Dentro de este nuevo arsenal, los anticuerpos monoclonales pueden ofrecer un arma específica que puede dirigirse contra la célula tumoral sin afectar, o con un efecto mínimo, sobre los tejidos sanos y con menos efectos adversos que otras terapias.

Las células tumorales generalmente expresan antígenos en el espacio exterior, específicos de su linaje, proteínas de señalización, receptores de crecimiento y para los síndromes proliferativos de células B, inmunoglobulinas de membrana. Muchos de estos antígenos son idénticos a los expresados ​​por células precursoras o células adultas no tumorales. Por tanto, para ser buenos candidatos como dianas terapéuticas, tienen que estar sobreexpresados ​​en las células diana o, en algunos casos, ser específicos de ellas. Por tanto, el éxito del tratamiento con anticuerpos depende de la capacidad de las células para tolerar daños colaterales o para ser reconstituidas por las células precursoras negativas para el antígeno diana [76].

Los anticuerpos monoclonales pueden ser terapéuticamente útiles a través de una variedad de mecanismos, desde el simple bloqueo del receptor del antígeno en las células efectoras, hasta la acción citotóxica sobre las células que expresan el antígeno correspondiente, con numerosas opciones intermedias de modulación celular.

7. Antcuerpos monoclonales aprobados para uso terapéutico por la FDA

La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de Estados Unidos ha aprobado 26 anticuerpos monoclonales para uso clínico, ya sea terapéutico o diagnóstico (Tabla 1), mientras que alrededor de 150 se encuentran en diferentes fases de ensayos clínicos (http://www.fda.gov /).La situación es similar en la Unión Europea, ya que desde 1995 cuando se creó la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA), el proceso de registro de este tipo de medicamentos es un procedimiento europeo centralizado, que coordina los esfuerzos de evaluación y control de estos muy particulares. medicamentos.

ProductoEmpresaAplicacionesAprobación
Muromomab (Orthoclone OKT3)Ortho Biotech, Inc. (Johnson & amp Johnson)IgG2a anti-CD3 de ratón. Rechazo de trasplantesFDA 1986
EMEA 1987
Abciximab (ReoPro)Centocor B.V.7E3 quimérico dirigido contra la glicoproteína plaquetaria IIb / IIIaFDA 1994
Nofetumomab (Verluma)Boehringer Ingelheim Pharma KGRatón Fab

La mayoría de los anticuerpos aprobados hasta ahora están dirigidos contra diferentes procesos tumorales y son anticuerpos humanizados, quiméricos y murinos (Tabla 1). La lista de anticuerpos monoclonales que se encuentran actualmente en diferentes fases de ensayos clínicos significa que habrá un aumento de alrededor de 100 anticuerpos monoclonales en 2010.

8. Nanopartículas y anticuerpos

Las nanopartículas conjugadas con anticuerpos se pueden utilizar principalmente en dos aplicaciones biomédicas: terapia y diagnóstico. En terapia, el desarrollo de la administración de fármacos dirigida representa, junto con la reparación tisular, las principales aplicaciones de las nanopartículas conjugadas con anticuerpos. En el diagnóstico, las aplicaciones se pueden dividir en aquellas que utilizan en vivo y los que usan in vitro experimentación (Figura 4), e incluyen agentes de contraste para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), detección, clasificación celular, bioseparación, inmovilización enzimática, inmunoensayos, transfección (administración de genes), purificación, etc. La importancia de todas estas aplicaciones se puede demostrar mediante una lista de todas las empresas involucradas en la síntesis y aplicaciones de nanopartículas conjugadas de anticuerpos (Tabla 2) por ejemplo, la clasificación celular y las bioseparaciones son las principales aplicaciones donde un número significativo de empresas están comercializando actualmente. sus productos.

EmpresaAplicacionesSitio web
Ademtech SAClasificación celular, separación biomagnéticahttp://www.ademtech.com/
Alnis Biosciences Inc.En desarrollo: nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos para diagnóstico y tratamientohttp://www.alnis.com/
Bangs Laboratories Inc.Separación biomagnética de células, orgánulos, proteínas, inmunoglobulinas, ácidos nucleicos, etc.http://www.bangslabs.com/
ChemicellUnión de anticuerpo secundariohttp://www.chemicell.com/
Biosensores de diagnóstico, LLCInmunoensayos, biosensoreshttp://www.diagnosticbiosensors.com/
Indicia Biotechnology S.A.Separación biomagnéticahttp://www.indicia.fr/
Invitrogen Corp.Inmunoensayo, separación celular, unión de anticuerpo secundariohttp://www.invitrogen.com/
LifeAssays


9. Aplicaciones terapéuticas de nanopartículas conjugadas con anticuerpos

Los anticuerpos comerciales ya están en el mercado adheridos a medicamentos (Mylortag

) oa radioisótopos (es decir, ProstaScint), utilizados en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda y el cáncer de próstata, respectivamente. Sin embargo, hasta la fecha, no existen anticuerpos comerciales conjugados a nanopartículas aplicadas en terapia, aunque la combinación de nanopartículas y anticuerpos puede ofrecer versatilidad junto con especificidad (Figura 5), ​​y existe un enorme mercado potencial.


La combinación de anticuerpos y nanopartículas se ha desarrollado a un ritmo asombroso, como se puede observar en la Figura 6, donde el número de artículos (indexados por ISI Web of Knowledge) publicados aumentó casi exponencialmente durante los últimos años (los datos de 2009 aún no estaban disponibles). definitivo cuando se realizó la búsqueda (19 de junio de 2009).


(a)
(B)
(a)
(B) (a) Número de artículos relacionados con anticuerpos y nanopartículas publicados cada año en el período 1999-2009. Tema = (anticuerpos y nanopartículas). * Nota: 2009 está incompleto (búsqueda realizada el 19/06/2009). (b) Ranking de las publicaciones científicas por área temática.

Al revisar esos artículos, podemos concluir que la administración dirigida de fármacos y genes junto con la hipertermia magnética u óptica son las principales aplicaciones terapéuticas potenciales para las nanopartículas conjugadas con anticuerpos. Cada uno se encuentra en una fase de desarrollo diferente. Todas estas aplicaciones tienen en común el suministro selectivo de un portador terapéutico, como un fármaco, un gen o el calor, para provocar la muerte de células malignas, la expresión de una proteína específica o la activación de otras, sin afectar a los tejidos sanos circundantes. .

La focalización específica se logra comúnmente utilizando estrategias pasivas o activas. El direccionamiento pasivo emplea la microvasculatura característica de los tumores para adaptar las nanopartículas que se acumularán en estos objetivos. Las nanopartículas se acumulan debido a su tamaño específico y su extravasación dentro del tumor, donde la microvasculatura es hiperpermeable y con fugas, un proceso también ayudado por el drenaje linfático limitado por el tumor. En combinación, estos factores conducen a la acumulación selectiva de nanopartículas de tamaños generalmente entre 80 y 200 nm en el tejido tumoral, un fenómeno conocido como permeación y retención mejoradas (EPR). En general, cuanto más pequeña es la nanopartícula, mayor es su tiempo de circulación. Aunque la organización de la vasculatura puede diferir según el tipo de tumor, su tasa de crecimiento y su microambiente, la mayoría de los tumores sólidos presentan un tamaño de corte de los poros vasculares entre 380 y 780 nm [77]. Partículas que son demasiado pequeñas (

80 nm) pueden eliminarse muy rápidamente de la vasculatura del tumor por drenaje a través de los poros capilares. Por tanto, existe un tamaño óptimo para que las nanopartículas se acumulen en la proximidad de un tumor. Por lo general, la focalización pasiva se aplica inyectando las nanopartículas cerca de la arteria que alimenta al tumor y produce buenos resultados en términos de reducción del tamaño del tumor.

El direccionamiento activo se basa en la expresión excesiva o exclusiva de diferentes epítopos o receptores en las células tumorales y en características físicas específicas. Además de todos los restos mencionados en la introducción, los anticuerpos representan uno de los bioconjugados más interesantes utilizados para lograr la administración dirigida activa de un vehículo terapéutico. Además, la focalización activa tiene éxito utilizando las propiedades físicas de las nanopartículas (es decir, el magnetismo) [78]. También es posible la combinación de diferentes estrategias de direccionamiento activo, tanto las físicas como las asistidas por restos de reconocimiento específicos.

9.1. Entrega de medicamentos dirigida

Las nanopartículas cargadas con fármaco conjugado con anticuerpo pueden dirigirse selectivamente a células malignas y liberar grandes cantidades de un fármaco en el citoplasma celular, minimizando los efectos secundarios no deseados. La eficacia de la administración depende de la capacidad de cada anticuerpo para alcanzar su objetivo en cantidades adecuadas y de la cantidad limitada de nanopartículas atrapadas por la célula. Desde que los primeros estudios en 1977 de antifolatos ligados a fármacos citotóxicos (metotrexato) demostraron acción terapéutica en ratones [79], la idea de conjugar una nanopartícula cargada de fármaco con un anticuerpo para el reconocimiento dirigido de tejido maligno ha abierto el desarrollo de nuevas nanoportadores. La necesidad de utilizar nanocápsulas (con un interior hueco lleno del fármaco) depende de la cantidad de fármaco necesaria para provocar la muerte celular. Por ejemplo, en la línea celular MCF-7 se ha demostrado que para el 50% de la muerte celular

las moléculas de un fármaco (daunomicina) deben estar presentes por célula [80]. Dado que se informa que el número de antígenos reconocidos por anticuerpos asociados a tumores en las superficies celulares está en el rango

por célula, sería difícil administrar una cantidad suficiente incluso del agente citotóxico convencional más potente a través de sistemas de administración de anticuerpos específicos, únicamente con anticuerpos [81]. Además, parece haber un límite superior para la afinidad de unión antígeno-anticuerpo. Más allá de este límite, las mejoras adicionales en la afinidad no tienen efectos beneficiosos [82].

Los siguientes son algunos ejemplos de nanopartículas conjugadas con anticuerpos que se utilizan en la administración de fármacos dirigida.

(i) Gupta y Torchilin (2007) describieron la síntesis y la eficacia del anticuerpo anticanceroso monoclonal 2C5 conjugado con liposomas PEGilados disponibles comercialmente cargados con doxorrubicina (un fármaco que interactúa con el ADN ampliamente utilizado en quimioterapia), en un modelo intracraneal en ratones desnudos [83 ]. El tratamiento con liposomas conjugados con anticuerpos proporcionó un beneficio terapéutico significativo sobre los controles, con una reducción pronunciada del tamaño del tumor. (ii) Se han decorado nanopartículas de poli (d, l-lactida-co-glicólido) / montmorillonita (NP PLGA / MMT) con anticuerpo receptor-2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), Trastuzumab (Herceptin), para la quimioterapia dirigida contra el cáncer de mama con paclitaxel como fármaco anticáncer modelo [84]. Según los autores, su in vitro Los estudios revelaron que los efectos terapéuticos del fármaco formulado en las nanopartículas conjugadas podrían ser 12,7 veces superiores a los de las nanopartículas desnudas y 13,1 veces superiores a los de Taxol. El mismo anticuerpo monoclonal IgG1 humanizado se ha unido covalentemente a nanopartículas basadas en albúmina de suero humano, y el portador resultante mostró una orientación específica a las células de cáncer de mama positivas para HER2 [85]. (iii) Nanopartículas de poli (lactida-co-glicólido) (PLGA) cargadas con paclitaxel recubiertas con anticuerpo catiónico de cadena sencilla SM5-1 (scFv), que contienen una polilisina (SMFv-polylys), se sintetizaron y probaron eficazmente in vitro. El propósito de marcar el anticuerpo con el polipéptido catiónico polilisina es lograr la atracción electrostática con las nanopartículas cargadas negativamente [86]. En comparación con las nanopartículas de PLGA cargadas con paclitaxel no objetivo, las nanopartículas conjugadas con anticuerpos mostraron un aumento in vitro citotoxicidad contra líneas celulares de carcinoma hepatocelular humano (Ch-hep-3). (iv) Se han acoplado covalentemente dos anticuerpos monoclonales diferentes a la misma nanopartícula basada en poli (ácido málico), uno de ellos, anti-TfR monoclonal, para dirigir el conjugado a través de la barrera hemato-tumoral, y el otro, monoclonal 2C5 , para apuntar a nucleosomas unidos a la superficie de las células tumorales. La presencia de ambos anticuerpos en la misma nanopartícula y su actividad biológica fueron confirmadas por ELISA. En vivo Los experimentos mostraron una acumulación significativamente mayor de nanopartículas conjugadas en el glioma humano [87]. (v) Tyner y col. [88] han informado recientemente sobre la funcionalización de la superficie de nanopartículas inorgánicas (hechas de hidróxidos dobles en capas de magnesio-aluminio) con carbonato de disuccinimidilo (DSC), que luego se cargaron con un anticuerpo huA33 y una proteína del plasma sanguíneo (albúmina sérica). Lo biológico in vitro Las pruebas demostraron que los nanobiohíbridos LDH-DSC-huA33 tenían una actividad contra el antígeno A33 humano 30 veces mayor que la de la LDH-DSC-albúmina.

9.2. Entrega de genes y reparación de tejidos

Excepto raras excepciones, el ADN desnudo no internaliza las células ni expresa una proteína específica a un nivel razonable. Los portadores que ayudan al ADN a internalizarse en la célula se pueden administrar de forma sistémica o local (mediante inyección directa en el tejido o mediante el uso de andamios cargados de ADN). Los vehículos virales, los lípidos y polímeros catiónicos, las proteínas recombinantes y las nanopartículas inorgánicas son los cuatro tipos de vehículos utilizados. Algunos de estos vectores se pueden funcionalizar con anticuerpos o Fab para dirigir la liberación celular, mientras que otros, con secuencias de péptidos cortas, actúan como señales de localización nuclear.

Se han utilizado nanopartículas como portadores de ADN plasmídico, oligonucleótidos, ARNip, etc., para transfectar células y usar la maquinaria celular para producir proteínas terapéuticas, activar una respuesta celular o diferenciar las células en específicas. La nanopartícula puede comportarse como una capa protectora del resto. Por ejemplo, los ARNip sintéticos son una nueva herramienta muy prometedora para la intervención terapéutica, sin embargo, es necesario mejorar su especificidad celular diana, su suministro celular efectivo (en particular en las células primarias), así como su estabilidad [89].

Hayes y col. [90] describieron el uso de un anticuerpo-lipopolímero (anti-HER2 scFv (F5) -PEG-DSPE) conjugado a una nanopartícula lipídica catiónica con el ADN encapsulado en su interior, que logra un alto grado de actividad de transfección específica.

Varios grupos de investigación, interesados ​​en la notoria inestabilidad sanguínea del ARNip, han estado trabajando en su modificación química y en su encapsulación para la protección contra la degradación en aplicaciones de transfección. Un grupo, Heidel et al. (2007) [91], describieron el uso de la proteína transferrina como ligando de direccionamiento conjugado con nanopartículas basadas en ciclodextrina, que encapsulan el ARNip para inhibir la expresión génica en primates no humanos. La mayoría de estos portadores de suministro de genes tienen aplicaciones en la medicina regenerativa.

Se ha demostrado que las nanopartículas de oro desnudas y conjugadas con anticuerpos que absorben la luz en el infrarrojo cercano son nanopartículas de absorción óptica para mejorar la reparación tisular [92]. Las propiedades de absorción de calor de los nanocoloides de oro se utilizan en este caso para producir soldadura de tejidos.

9.3. Hipertermia magnética, ablación térmica y terapia fotodinámica

Se han unido al TiO anticuerpos anticancerígenos de células cancerosas LoVo humanas.2 nanopartículas [93]. Los electrones en la banda de valencia de

Las nanopartículas se pueden excitar, bajo irradiación de luz ultravioleta, a la banda de conducción, creando pares de electrones y huecos fotoinducidos. Estos electrones y huecos fotoinducidos presentan fuertes propiedades de reducción y oxidación, que pueden destruir células malignas, debido a la generación de especies reactivas de oxígeno bajo irradiación ultravioleta. Los anticuerpos se marcaron con FITC para mejorar la detección óptica mediante el uso de microscopía láser confocal [94]. La electroporación (uso de estimulación eléctrica para liberar restos a través de los microporos de la membrana celular) se utilizó para acelerar la internalización de las nanopartículas conjugadas en células cancerosas. In vitro Los resultados mostraron que el 100% de las células cancerosas humanas se fotocalientan en 90 minutos utilizando la combinación de ambas técnicas.

Para la misma aplicación, nanopartículas recubiertas de ácido poliacrílico se acoplaron covalentemente a anticuerpos de ratón antiestradiol con un enlace amida, y se usaron no solo en el reconocimiento del estradiol, sino también en su destrucción mediante el uso de las propiedades fotocatalíticas de. Hay aplicaciones claras para estos transportistas en la protección del medio ambiente para la tecnología de tratamiento de agua, así como en los procesos de tratamiento de residuos médicos y de saneamiento público [95].

El Sayed y col. [96] mostró destrucción selectiva por láser fototérmica de dos líneas celulares de carcinoma escamoso oral (HSC 313 y HOC 3 clon 8), frente a una línea celular epitelial benigna (HaCaT), mediante el uso de anticuerpos anti-EGFR conjugados con nanopartículas de oro puro. Las nanopartículas de oro muestran propiedades de absorción de calor bajo radiación infrarroja cercana (NIR), mientras que el tejido no adsorbe la luz NIR.

Staphyloccocus aureus las bacterias fueron eliminadas por nanopartículas de oro que adsorben la luz conjugadas con anticuerpos anti-proteína A, mediante irradiación con láser a 532 nm [97]. Se eligió la proteína A porque interactúa específicamente con el fragmento Fc del anticuerpo. Según los autores, la eficacia de eliminación depende de los efectos de sobrecalentamiento local acompañados de fenómenos de formación de burbujas. La irradiación directa de bacterias con el láser no dañó las bacterias, debido a la baja absorción por los citocromos endógenos naturales.

Las nanopartículas de sílice recubiertas de oro se han utilizado en fototerapia en el infrarrojo cercano [98], lo que muestra una posible aplicación en tumores presentes en la superficie externa del cuerpo. los in vitro Los resultados mostraron un daño térmico irreversible para las células de carcinoma de mama humano incubadas con las nanopartículas después de la exposición a la luz NIR, mientras que los tejidos de control parecían estar intactos.

Se estudiaron la farmacocinética, la captación tumoral y el efecto terapéutico del calentamiento inductivo (mediante la aplicación externa de campos magnéticos alternos, AMF) de nanopartículas de óxido de hierro unidas a anticuerpos monoclonales L6 (ChL6) quimérico 111 In en ratones atímicos con xenoinjertos HBT 3477 de cáncer de mama humano . Se observó regresión tumoral en todos los niveles de HMA después de que esos portadores se administraran a las células cancerosas [99]. En la hipertermia magnética, el calor se produce aumentando la amplitud del campo magnético alterno y / o la frecuencia del campo, debido a la alta tasa de absorción específica de las nanopartículas magnéticas.

La principal desventaja de la hipertermia magnética es que existe una limitación en la fuerza del campo externo que se puede aplicar para crear un gradiente adecuado para apuntar a las nanopartículas magnéticas en el área deseada. El gradiente magnético disminuye rápidamente al aumentar la distancia del imán externo. La misma limitación espacial ocurriría para la fototerapia con NIR.

9.4. Encapsulación de biomoléculas con fines bioanalíticos, terapéuticos y ambientales

Los anticuerpos monoclonales pueden tener una baja estabilidad fisicoquímica y una corta en vivo media vida. Su encapsulación o conjugación a nanopartículas puede ofrecer una alternativa para evitar esos problemas. Las nanopartículas también pueden encapsular un fármaco o protegerlo dentro de los poros de su estructura, ofreciendo protección potencial contra el metabolismo, la degradación enzimática y la filtración. Además, el uso de nanopartículas para encapsular el fármaco tiene las claras ventajas de que la actividad del fármaco no se ve afectada por reacciones de acoplamiento y que tienen una alta capacidad inherente de carga de fármaco.

La principal aplicación de los anticuerpos encapsulados dentro de las nanopartículas se basa en su uso como biosensores. Los anticuerpos se utilizan con fines analíticos en inmunoensayos, enriquecimiento selectivo de analitos (extracción por inmunoafinidad) y en biosensores. En un estudio, se encapsularon anticuerpos anti-diclofenaco dentro de nanopartículas de sílice porosas preparadas mediante el método sol-gel [100]. La cápsula proporciona protección al anticuerpo sin pérdida de actividad biológica. Los mismos autores muestran varios anticuerpos encapsulados en diferentes matrices.

Debe hacerse una mención especial al uso de nanopartículas para encapsular antígenos con fines de vacunación. La cápsula proporciona al antígeno una mayor solubilidad y tiempo de circulación en el torrente sanguíneo y, en algunos casos, inmunoestimulación [101]. Las nanopartículas pueden presentar ligandos dirigidos y secuestrar y liberar moléculas huésped [102]. La capacidad de inducir respuestas inmunitarias humorales y celulares del VIH-1 potentes y específicas. en vivo se ha demostrado para nanopartículas de poli (ácido glutámico) cargadas con antígeno [103]. Se han utilizado nanopartículas catiónicas como sistema de administración nasal para dos proteínas recombinantes (HBsAg y

-galactosidasa), que requieren respuestas humorales, celulares y mucosas en vivo [104]. Nanopartículas de N-trimetilquitosano cargadas con influenza Se ha demostrado que los antígenos de subunidades son portadores eficaces de la respuesta mejorada de la respuesta inmune sistémica y local en ratones [105]. En este caso, la captación local se basa principalmente en las propiedades mucoadhesivas de las nanopartículas, debido a su atracción electrostática hacia la mucosa nasal cargada negativamente.

Se utilizó el recubrimiento superficial simultáneo de dos antígenos de la vacuna (proteínas p24 y gp120 del VIH-1) sobre nanopartículas de poli (ácido láctico-co-glicólico) o ácido poliláctico por adsorción para probar su inmunogenicidad en ratones, así como su estabilidad, evaluada por un específico ensayo de unión de anticuerpos [106].

Los anticuerpos Fv monocatenarios que se unen específicamente a las células de cáncer de próstata y entran en ellas se han cargado dentro de los liposomas.Los liposomas poseen un fluoróforo sensible al pH que permite la cuantificación de la captación de liposomas conjugados dentro del compartimento endosómico [107].

10.Nanopartículas conjugadas con anticuerpos en el diagnóstico

10.1. Clasificación celular

Sin duda, la clasificación celular y la bioseparación son las principales aplicaciones de las nanopartículas conjugadas con anticuerpos. Como se puede ver en la Tabla 1, varias empresas ofrecen equipos para la bioseparación celular.

En 1981, Kandzia et al. [108] describió el uso de un anticuerpo monoclonal HLA-BW6 acoplado a microesferas de magnetita recubiertas de albúmina mediante Staphylococcus aureus Proteína-A. La mezcla de linfocitos de sangre periférica humana HLA-BW6 y -BW4 se incubó con estos inmunomicróforos y se aplicó a una columna de vidrio ubicada en un campo magnético. Solo los linfocitos HLA-BW4 pasaron a través de la columna y se recogieron. Las células recuperadas eran viables en un 97%. Proteína A (proteína aislada de la pared celular de Staphyloccocus aureus), porque interactúa específicamente con el fragmento Fc del anticuerpo.

Sin embargo, en vivo Los experimentos proporcionaron pruebas de un desplazamiento competitivo del mismo anticuerpo adsorbido por las proteínas del suero, y las nanopartículas se eliminaron hasta el hígado y el bazo [109].

El acoplamiento de un anticuerpo monoclonal murino, HEA125, específico para células epiteliales humanas, a perlas magnéticas (de 50 nm a unas pocas micras) permite la selección positiva de una población que contiene esencialmente sólo células tumorales [110].

El problema con todos los tipos de células es que los marcadores de superficie están representados en la mayoría, si no en todas, las células. Por lo tanto, la separación magnética basada en anticuerpos es una técnica poderosa para obtener poblaciones celulares puras, pero no todas las células de la población celular [111].

10.2. Imagen

El diagnóstico de cáncer en etapas tempranas de crecimiento es un factor crítico para obtener resultados óptimos en la terapia y para mejorar las posibilidades de supervivencia. Existen varias técnicas de imágenes que ayudan a los médicos en su diagnóstico, que incluyen imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada (CT), ultrasonido, radiografía, imágenes fotoacústicas, fluoroscopia, etc. En algunas de estas técnicas, las nanopartículas conjugadas con anticuerpos pueden ofrecer una mayor selectividad y sensibilidad.

10.2.1. Nanopartículas funcionalizadas con anticuerpos radioconjugados

Ya en 1981, Mach et al. [112] publicó los primeros resultados clínicos con anticuerpos monoclonales anti-CEA marcados con 125I, que describen las aplicaciones potenciales de esos portadores. Hoy en día, estos vectores se han combinado con nanopartículas, proporcionando así nuevas propiedades mejoradas.

El trabajo de Natarajan et al. [113] describe la conjugación de nanopartículas magnéticas de dextrano recubiertas de PEG comerciales con fragmentos de anticuerpos generados recombinantemente marcados isotópicamente, di-scFv-c, para la formación de imágenes y la terapia (mediante la aplicación de hipertermia magnética) de tumores que expresan anti-MUC-1. Un quelante (DOTA) se une al fragmento de anticuerpo en el primer paso. Posteriormente, el anticuerpo conjugado se incuba con una nanopartícula híbrida precursora de 111 In (cloruro de indio marcado isotópicamente) y, finalmente, este fragmento de anticuerpo radiomarcado se une a la nanopartícula magnética funcionalizada con maleimida descrita anteriormente, mediante una unión covalente a una cisteína libre de la fragmento. El radioquelador se utiliza para rastrear las nanopartículas. en vivo.

10.2.2. Agentes de contraste dirigidos para resonancia magnética

Entre los dispositivos clínicos utilizados para el diagnóstico del cáncer, la resonancia magnética (MRI) se destaca como una herramienta poderosa, a menudo superior a otras tecnologías. La resonancia magnética es una modalidad de imagen poderosa no invasiva y no destructiva, que proporciona imágenes internas de organismos vivos sin límites en la profundidad del análisis y con una resolución de 10 a 100 m. Es versátil, ya que se puede acceder a una amplia gama de modalidades de resonancia magnética y se pueden realizar imágenes en 2D y 3D [114].

La sensibilidad de la resonancia magnética se puede mejorar mediante el uso de agentes de contraste (aproximadamente el 30% de todas las resonancias magnéticas clínicas son asistidas por su uso), que son sustancias activas cargadas con iones metálicos generalmente en forma de nanopartículas. La inclusión de nanopartículas magnéticas como agentes de contraste para la resonancia magnética impulsó el diseño de nuevos agentes de contraste dirigidos. En 1998, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que se sobreexpresan en el carcinoma de células escamosas de esófago, se vincularon covalentemente a nanopartículas superparamagnéticas, mostrando un contraste mejorado para la resonancia magnética específica del tumor en un modelo de rata con carcinomas de células escamosas de esófago [115 ].

Se han cultivado islotes de rata aislados con perlas inmunomagnéticas recubiertas con anticuerpo contra el antígeno de clase I del MHC de rata. Los islotes marcados se trasplantaron a los hígados de ratas singénicas proporcionando imágenes de los islotes. en vivo [116].

La detección de fibrina in vitro por MR en placas ateroscleróticas inestables es posible mediante el uso de nanopartículas paramagnéticas conjugadas con un anticuerpo antifibrina (1H10) [117].

Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la dosis requerida del anticuerpo marcado es todavía demasiado alta para que el desarrollo comercial sea realista. Aunque la biotecnología ha avanzado enormemente, la baja expresión de antígenos o receptores y la sensibilidad limitada de los potenciadores de relajación actualmente disponibles son solo algunos de los factores que cuestionan el potencial de los anticuerpos o sus fragmentos para la RM clínica [118].

10.3. Sintiendo

La detección altamente sensible y el análisis preciso de moléculas de biomarcadores en muestras de fluidos humanos son esenciales para la detección temprana, el tratamiento y el manejo de enfermedades [119].

En un biosensor, un ligando y un receptor se unen en una reacción que se recolecta como una señal a un transductor usando diferentes métodos, incluyendo óptico, magnético, electroquímico, radioactivo, piezoeléctrico, mecánico, espectrométrico de masas, etc. Como cualquier sensor, un biosensor debe ser barato, compacto, selectivo, sensible, portátil, reutilizable y de lectura rápida.

La introducción de nanopartículas en el campo del diagnóstico molecular ha representado una ventaja en muchos casos para las técnicas de detección bien establecidas basadas en fluoróforos, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Las nanopartículas ofrecen sus propiedades físicas al biosensor. En algunos casos, las nanopartículas se utilizan simplemente como portadoras de anticuerpos para reconocerlas por asociación en biosensores. Por ejemplo, en 1996, se utilizó la resonancia de plasmón de superficie (SPR), a través del biosensor BIACORE, para demostrar la interacción específica entre un anticuerpo monoclonal anti-CD4 (IOT4a), adsorbido en nanopartículas de poli (malonato de metilideno 2.1.2), y el Molécula CD4 [120]. Como se puede ver en la Tabla 1, varias empresas ofrecen equipos basados ​​en nanopartículas conjugadas con anticuerpos para aplicaciones de biosensores.

10.3.1. Sensores ópticos

La mejora de los inmunosensores ópticos con nanopartículas fue postulada ya en 1997 por Kubitschko et al. [121] Posteriormente, muchas aplicaciones han demostrado las capacidades superiores de las nanopartículas.

Las nanopartículas de metales nobles exhiben una fuerte banda de absorción UV-visible que no está presente en sus contrapartes a granel. Para aquellas nanopartículas localizadas, la excitación por resonancia de plasmón superficial da como resultado una absorción selectiva de longitud de onda, grandes coeficientes de extinción molar (superiores a los fluoróforos) y campos electromagnéticos locales mejorados en la superficie, responsables de señales intensas en espectroscopía [122].

Las nanopartículas magnéticas marcadas con el fluorocromo Cy5.5 del infrarrojo cercano se han unido covalentemente a anticuerpos anti VCAM-1 mediante el uso de la química EDC / Sulfo-NHS. Se demostró una administración y etiquetado eficaces del endotelio activado. en vivo utilizando un modelo inflamatorio murino [123]. La sonda fluorescente se usó para proporcionar imágenes confocales de fluorescencia del endotelio activado por m-TNF en un modelo de oído, y la parte magnética de las nanopartículas se usó para proporcionar contraste de resonancia magnética (MR) para imágenes de tejido profundo.

Las nanopartículas de oro se utilizan ampliamente en la detección óptica, debido a su gran absorción de luz y su sección transversal de dispersión en la región de longitud de onda de resonancia del plasmón superficial.

La magnitud de la dispersión de la luz por las nanopartículas de oro puede ser órdenes de magnitud mayor que la emisión de luz de los tintes fuertemente fluorescentes [119]. No fotoblanquean y pueden detectarse fácilmente en tan solo

Además, las nanopartículas de oro se han utilizado como agentes de contraste para la obtención de imágenes biomédicas utilizando microscopía óptica de barrido [125], microscopía de resonancia de plasmones multifotónicos [126], microscopía de coherencia óptica y microscopía de tercer armónico [127]. Hirsch y col. [128] describió el uso de anticuerpos conjugados con nanopartículas de oro para detectar proteínas en solución salina, suero y sangre completa mediante espectroscopia de infrarrojo cercano con una sensibilidad de hasta sub-nanogramos / ml.

Se utilizaron nanopartículas de plata recubiertas de oro, unidas covalentemente a anticuerpos IgG anti-ratón de cabra ya un indicador, en aplicaciones de biosensores mediante el empleo de espectroscopía Raman mejorada de superficie (SER) [129]. Se inmovilizó un anticuerpo de captura sobre un sustrato y se observó una detección positiva cuando la IgG de cabra estaba presente en el medio.

Se han utilizado proteínas indicadoras fluorescentes incrustadas en nanopartículas de poliacrilamida para la detección de fosfato inorgánico, mediante el uso de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). La determinación de fosfato inorgánico es necesaria para dilucidar los procesos metabólicos [130].

Se han utilizado conjugados de nanopartículas de sílice recubiertas de oro anti-HER2 y anti-IgG para medir el número de nanopartículas plasmónicas específicas que se unen por célula, debido a sus fuertes propiedades de dispersión de la luz. La capacidad de cuantificar esto es crucial para mejorar los resultados diagnósticos y terapéuticos. La dispersión de luz polarizada dependiente del ángulo de las nanopartículas se estudió utilizando un goniómetro automático, debido a la relación lineal entre la dispersión de luz y la concentración de nanopartículas [131].

Los anticuerpos anti-específicos de la próstata se han conjugado con nanopartículas de oro y se han utilizado para cuantificar la cantidad de antígeno prostático específico (un biomarcador aprobado por la FDA para el diagnóstico del cáncer de próstata) mediante la dispersión dinámica de la luz. Incluso con un pequeño nivel de inestabilidad y agregación de nanopartículas, es posible realizar un inmunoensayo cuantitativo en una solución de matriz proteica, mediante el uso de dispersión dinámica de luz [119].

Las imágenes de dispersión y los espectros de absorción registrados a partir de nanopartículas de oro conjugadas anti-EGFR, incubadas con células cancerosas (líneas celulares epiteliales orales HOC 313 clon 8 y HSC 3) y no cancerosas (línea celular epitelial no maligna HaCaT), son muy diferentes y ofrecen potencial técnicas para el diagnóstico del cáncer [132].

La absorbancia de resonancia de plasmón de superficie localizada en la región visible se ha utilizado como método óptico para la detección mejorada en una tira de prueba inmunocromatográfica, mediante el uso de anticuerpos monoclonales anti-hormona gonadotropina humana (HCG) y anticuerpos monoclonales anti-antígeno prostático total específico humano ( anti-TPSA), conjugado con nanopartículas de oro. La conjugación tuvo lugar por adsorción física. Los resultados mostraron un límite de detección de HCG a 1-0,1 ng / mL a simple vista, y un límite de 0,001 ng / mL (1 pg / mL) con los fenómenos de concentración de las nanopartículas de oro, utilizando medidas de resonancia de plasmón superficial. El TPSA se midió con un límite de detección de 0,2 ng / ml [133]. También se determinó la hormona del embarazo utilizando nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-HCG con acoplamiento covalente [134].

Se han conjugado anticuerpos monoclonales de ratón glicosilados a través de la región Fc con nanopartículas de oro [135] y se han empleado para producir el etiquetado de nanopartículas, utilizando imágenes de transmitancia de campo oscuro. Estos agentes de contraste se validaron en fibroblastos NIH3T3 vivos.

10.3.2. Sensores de masa

Los biosensores de masa más utilizados son las microbalanzas de cristal de cuarzo (QCM) y los voladizos. En el primero, una variación en la frecuencia de la resonancia se correlaciona directamente con la masa depositada en su superficie (ecuación de Sauerbrey). El sistema QCM se basa en el principio de que los cambios de frecuencia de resonancia del cristal piezoeléctrico son directamente proporcionales a la masa molecular adsorbida [136].

Para la detección de líquidos, es necesaria una película delgada del analito en la superficie del QCM para su cuantificación precisa. Esta película adsorbida puede consistir en una cantidad considerablemente grande de agua, que se detecta como una absorción masiva por todos los QCM. La medición de varias frecuencias y la disipación (la disipación, o amortiguación, es la suma de todas las pérdidas de energía en el sistema por ciclo de oscilación) permite determinar si la película adsorbida es rígida o rica en agua (blanda), que es no es posible con solo mirar la respuesta de frecuencia. Por lo tanto, la evaluación de la disipación es necesaria en aplicaciones de biosensores basadas en masas, y es posible evaluar la variación de la frecuencia de resonancia, después de la deposición de un resto, y / o también la desviación del voladizo después de la deposición. El problema de la amortiguación también afecta a los voladizos, pero actualmente las aplicaciones comerciales incluyen un corrector (llamado retroalimentación) para restar esa contribución.

Los QCM piezoeléctricos se han utilizado para la detección directa deToxoplasma gondii inmunoglobulinas. Para los pacientes con sistemas inmunitarios debilitados (incluidos aquellos con SIDA, cáncer u otras enfermedades crónicas), la toxoplasmosis puede ser fatal. Nanopartículas de oro funcionalizadas con Toxoplasma gondii los anticuerpos se incubaron con suero y sangre de conejo infectado. Las nanopartículas se utilizan para mejorar la sensibilidad del sensor de masa, basándose en la aglutinación específica de las nanopartículas de oro recubiertas de antígeno en la superficie de QCM [137].

Los mismos transductores se han utilizado para el inmunoensayo piezoeléctrico del antígeno de carbohidrato CA19-9 (un importante marcador tumoral de carbohidratos expresado en varios tipos de carcinomas), utilizando nanopartículas híbridas compuestas de poli-L-lisina / hidroxiapatita y nanotubos de carbono conjugados con anti-ratón de ratón. Anticuerpos -CA19-9 [138]. El nanocompuesto actúa como un andamio para la inmovilización de proteínas.

Se han utilizado QCM para la detección selectiva en suero de la proteína marcadora S100, que se ha propuesto para ayudar a distinguir entre accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico [139]. Se unió covalentemente un anticuerpo primario a la superficie tratada del QCM y, en presencia del antígeno, se interpuso una nanopartícula magnética recubierta de estreptavidina funcionalizada con un anticuerpo secundario, mejorando la señal. El marcador se midió en una concentración tan baja como 0,2 ng / ml.

La superficie de un QCM se ha modificado con una capa de nanopartículas de oro y proteína A para lograr una unión orientada de anticuerpos (anti-CD3-FITC, anti-CD5-FITC, anti-CD7-FITC y anti-IgG1 humana de ratón). FITC) que reconocen antígenos diferenciados de linajes fenotípicos o subconjuntos de leucemia aguda [140]. El uso de las nanopartículas ayuda a obtener una correcta orientación de los anticuerpos y también en su regeneración.

La incorporación de nanopartículas de oro coloidal en matrices híbridas puede retener la actividad de biomoléculas y mejorar la cantidad inmovilizada de biomoléculas. Por ejemplo, Tang et al. [141] han descrito el uso de nanopartículas de oro para mejorar la señal para el reconocimiento de antígenos carcinoembrionarios, empleando QCM debido a la mejor inmovilización de los anticuerpos en la superficie del sensor de masa. Según los autores, el uso de nanopartículas puede mejorar la densidad de inmovilización de los anticuerpos unidos y, también, podría servir como una matriz "espaciadora" intermedia para extender el anticuerpo inmovilizado lejos de la matriz del sustrato en la fase móvil, lo que resulta en sitios de unión más. accesible a los antígenos.

Además, otros autores [142] han informado de la mejora de los fenómenos de inmovilización mediante el uso de nanopartículas en la biodetección con QCM [142].

10.3.3. Sensores electroquímicos

Los sensores electroquímicos se utilizan ampliamente para la detección de varias moléculas biológicas de interés clínico, mediante reconocimiento específico mediante sondas de oligonucleótidos o anticuerpos inmovilizados en la plataforma de detección. A continuación, el objetivo capturado se reconoce, en formato sándwich, mediante su reacción con un anticuerpo secundario o una sonda de ADN conectada con nanopartículas electroactivas fácilmente detectables. El mecanismo de detección se basa en la extracción electroquímica [143] (normalmente voltamperometría de extracción anódica) de las nanopartículas basadas en metales pesados. Dependiendo del mecanismo de transducción, los sensores electroquímicos pueden utilizar una detección potenciométrica, amperométrica o conductimétrica.

La conjugación antígeno-anticuerpo se ha determinado utilizando una superficie biomimética (basada en glóbulos rojos) intercalada entre nanopartículas de oro depositadas en una superficie de electrodo de carbono y nanopartículas de oro presentes en la superficie celular. Estas nanopartículas de oro se han funcionalizado con el anticuerpo 15-3 del cáncer de mama (anti-CA15-3). En presencia del antígeno, la respuesta amperométrica disminuyó con el aumento de la concentración de la muestra de CA15-3 [144].

El trabajo de Li et al. [145] describe el uso de un inmunosensor electroquímico para determinar el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF), en el suero de pacientes con artritis reumatoide. La superficie del electrodo de oro del sensor se revistió con compuestos de oro y nanopartículas y tionina (NGP-NTiP-Thi), seguido de adsorción de anticuerpos anti-MIF con isotipo IgM o IgG1. Las mediciones mostraron niveles considerables de sensibilidad, selectividad, estabilidad y mantenimiento a largo plazo de la bioactividad.

Un inmunosensor sin reactivo para la determinación rápida del antígeno de carbohidrato 19-9 (CA19-9) en suero humano fue descrito por Du et al. [146]. Esta estrategia se basó en la inmovilización del anticuerpo en un electrodo de pasta de carbón modificado con nanopartículas de oro coloidal y la electroquímica directa de la peroxidasa de rábano picante (HRP) que se conjugó con un anticuerpo CA19-9. Las nanopartículas fueron eficaces para preservar la actividad de biomoléculas inmovilizadas.

Se propuso un inmunosensor electroquímico libre de separación para carcinoma antígeno-125 (CA125) basado en la inmovilización del antígeno CA125, sobre nanopartículas de oro coloidal, que habían sido estabilizadas con membrana de acetato de celulosa sobre un electrodo de carbono vítreo. El inmunosensor mostró buena exactitud, sensibilidad, precisión, reproducibilidad y estabilidad de almacenamiento aceptables [147].

10.3.4. Sensores magnéticos

Kotitz y col. [148] propuso un inmunoensayo de relajación / remanencia magnética, con un dispositivo superconductor de interferencia cuántica (SQUID) como sensor magnético. En esta técnica, una diana inmovilizada se sumerge en una suspensión de nanopartículas superparamagnéticas unidas a anticuerpos específicos de esa diana. El SQUID detecta el campo magnético de las partículas unidas al objetivo. Chemla et al.[149] que emplea un SQUID de alta temperatura de transición para la detección ultrasensible de FLAG. El anticuerpo reconoce el epítopo FLAG ubicado en proteínas de fusión marcadas con FLAG. La desventaja de esta técnica de detección es que no permite la detección simultánea de múltiples analitos. Posteriormente, Kim y Park [150] describieron el uso de un sistema de microfluidos para la detección simultánea de múltiples anticuerpos (IgG (H + L) F policlonal anti-ratón de cabra

fragmentos e IgG anticonejo policlonal de cabra (H + L) F) unidos a nanopartículas magnéticas y no magnéticas (fluorescentes) midiendo la fuerza magnética.

El uso de magnetorresistencia para la biodetección del acoplamiento antígeno-anticuerpo fue postulado en 1998 por Baselt et al. [151].

Pérez y col. [152], después de medir la relajación magnética, pudieron describir la detección de nanopartículas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-adenovirus 5 (ADV-5) o anti-virus del herpes simple 1 (HSV-1) que, después del reconocimiento, se aglomeran en el presencia del antígeno con, como consecuencia, un aumento del tiempo de relajación. La técnica podría ser de uso potencial para detectar la distribución de virus HSV y ADV por resonancia magnética. en vivo.

Los ensayos de proteínas multiplexadas son detectables con el equipo comercial, comercializado como Verigene Reader (Nanosphere Inc., Northbrook, Ill, EE. UU.). La proteína de interés presente en el suero se une simultáneamente mediante hibridación a: nanopartículas magnéticas funcionalizadas en superficie con anticuerpos primarios que reconocen la proteína de interés nanopartículas de oro funcionalizadas tanto con anticuerpos secundarios que reconocen la proteína de interés como con oliglonucleótidos que tienen diferentes secuencias de bases para identificar cada objetivo proteico de la muestra. Una vez que las nanopartículas han intercalado un objetivo proteico, se utiliza un imán permanente para separarlo y aislarlo del resto.

La detección óptica se basa en la captura de la luz dispersa de las nanopartículas a base de oro (método escanométrico) [153].

Se han sintetizado nanopartículas magnéticas recubiertas con DMSA (ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico) y unidas covalentemente a troponina I cardíaca antihumana, y su actividad biológica se ha evaluado mediante ELISA y Western Blot. Los estudios de estabilidad revelaron que después de 300 días los anticuerpos de las nanopartículas magnéticas retuvieron su actividad biológica [154].

11. Conjugación de anticuerpos a nanopartículas

La bioconjugación puede tener lugar mediante adsorción (en el punto isoeléctrico del anticuerpo mediante interacción electrostática), mediante enlace covalente directo entre la superficie de la nanopartícula y el anticuerpo, o mediante el uso de moléculas adaptadoras. El uso de moléculas adaptadoras generalmente implica estreptavidina y biotina para la formación del complejo. Los anticuerpos biotinilados se proporcionan comercialmente. Como ejemplo, el antiinflamatorio de cabra policlonal marcado con biotinaEscherichia coli Se han unido anticuerpos a nanopartículas magnéticas recubiertas de estreptavidina y se han utilizado para la separación y cuantificación selectiva de Escherichia coli O157: H7 en carne molida de res en presencia de otras bacterias [155].

Además, las nanopartículas de gelatina y albúmina de suero humano han sido modificadas en la superficie por la unión covalente de la proteína de unión a biotina NeutrAvidin. lo que permite la unión de anticuerpos anti-HER2 biotinilados, mostrando el direccionamiento celular específico intracelular [156]. Este grupo también describió el direccionamiento selectivo de las mismas nanopartículas conjugadas con anticuerpos, específicos para el antígeno CD3 en células de leucemia de células T humanas positivas para CD3 y linfocitos T primarios [157]. La misma proteína de unión a biotina se ha unido a la superficie de nanopartículas de poli (ácido DL-láctico) gracias a la presencia de funciones tiol en su superficie [158].

La clara ventaja de usar enlaces covalentes en comparación con la adsorción física es que el enlace evita el desplazamiento competitivo de los anticuerpos adsorbidos por los componentes sanguíneos, lo que ocurre con los anticuerpos adsorbidos.

La bioconjugación óptima implicaría la unión covalente del anticuerpo a través de la región Fc (fragmento: cristalizable), dejando la región del sitio de unión al antígeno Fab (fragmento: unión al antígeno) orientada hacia el medio para preservar su función completa, y en una proporción de uno. a uno para permitir una cuantificación directa. Además, se recomienda encarecidamente el uso de un espaciador para aumentar las probabilidades de que el anticuerpo encuentre su antígeno correspondiente. Por tanto, la unión covalente orientada puede aumentar la estabilidad del anticuerpo y controlar los sitios de unión a proteínas disponibles.

La excelente revisión de Nobs et al. [159] describe los métodos actuales para unir ligandos dirigidos a liposomas y nanopartículas.

11.1. Orientación aleatoria de anticuerpos

Es posible preparar nanopartículas conjugadas con anticuerpos, donde los anticuerpos se unen aleatoriamente a la superficie de la nanopartícula, mediante el uso de numerosos enfoques; sin embargo, los siguientes son los más comunes.

(1) Formación de una base de Schiff entre la amina primaria del anticuerpo y los grupos aldehído libres del glutaraldehído (reticulante bifuncional) presentes en la superficie de la nanopartícula con funcionalidad amino [160].

(2) Formación de un enlace amida entre las nanopartículas carboxiladas y los grupos amino de los anticuerpos, utilizando EDAC o EDC (hidrocloruro de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida) como agentes de reticulación [161]. Siguiendo este procedimiento, nanopartículas magnéticas carboxiladas comerciales se han unido covalentemente a anticuerpos policlonales utilizados contra un antibiótico a base de sulfonamida, que puede estar presente en productos lácteos, para la captura selectiva y el enriquecimiento de esos antimicrobianos en muestras de leche y cabello [162]. Las células tumorales de mama epiteliales invasivas también han sido dirigidas con ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) conjugado con un anticuerpo monoclonal marcado con fluorocromo, que reconoce las citoqueratinas expresadas en líneas de células epiteliales de mama y células tumorales de mama. La adsorción física y el enlace covalente, con EDC como reactivo de enlace para formar un enlace amida, se utilizaron como comparación. Un ensayo de unión utilizando lisado celular reveló que las propiedades de reconocimiento se conservaron solo para las nanopartículas con el anticuerpo monoclonal adsorbido en su superficie [163], corroborando que es necesaria la orientación correcta del anticuerpo. Se utilizó la química de carbodiimida para unir anti-anticuerpos policlonales al siglec-7 (similar a CD33) y a nanopartículas de PLGA cargadas con colorante, así como para corroborar la vía de internalización celular a través de los compartimentos endosomales mediante microscopía confocal en fibroblastos embrionarios de ratón [ 164].

(3) Formación de un derivado de isourea entre los grupos hidroxilo de la superficie de las nanopartículas y los grupos amino de los anticuerpos, utilizando bromuro de cianógeno [165].

(4) Se han funcionalizado nanopartículas de poli (ácido láctico) con grupos carboxilo y se han unido a un nucleófilo (cisteína o cistamina) para proporcionar grupos tiol mediante un enlace amida [166]. Los anticuerpos monoclonales anti-HER2 (Herceptin) y anti-CD20 (Mabthera) se acoplaron covalentemente a dos tipos de nanopartículas de poli (ácido DL-láctico) marcadas. Los grupos tiol se introdujeron en la superficie de las nanopartículas mediante una reacción de carbodiimida de dos pasos. El enlace covalente se logró utilizando un reticulante bifuncional. In vitro Los resultados mostraron una localización celular diferente para ambas nanopartículas dependiendo del tipo de interacción antígeno-anticuerpo involucrada [167].

El trabajo de Fuentes et al. [168] describe la actividad biológica de IgG anti-peroxidasa de rábano picante unida a soportes activados, utilizando la química de acoplamiento orientado y aleatorio de los anticuerpos, abriendo el espectro de alternativas para la unión.

11.2. Conjugación orientada del anticuerpo

Es una ventaja si la unión del anticuerpo a través de su región Fc a la nanopartícula es bastante fácil, sin modificar la actividad del anticuerpo, estable en un medio con alta concentración iónica y permitiendo una alta carga de anticuerpo por nanopartícula.

Además del uso de la proteína A, que interactúa específicamente con el fragmento Fc del anticuerpo como se mencionó anteriormente, la literatura describe diferentes estrategias para la unión direccional de los anticuerpos con los sitios de unión al antígeno en la porción Fab dirigida hacia afuera desde la superficie. de la nanopartícula y, por lo tanto, disponible para la focalización. Estas estrategias incluyen la funcionalización superficial de las nanopartículas para producir aldehídos, epóxidos, tioles, etc. Es posible lograr una conjugación orientada con esos grupos funcionales utilizando los siguientes enlaces: aldehídos a la región rica en lisina del anticuerpo epóxidos a la región rica en histidina del anticuerpo y tioles a los grupos tiol centrales del anticuerpo obtenido por reducción . Se han conjugado anticuerpos monoclonales de ratón glicosilados a través de la región Fc con nanopartículas de oro, empleando una unión covalente de un enlazador heterofuncional (una hidrazida adípica unida a amida) y un alcano que termina en una atadura de ditiol mediante enlaces oro-tiol [135]. Se ha demostrado que el epoxi-quelato hetero-funcional y la inmovilización por la cadena de azúcar en los grupos amino son otra estrategia para lograr el acoplamiento orientado de anticuerpos [168].

La otra alternativa, donde no es necesaria una orientación específica del anticuerpo, es la unión directa de los fragmentos del anticuerpo (Fabs) a la superficie de las nanopartículas.

Por esta razón, los inmunoliposomas de circulación prolongada (Stealth) se dirigieron contra el antígeno de células B CD19, a través de un anticuerpo monoclonal HD37 completo (mAb HD37), frente a su

fragmento (HD37) o un fragmento Fv monocatenario HD37-c-myc-Cys-His5 (scFv, HD37-CCH) dirigido contra el mismo epítopo [169]. El acoplamiento a través del fragmento Fab mostró la vida media en circulación más larga de las nanopartículas conjugadas probadas y pareció ser un poco más eficaz que las otras para prolongar los tiempos de supervivencia.

12. Conclusiones

Los anticuerpos monoclonales (mAb), o moléculas derivadas de ellos, son elementos básicos para los laboratorios de diagnóstico e investigación clínica, pero también son algunos de los fármacos de mayor impacto en el tratamiento de diferentes enfermedades humanas, incluido el cáncer. Actualmente, existen al menos 26 mAb aprobados para terapia humana, la mayoría de los cuales son anticuerpos recombinantes o humanizados. Estos anticuerpos tienen principalmente secuencias humanas en su estructura, y una minoría de murinas, con el fin de eliminar o reducir la respuesta inmune. Sin embargo, los anticuerpos tienen un potencial terapéutico masivo y, actualmente, 150 ya se encuentran en diferentes fases de ensayos clínicos y es probable que, en un futuro próximo, muchos de ellos sean aprobados por las autoridades reguladoras para uso terapéutico contra diferentes enfermedades. Actualmente, la nanotecnología está experimentando un rápido desarrollo enorme, haciendo posible una amplia variedad de aplicaciones, especialmente en el campo de la in vitro y en vivo diagnóstico e incluso en terapia humana. El siglo XX se caracterizó por la gran expansión de la producción de mAb para técnicas de diagnóstico e investigación a partir de los últimos años de ese siglo y en el siglo XXI hemos entrado en la era de los mAb y las nanopartículas en la terapia humana. En esta revisión hemos intentado resumir las técnicas más utilizadas para la producción de estos fármacos, para mostrar las que tienen más ventajas, así como para aportar una actualización de los anticuerpos monoclonales actualmente aprobados para uso terapéutico.

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a la Acción Española de Nanociencia NAN200409270-C3-1 / 2, a la Xunta de Galicia (PGIDIT06TMT31402PR) y al Programa Consolider Ingenio 2010 (CSD2006-00012) por apoyar este estudio. M. Arruebo agradece el apoyo del Programa “Ramón y Cajal” 2006 (orden ECI / 158/2005). Los autores Manuel Arruebo y Mónica Valladares contribuyeron igualmente al manuscrito.

Referencias

  1. El Proyecto sobre Nanotecnologías Emergentes, Centro Internacional Woodrow Wilson para Académicos, 2008, http://www.nanotechproject.org/.
  2. The Royal Society y Royal Academy of Engineering, "Nanociencia y nanotecnologías: oportunidades e incertidumbres", Reporte, The Royal Society, Londres, Reino Unido, 2004. Ver en: Google Scholar
  3. C. Bennett, W. H. Konigsberg y G. M. Edelman, “La estructura covalente de una inmunoglobulina γ G humana. IX. Asignación de residuos de asparaginilo y glutaminilo ” Bioquímica, vol. 9, no. 16, págs. 3181–3188, 1970. Ver en: Google Scholar
  4. A. M. Lesk y C. Chothia, “Evolución de proteínas formadas por láminas β. II. El núcleo de los dominios de inmunoglobulina " Revista de biología molecular, vol. 160, no. 2, págs. 325–342, 1982. Ver en: Google Scholar
  5. G. W. Siskind, "Redes de idiotipos y el control de las respuestas inmunitarias", Investigación de uremia, vol. 8, no. 3-4, págs. 179–181, 1984. Ver en: Google Scholar
  6. D. A. Bell, B. Hahn y G. Harkiss, "Idiotipos, anticuerpos e inmunopatología", Lupus, vol. 1, no. 5, págs. 335–337, 1992. Ver en: Google Scholar
  7. D. R. Burton, L. Gregory y R. Jefferis, "Aspectos de la estructura molecular de las subclases de IgG", Monografías en alergia, vol. 19, págs. 7-35, 1986. Ver en: Google Scholar
  8. B. Alberts, A. Johnson, D. Bray y col., Biología molecular de la célula, Taylor y Francis, Londres, Reino Unido, 1989.
  9. E. A. Kabat, T. T. Wu y H. Bilofsky, "Distribuciones inusuales de aminoácidos en segmentos que determinan la complementariedad (hipervariables) de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas y sus posibles funciones en la especificidad de los sitios de combinación de anticuerpos". La revista de química biológica, vol. 252, no. 19, págs. 6609–6616, 1977. Ver en: Google Scholar
  10. E. A. Kabat, "La base estructural de la complementariedad de anticuerpos", Avances en la química de las proteínas, vol. 32, págs. 1-75, 1978. Ver en: Google Scholar
  11. R. K. Jain, "Transporte de moléculas a través de la vasculatura tumoral", Evaluaciones de metástasis de cáncer, vol. 6, págs. 559–593, 1987. Ver en: Google Scholar
  12. L. M. Weiner, "Terapia con anticuerpos monoclonales del cáncer", Seminarios de Oncología, vol. 26, no. 5, suplemento 14, págs. 43–51, 1999. Ver en: Google Scholar
  13. J. García-Conde e I. Benet, “Tratamiento de los linfomas con anticuerpos monoclonales”, Revisiones en Cáncer, vol. 13, no. 4, págs. 153–165, 1999. Ver en: Google Scholar
  14. S. D. Gorman y M. R. Clark, "Humanización de anticuerpos monoclonales para terapia", Seminarios de inmunología, vol. 2, no. 6, págs. 457–466, 1990. Ver en: Google Scholar
  15. S. L. Morrison, "Anticuerpos in vitro: estrategias de producción y aplicación", Revisión anual de inmunología, vol. 10, págs. 239–265, 1992. Ver en: Google Scholar
  16. M. J. Coloma, A. Hastings, L. A. Wims y S. L. Morrison, "Nuevos vectores para la expresión de moléculas de anticuerpos utilizando regiones variables generadas por la reacción en cadena de la polimerasa", Revista de métodos inmunológicos, vol. 152, no. 1, págs. 89-104, 1992. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  17. J. J. Trill, A. R. Shatzman y S. Ganguly, "Producción de anticuerpos monoclonales en células COS y CHO", Opinión actual en biotecnología, vol. 6, no. 5, págs. 553–560, 1995. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  18. I. Rasched y E. Oberer, "Ff colifagos: relaciones estructurales y funcionales", Revisiones microbiológicas, vol. 50, no. 4, págs. 401–427, 1986. Ver en: Google Scholar
  19. M. Russel, "Ensamblaje de fagos filamentosos", Microbiología molecular, vol. 5, no. 7, págs. 1607–1613, 1991. Ver en: Google Scholar
  20. M. Buchwald, H. Murialdo y L. Siminovitch, “La morfogénesis del bacteriófago lambda. II. Identificación de las principales proteínas estructurales ” Virología, vol. 42, no. 2, págs. 390–400, 1970. Ver en: Google Scholar
  21. W. C. Earnshaw y S. R. Casjens, "Empaquetado de ADN por los bacteriófagos de ADN de doble hebra", Celda, vol. 21, págs. 319–331, 1980. Ver en: Google Scholar
  22. W. D. Huse, L. Sastry, S. A. Iverson et al., "Generación de una gran biblioteca combinatoria del repertorio de inmunoglobulinas en el fago lambda", Ciencias, vol. 246, no. 4935, págs. 1275–1281, 1989. Ver en: Google Scholar
  23. J. McCafferty, A. D. Griffiths, G. Winter y D. J. Chiswell, "Anticuerpos de fagos: fagos filamentosos que muestran dominios variables de anticuerpos", Naturaleza, vol. 348, no. 6301, págs. 552–554, 1990. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  24. T. J. Vaughan, A. J. Williams, K. Pritchard et al., "Anticuerpos humanos con afinidades sub-nanomolares aislados de una gran biblioteca de presentación de fagos no inmunizados", Biotecnología de la naturaleza, vol. 14, no. 3, págs. 309–314, 1996. Ver en: Google Scholar
  25. C. Rader y C. F. Barbas III, "Presentación en fagos de bibliotecas de anticuerpos combinatorios", Opinión actual en biotecnología, vol. 8, no. 4, págs. 503–508, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  26. R. Newman, J. Alberts, D. Anderson et al., "" Primatización "de anticuerpos recombinantes para inmunoterapia de enfermedades humanas: un anticuerpo quimérico macaco / humano contra CD4 humano", Biotecnología, vol. 10, no. 11, págs. 1455–1460, 1992. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  27. G. Winter y W. J. Harris, "Anticuerpos humanizados", Inmunología hoy, vol. 14, no. 6, págs. 243–246, 1993. Ver en: Google Scholar
  28. S. L. Morrison, M. J. Johnson, L. A. Herzenberg y V. T. Oi, "Moléculas de anticuerpos humanos quiméricos: dominios de unión a antígenos de ratón con dominios de región constante humana", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 81, no. 21, págs. 6851–6855, 1984. Ver en: Google Scholar
  29. G. L. Boulianne, N. Hozumi y M. J. Shulman, "Producción de anticuerpo humano / ratón quimérico funcional", Naturaleza, vol. 312, no. 5995, págs. 643–646, 1984. Ver en: Google Scholar
  30. H. R. Hoogenboom, J. D. Marks, A. D. Griffiths y G. Winter, "Construyendo anticuerpos a partir de sus genes", Revisiones inmunológicas, no. 130, págs. 41–68, 1992. Ver en: Google Scholar
  31. A. F. LoBuglio, R. H. Wheeler, J. Trang et al., "Anticuerpo monoclonal quimérico de ratón / humano en el hombre: cinética y respuesta inmune", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 86, no. 11, págs. 4220–4224, 1989. Ver en: Google Scholar
  32. M. J. Glennie y P. W. M. Johnson, "Ensayos clínicos de terapia con anticuerpos", Inmunología hoy, vol. 21, no. 8, págs. 403–410, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  33. M. R. Hurle y M. Gross, "Técnicas de ingeniería de proteínas para la humanización de anticuerpos", Opinión actual en biotecnología, vol. 5, no. 4, págs. 428–433, 1994. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  34. M. Verhoeyen, C. Milstein y G.Winter, "Remodelación de anticuerpos humanos: injerto de una actividad antilisozima", Ciencias, vol. 239, no. 4847, págs. 1534–1536, 1988. Ver en: Google Scholar
  35. E. A. Padlan, "Un posible procedimiento para reducir la inmunogenicidad de los dominios variables de anticuerpos mientras se conservan sus propiedades de unión a ligandos", Inmunologia molecular, vol. 28, no. 4-5, págs. 489–498, 1991. Ver en: Google Scholar
  36. M. Brüggemann, G. Winter, H. Waldmann y M. S. Neuberger, "La inmunogenicidad de los anticuerpos quiméricos", Revista de Medicina Experimental, vol. 86, págs. 6709–6713, 1989. Ver en: Google Scholar
  37. P. S. Andersen, H. Orum y J. Engberg, "Clonación en un solo paso de fragmentos de genes Fab murinos independientes del isotipo IgH para bibliotecas de presentación de fagos", BioTécnicas, vol. 20, no. 3, págs. 340–342, 1996. Ver en: Google Scholar
  38. M. P. Reddy, C. A. S. Kinney, M. A. Chaikin et al., "Eliminación de las funciones efectoras dependientes del receptor Fc de un anticuerpo monoclonal IgG4 modificado para CD4 humano", La revista de inmunología, vol. 164, no. 4, págs. 1925–1933, 2000. Ver en: Google Scholar
  39. A. Sharma, C. B. Davis, L. A. P. Tobia et al., "Farmacodinamia comparativa de keliximab y clenoliximab en ratones transgénicos portadores de CD4 humano", La Revista de Farmacología y Terapéutica Experimental, vol. 293, no. 1, págs. 33–41, 2000. Ver en: Google Scholar
  40. J. M. Reichert, "Evaluación de tecnología: lumiliximab, Biogen Idec", Opinión Actual en Terapéutica Molecular, vol. 6, no. 6, págs. 675–683, 2004. Ver en: Google Scholar
  41. A. Plückthum, A. Krebber, C. Krebber et al., "Producción de anticuerpos g en Escherichia coli: de la PCR a la fermentación", en Ingeniería de anticuerpos: un enfoque práctico, J. McCafferty, H. R. Hoogenboom y D. J. Chiswell, Eds., Págs. 203–252, Oxford IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1996. Ver en: Google Scholar
  42. R. E. Bird, K. D. Hardman, J. W. Jacobson et al., "Proteínas de unión a antígenos de cadena única", Ciencias, vol. 242, no. 4877, págs. 423–426, 1988. Ver en: Google Scholar
  43. J. S. Huston, D. Levinson, M. Mudgett-Hunter et al., "Ingeniería de proteínas de los sitios de unión de anticuerpos: recuperación de la actividad específica en un análogo Fv monocatenario anti-digoxina producido en Escherichia coli", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 85, no. 16, págs. 5879–5883, 1988. Ver en: Google Scholar
  44. R. H. J. Begent, M. J. Verhaar, K. A. Chester et al., "Evidencia clínica de una dirección tumoral eficaz basada en un anticuerpo Fv monocatenario seleccionado de una biblioteca combinatoria", Medicina de la naturaleza, vol. 2, no. 9, págs. 979–984, 1996. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  45. A. Mayer, E. Tsiompanou, D. O'Malley et al., "Cirugía radioinmunoguiada en el cáncer colorrectal utilizando un anticuerpo Fv monocatenario anti-CEA modificado genéticamente", Investigación clínica del cáncer, vol. 6, no. 5, págs. 1711–1719, 2000. Ver en: Google Scholar
  46. M. Brennan, P. F. Davison y H. Paulus, "Preparación de anticuerpos biespecíficos mediante recombinación química de fragmentos de inmunoglobulina G 1 monoclonales", Ciencias, vol. 229, no. 4708, págs. 81–83, 1985. Ver en: Google Scholar
  47. M. J. Glennie, H. M. McBride, A. T. Worth y G. T. Stevenson, "Preparación y rendimiento de anticuerpos biespecíficos F (ab 'γ) 2 que contienen fragmentos Fab' γ unidos a tioéter", La revista de inmunología, vol. 139, no. 7, págs. 2367–2375, 1987. Ver en: Google Scholar
  48. P. Holliger y G. Winter, "Diacuerpos: pequeños fragmentos de anticuerpos biespecíficos", Inmunoterapia contra el cáncer Inmunoterapia, vol. 45, no. 3-4, págs. 128–130, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  49. P. Holliger, T. Prospero y G. Winter, "" Diabodies ": pequeños fragmentos de anticuerpos bivalentes y biespecíficos", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 90, no. 14, págs. 6444–6448, 1993. Ver en: Google Scholar
  50. A. A. Kortt, M. Lah, G. W. Oddie et al., "Los fragmentos Fv monocatenarios del anticuerpo anti-neuraminidasa NC10 que contienen enlazadores de cinco y diez residuos forman dímeros y con enlazador de residuo cero un trímero". Ingeniería de proteínas, vol. 10, no. 4, págs. 423–433, 1997. Ver en: Google Scholar
  51. P. J. Hudson, "Fragmentos de anticuerpos recombinantes", Opinión actual en biotecnología, vol. 9, no. 4, págs. 395–402, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  52. A. Tramontano, E. Bianchi, S. Venturini, F. Martin, A. Pessi y M. Sollazzo, "La fabricación del minicuerpo: una proteína beta diseñada para la visualización de péptidos con restricción conformacional", Revista de reconocimiento molecular, vol. 7, no. 1, págs. 9-24, 1994. Ver en: Google Scholar
  53. S. Hu, L. Shively, A. Raubitschek et al., "Minicuerpo: un nuevo fragmento de anticuerpo antígeno carcinoembrionario diseñado por ingeniería (Fv-C H 3 monocatenario) que muestra un direccionamiento rápido y de alto nivel de xenoinjertos". Cáncer, vol. 56, págs. 3055-3061, 1996. Ver en: Google Scholar
  54. E. Li, A. Pedraza, M. Bestagno, S. Mancardi, R. Sanchez y O. Burrone, "Expresión de células de mamíferos de proteínas inmunes pequeñas diméricas (SIP)", Ingeniería de proteínas, vol. 10, no. 6, págs. 731–736, 1997. Ver en: Google Scholar
  55. C. Hamers-Casterman, T. Atarhouch, S. Muyldermans et al., "Anticuerpos naturales desprovistos de cadenas ligeras", Naturaleza, vol. 363, no. 6428, págs. 446–448, 1993. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  56. V. K. Nguyen, R. Hamers, L. Wyns y S. Muyldermans, "La pérdida de la señal de consenso de empalme es responsable de la eliminación de todo el dominio C H 1 de los anticuerpos funcionales de cadena pesada de IGG2A de camello", Inmunologia molecular, vol. 36, no. 8, págs. 515–524, 1999. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  57. J. Davies y L. Riechmann, "Dominios de anticuerpos V H como pequeñas unidades de reconocimiento", Biotecnología, vol. 13, no. 5, págs. 475–479, 1995. Ver en: Google Scholar
  58. P. Colas, "El cambio de once años de aptámeros de péptidos", Revista de biología, vol. 7, no. 1, artículo 2, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  59. K. J. Bentley, R. Gewert y W. J. Harris, "Eficiencia diferencial de expresión de anticuerpos humanizados en células de mamíferos transfectadas transitorias", Hibridoma, vol. 17, no. 6, págs. 559–567, 1998. Ver en: Google Scholar
  60. W. Zhou, C.-C. Chen, B. Buckland y J. Aunins, "Cultivo por lotes alimentados de células de mieloma NSO recombinantes con alta producción de anticuerpos monoclonales", Biotecnología y Bioingeniería, vol. 55, no. 5, págs. 783–792, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  61. E. M. Yoo, K. R. Chintalacharuvu, M. L. Penichet y S. L. Morrison, "Myeloma expression systems", Revista de métodos inmunológicos, vol. 261, no. 1-2, págs. 1–20, 2002. Ver en: Google Scholar
  62. C. K. Borrebaeck, A. C. Malmborg y M. Ohlin, "¿La glicosilación endógena previene el uso de anticuerpos monoclonales de ratón como terapéutica contra el cáncer?" Inmunología hoy, vol. 14, no. 10, págs. 477–479, 1993. Ver en: Google Scholar
  63. J. M. McCune, R. Namikawa, H. Kaneshima, L. D. Shultz, M. Lieberman e I. L. Weissman, "El ratón SCID-hu: modelo murino para el análisis de la diferenciación y función hematolinfoide humana", Ciencias, vol. 241, no. 4873, págs. 1632–1639, 1988. Ver en: Google Scholar
  64. D. E. Mosier, R. J. Gulizia, S. M. Baird y D. B. Wilson, "Transferencia de un sistema inmunológico humano funcional a ratones con inmunodeficiencia combinada grave", Naturaleza, vol. 335, no. 6187, págs. 256–259, 1988. Ver en: Google Scholar
  65. S. Kamel-Reid y J. E. Dick, "Injerto de ratones inmunodeficientes con células madre hematopoyéticas humanas", Ciencias, vol. 242, no. 4886, págs. 1706–1709, 1988. Ver en: Google Scholar
  66. Y. Reisner y S. Dagan, "El ratón Trimera: generación de anticuerpos monoclonales humanos y un modelo animal para enfermedades humanas", Tendencias en biotecnología, vol. 16, no. 6, págs. 242–246, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  67. L. Zhu, M.-C. van de Lavoir, J. Albanese et al., "Producción de anticuerpo monoclonal humano en huevos de pollos quiméricos", Biotecnología de la naturaleza, vol. 23, no. 9, págs. 1159-1169, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  68. M. Brüggemann y M. J. Taussig, "Producción de repertorios de anticuerpos humanos en ratones transgénicos", Opinión actual en biotecnología, vol. 8, no. 4, págs. 455–458, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  69. L. L. Green, "Ingeniería de anticuerpos a través de la ingeniería genética del ratón: las cepas de XenoMouse son un vehículo para la generación fácil de anticuerpos monoclonales humanos terapéuticos", Revista de métodos inmunológicos, vol. 231, no. 1-2, págs. 11–23, 1999. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  70. N. Lonberg, L. D. Taylor, F. A. Harding et al., "Anticuerpos humanos específicos de antígeno de ratones que comprenden cuatro modificaciones genéticas distintas", Naturaleza, vol. 368, no. 6474, págs. 856–859, 1994. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  71. S. Magadán, M. Valladares, E. Suarez et al., "Producción de anticuerpos monoclonales humanos específicos de antígeno: comparación de ratones portadores de transloci IgH / kappa o IgH / kappa / lambda", Biotecnología, vol. 33, no. 3, págs. 680–690, 2002. Ver en: Google Scholar
  72. A. Molina, M. Valladares, S. Magadán et al., “El uso de ratones transgénicos para la producción de un anticuerpo monoclonal humano específico para el antígeno CD69 humano”, Revista de métodos inmunológicos, vol. 282, no. 1-2, págs. 147-158, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  73. M. Valladares, I. Sanjuán, S. Magadán, A. Molina, F. Sanjuán y Á. González-Fernández, “H24: un anticuerpo monoclonal humano obtenido de ratones portadores de genes Ig humanos, reconoce la leucemia mieloide humana y el linfoma CD5-no Hodgkin”, Inmunologia, vol. 23, no. 1, págs. 7 a 15, 2004. Ver en: Google Scholar
  74. E. Suárez, S. Magadán, I. Sanjuán et al., "El reordenamiento de un solo gen del IGHV humano es suficiente para generar un amplio repertorio de respuestas de anticuerpos específicos de antígeno en ratones transgénicos", Inmunología molecular, vol. 43, no. 11, págs. 1827–1835, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  75. B. Díaz, I. Sanjuan, F. Gambón, C. Loureiro, S. Magadán y Á. González-Fernández, “Generación de un anticuerpo monoclonal IgM humano dirigido contra moléculas de HLA clase II: un agente potencial en el tratamiento de neoplasias hematológicas”, Inmunología del cáncer, inmunoterapia, vol. 58, no. 3, págs. 351–360, 2009. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  76. M. L. Linenberger, D. G. Maloney e I. D. Bernstein, "Terapias dirigidas por anticuerpos para malignidades hematológicas", Tendencias en medicina molecular, vol. 8, no. 2, págs. 69–76, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  77. S. K. Hobbs, W. L. Monsky, F. Yuan et al., "Regulación de las vías de transporte en los vasos tumorales: función del tipo de tumor y el microambiente", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 95, no. 8, págs. 4607–4612, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  78. M. Arruebo, R. Fernández-Pacheco, M. R. Ibarra y J. Santamaría, “Nanopartículas magnéticas para la administración de fármacos”, Nano hoy, vol. 2, no. 3, págs. 22–32, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  79. S. Burstein y R. Knapp, "Quimioterapia del carcinoma de ovario murino mediante conjugados de metotrexato-anticuerpo", Revista de química medicinal, vol. 20, no. 7, págs. 950–952, 1977. Ver en: Google Scholar
  80. E. Aboud-Pirak, B. Lesur, K. S. P. B. Rao, R. Baurain, A. Trouet y Y.-J. Schneider, "Actividad citotóxica de daunorrubicina o vindesina conjugada con un anticuerpo monoclonal en células de carcinoma de mama MCF-7 cultivadas", Farmacología bioquímica, vol. 38, no. 4, págs. 641–648, 1989. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  81. M. C. Garnett, "Conjugados de fármacos dirigidos: principios y progreso", Reseñas de administración avanzada de medicamentos, vol. 53, no. 2, págs. 171–216, 2001. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  82. Y. Ikeda y K. Taira, "Entrega dirigida por ligando de ARNip terapéutico", Investigación farmacéutica, vol. 23, no. 8, págs. 1631–1640, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  83. B. Gupta y V. P. Torchilin, "Liposomas cargados con doxorrubicina modificada con anticuerpo monoclonal 2C5 con actividad terapéutica significativamente mejorada contra xenoinjertos de tumor intracraneal de cerebro humano U-87 MG en ratones desnudos", Inmunología del cáncer, inmunoterapia, vol. 56, no. 8, págs. 1215–1223, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  84. B. Sun, B. Ranganathan y S.-S. Feng, "Nanopartículas multifuncionales de poli (d, l-lactida-co-glicólido) / montmorillonita (PLGA / MMT) decoradas con Trastuzumab para la quimioterapia dirigida del cáncer de mama" Biomateriales, vol. 29, no. 4, págs. 475–486, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  85. I. Steinhauser, B. Spänkuch, K. Strebhardt y K. Langer, "Nanopartículas modificadas con trastuzumab: optimización de la preparación y absorción en las células cancerosas", Biomateriales, vol. 27, no. 28, págs. 4975–4983, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  86. G. Kou, J. Gao, H. Wang et al., "Preparación y caracterización de nanopartículas de PLGA cargadas con paclitaxel recubiertas con anticuerpo catiónico de cadena sencilla SM5-1", Revista de bioquímica y biología molecular, vol. 40, no. 5, págs. 731–739, 2007. Ver en: Google Scholar
  87. M. Fujita, B.-S. Lee, N. M. Khazenzon et al., "Direccionamiento en tándem de tumores cerebrales mediante una combinación de anticuerpos monoclonales unidos al biopolio (ácido ß-L-málico)", Diario de liberación controlada, vol. 122, no. 3, págs. 356–363, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  88. K. M. Tyner, S. R. Schiffman y E. P. Giannelis, "Nanobiohíbridos como vehículos de administración de camptotecina", Diario de liberación controlada, vol. 95, no. 3, págs. 501–514, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  89. A. Aigner, "Nanosistemas dirigidos a tumores para la entrega de ARNip", Nanomedicina, vol. 2, no. 4, págs. 569–572, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  90. M. E. Hayes, D. C. Drummond, D. B. Kirpotin et al., "Genospheres: nanopartículas de ácido nucleico-lípido de autoensamblaje adecuadas para la entrega de genes dirigida", Terapia de genes, vol. 13, no. 7, págs. 646–651, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  91. J. D. Heidel, Z. Yu, J. Y.-C. Liu et al., “Administración en primates no humanos de dosis intravenosas crecientes de nanopartículas dirigidas que contienen ARNip de la subunidad M2 de ribonucleótido reductasa”, Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 104, no. 14, págs. 5715–5721, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  92. J. L. West, R. Drezek, S. Sershen y N. J. Halas, “Nanopartículas de absorción óptica para mejorar la reparación de tejidos”, patente de EE. UU. Núm. 6685730 WO03026481, Rice University, Houston, Tex, EE. UU., 2002. Ver en: Google Scholar
  93. T. Ashikaga, M. Wada, H. Kobayashi et al., "Efecto de la actividad fotocatalítica del TiO 2 en el ADN plasmídico", Investigación de mutaciones, vol. 466, no. 1, págs. 1–7, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  94. J. Xu, Y. Sun, J. Huang et al., "Fotokilling de células cancerosas usando anticuerpos altamente específicos de células - bioconjugados de TiO 2 y electroporación", Bioelectroquímica, vol. 71, no. 2, págs. 217–222, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  95. C. Ogino, K. Kanehira, R. Sasai, S. Sonezaki y N. Shimizu, "Reconocimiento y degradación efectiva del 17 β-estradiol por nanopartículas de TiO 2 inmovilizadas con anticuerpos anti-estradiol", Revista de biociencia y bioingeniería, vol. 104, no. 4, págs. 339–342, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  96. I. H. El-Sayed, X. Huang y M. A. El-Sayed, "Terapia fototérmica con láser selectiva del carcinoma epitelial con nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos anti-EGFR", Letras de cáncer, vol. 239, no. 1, págs. 129-135, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  97. V. P. Zharov, K. E. Mercer, E. N. Galitovskaya y M. S. Smeltzer, "Nanoterapéutica fototérmica y nanodiagnóstico para la destrucción selectiva de bacterias dirigidas con nanopartículas de oro", Revista biofísica, vol. 90, no. 2, págs. 619–627, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  98. L. R. Hirsch, R. J. Stafford, J. A. Bankson et al., "Terapia térmica de tumores en el infrarrojo cercano mediada por nanocapas bajo guía de resonancia magnética", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 100, no. 23, págs. 13549–13554, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  99. S. J. DeNardo, G. L. DeNardo, L. A. Miers et al., "Desarrollo de bio-sondas dirigidas a tumores (I 111 n-nanopartículas de anticuerpos monoclonales L6 quiméricos n) para la terapia del cáncer de campo magnético alterno", Investigación clínica del cáncer, vol. 11, no. 19, págs. 7087s – 7092s, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  100. F. Tsagkogeorgas, M. Ochsenkühn-Petropoulou, R. Niessner y D.Knopp, "Encapsulación de biomoléculas con fines bioanalíticos: preparación de partículas de sílice de tamaño nanométrico dopadas con anticuerpos de diclofenaco mediante procesamiento de micelas inversas y sol-gel", Analytica Chimica Acta, vol. 573-574, págs. 133-137, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  101. Z. Cui, S.-J. Han, D. P. Vangasseri y L. Huang, "Mecanismo de inmunoestimulación de nanopartículas LPD como portador de vacunas", Farmacéutica molecular, vol. 2, no. 1, págs. 22-28, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  102. M. J. Joralemon, N. L. Smith, D. Holowka, B. Baird y K. L. Wooley, "Nanopartículas reticuladas de concha decorada con antígeno: síntesis, caracterización e interacciones de anticuerpos", Química del bioconjugado, vol. 16, no. 5, págs. 1246–1256, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  103. X. Wang, T. Uto, T. Akagi, M. Akashi y M. Baba, "Nanopartículas de poli (ácido γ-glutámico) como sistema eficaz de administración de antígenos y adyuvante: potencial para una vacuna contra el SIDA", Revista de virología médica, vol. 80, no. 1, págs. 11–19, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  104. A. Debin, R. Kravtzoff, J. V. Santiago et al., "La inmunización intranasal con antígenos recombinantes asociados con nuevas partículas catiónicas induce fuertes respuestas mucosas y sistémicas de anticuerpos y CTL". Vacuna, vol. 20, no. 21-22, págs. 2752–2763, 2002. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  105. M. Amidi, S. G. Romeijn, J. C. Verhoef et al., “norte-nanopartículas de trimetilquitosano (TMC) cargadas con antígeno de la subunidad de la influenza para vacunación intranasal: propiedades biológicas e inmunogenicidad en un modelo de ratón ”. Vacuna, vol. 25, no. 1, págs. 144-153, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  106. D. Lamalle-Bernard, S. Munier, C. Compagnon et al., "La coadsorción de las proteínas p24 y gp120 del VIH-1 en nanopartículas de PLA aniónicas libres de tensioactivos conserva la antigenicidad y la inmunogenicidad". Diario de liberación controlada, vol. 115, no. 1, págs. 57–67, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  107. B. Liu, F. Conrad, M. R. Cooperberg, D. B. Kirpotin y J. D. Marks, "Mapeo del espacio del epítopo tumoral mediante la selección directa de bibliotecas de anticuerpos Fv monocatenarios en células de cáncer de próstata", Investigación sobre el cáncer, vol. 64, no. 2, págs. 704–710, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  108. J. Kandzia, M. J. D. Anderson y W. Müller-Ruchholtz, "Separación celular mediante microesferas magnéticas acopladas a anticuerpos y su aplicación junto con anticuerpos HLA monoclonales", Revista de investigación del cáncer y oncología clínica, vol. 101, no. 1, págs. 165-170, 1981. Ver en: Google Scholar
  109. L. Illum, P. D. E. Jones, R. W. Baldwin y S. S. Davis, "Distribución tisular de nanopartículas de poli (2-cianoacrilato de hexilo) recubiertas con anticuerpos monoclonales en ratones portadores de xenoinjertos de tumores humanos", La Revista de Farmacología y Terapéutica Experimental, vol. 230, no. 3, págs. 733–736, 1984. Ver en: Google Scholar
  110. W. Kemmner, G. Moldenhauer, P. Schlag y R. Brossmer, "Separación de células tumorales de una suspensión de tejido de carcinoma colorrectal humano disociado por medio de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos monoclonales", Revista de métodos inmunológicos, vol. 147, no. 2, págs. 197–200, 1992. Ver en: Google Scholar
  111. C. S. Owen y N. L. Sykes, "Etiquetado magnético y clasificación de células", Revista de métodos inmunológicos, vol. 73, págs. 41–48, 1984. Ver en: Google Scholar
  112. J. P. Mach, F. Buchegger, M. Forni et al., "Uso de anticuerpos anti-CEA monoclonales marcados radiactivamente para la detección de carcinomas humanos mediante fotoescaneo externo y tomoescintigrafía", Immunol hoy, vol. 2, págs. 239–249, 1981. Ver en: Google Scholar
  113. A. Natarajan, C.-Y. Xiong, C. Gruettner, G. L. DeNardo y S. J. DeNardo, "Desarrollo de radioinmunonanopartículas multivalentes para tratamiento y diagnóstico por imágenes del cáncer", Bioterapia contra el cáncer y radiofármacos, vol. 23, no. 1, págs. 82–91, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  114. J. C. Richardson, R. W. Bowtell, K. Mäder y C. D. Melia, "Aplicaciones farmacéuticas de la resonancia magnética (MRI)", Reseñas de administración avanzada de medicamentos, vol. 57, no. 8, págs. 1191–1209, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  115. T. Suwa, S. Ozawa, M. Ueda, N. Ando y M. Kitajima, "Imágenes por resonancia magnética del carcinoma de células escamosas de esófago utilizando partículas de magnetita recubiertas con un anticuerpo receptor del factor de crecimiento antiepidérmico", Revista Internacional de Cáncer, vol. 75, no. 4, págs. 626–634, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  116. T. Koblas, P. Girman, Z. Berkova et al., "Imágenes por resonancia magnética de islotes trasplantados intrahepáticamente utilizando perlas paramagnéticas", Procedimientos de trasplante, vol. 37, no. 8, págs. 3493–3495, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  117. P. M. Winter, K. Cai, J. Chen et al., "Agente de contraste de nanopartículas PARACEST dirigido para la detección de fibrina", Resonancia magnética en medicina, vol. 56, no. 6, págs. 1384-1388, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  118. H.-J. Weinmann, W. Ebert, B. Misselwitz y H. Schmitt-Willich, "Agentes de contraste de RM específicos de tejido", Revista europea de radiología, vol. 46, no. 1, págs. 33–44, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  119. X. Liu, Q. Dai, L. Austin et al., "Un inmunoensayo homogéneo de un solo paso para la detección de biomarcadores de cáncer utilizando sondas de nanopartículas de oro acopladas con dispersión dinámica de luz", Revista de la Sociedad Química Estadounidense, vol. 130, no. 9, págs. 2780–2782, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  120. F. Velge-Roussel, P. Breton, X. Guillon et al., "Caracterización inmunoquímica de nanopartículas recubiertas de anticuerpos", Experientia, vol. 52, no. 8, págs. 803–806, 1996. Ver en: Google Scholar
  121. S. Kubitschko, J. Spinke, T. Bruckner, S. Pohl y N. Oranth, "Mejora de la sensibilidad de los inmunosensores ópticos con nanopartículas", Bioquímica analítica, vol. 253, no. 1, págs. 112–122, 1997. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  122. A. J. Haes, D. A. Stuart, S. Nie y R. P. Van Duyne, "Uso de nanopartículas en fase de solución, matrices de nanopartículas confinadas en la superficie y nanopartículas individuales como plataformas de detección biológica", Diario de fluorescencia, vol. 14, no. 4, págs. 355–367, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  123. A. Tsourkas, V. R. Shinde-Patil, K. A. Kelly et al., "Imágenes in vivo del endotelio activado utilizando una sonda magnetoóptica anti-VCAM-1", Química del bioconjugado, vol. 16, no. 3, págs. 576–581, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  124. J. Yguerabide y E. E. Yguerabide, “Partículas submicroscópicas de dispersión de luz como análogos altamente fluorescentes y su uso como marcadores trazadores en aplicaciones clínicas y biológicas. I. Teoría ” Bioquímica analítica, vol. 262, no. 2, págs. 137-156, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  125. K. Sokolov, M. Follen, J. Aaron et al., "Imágenes ópticas vitales en tiempo real del precáncer utilizando anticuerpos anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico conjugados con nanopartículas de oro", Investigación sobre el cáncer, vol. 63, no. 9, págs. 1999–2004, 2003. Ver en: Google Scholar
  126. D. Yelin, D. Oron, S. Thiberge, E. Moses y Y. Silberberg, "Microscopía de resonancia de plasmón multifotón", Óptica Express, vol. 11, no. 12, págs. 1385-1391, 2003. Ver en: Google Scholar
  127. C. B. Raub, E. J. Orwin y R. Haskell, "Etiquetado inmunológico para mejorar el contraste en la microscopía de coherencia óptica de construcciones corneales de ingeniería tisular", Revista de ingeniería biomecánica, vol. 125, págs. 1 a 6, 2003. Ver en: Google Scholar
  128. L. R. Hirsch, J. B. Jackson, A. Lee, N. J. Halas y J. L. West, "Un inmunoensayo de sangre completa con nanoconchas de oro", Química analítica, vol. 75, no. 10, págs. 2377–2381, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  129. Y. Cui, B. Ren, J.-L. Yao, R.-A. Gu y Z.-Q. Tian, ​​"Síntesis de nanopartículas bimetálicas AgcoreAushell para inmunoensayo basado en espectroscopía Raman de superficie mejorada", Revista de química física B, vol. 110, no. 9, págs. 4002–4006, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  130. H. Sun, A. M. Scharff-Poulsen, H. Gu et al., "Detección de fosfato mediante proteínas indicadoras fluorescentes incrustadas en nanopartículas de poliacrilamida", ACS Nano, vol. 2, no. 1, págs. 19–24, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  131. K. Fu, J. Sun, L. R. Bickford et al., "Medición de la unión celular de nanopartículas plasmónicas inmunodeterminadas: un factor clave para optimizar la eficacia diagnóstica", Nanotecnología, vol. 19, no. 4, ID de artículo 045103, 6 páginas, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  132. I. H. El-Sayed, X. Huang y M. A. El-Sayed, "Dispersión de resonancia de plasmón superficial y absorción de nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos anti-EGFR en el diagnóstico del cáncer: aplicaciones en el cáncer oral", Nano letras, vol. 5, no. 5, págs. 829–834, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  133. R. Tanaka, T. Yuhi, N. Nagatani et al., "Un ensayo de mejora novedoso para tiras reactivas inmunocromatográficas que utilizan nanopartículas de oro", Química analítica y bioanalítica, vol. 385, no. 8, págs. 1414–1420, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  134. M. Arruebo, R. Fernández-Pacheco, B. Velasco et al., “Nanopartículas superparamagnéticas híbridas funcionalizadas con anticuerpo”, Materiales funcionales avanzados, vol. 17, no. 9, págs. 1473–1479, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  135. S. Kumar, J. Aaron y K. Sokolov, "Conjugación direccional de anticuerpos a nanopartículas para la síntesis de agentes de contraste óptico multiplexados con fracciones de administración y de dirección", Protocolos de la naturaleza, vol. 3, no. 2, págs. 314–320, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  136. S.-Z. Yao y Z.-H. Mo, "Propiedades de frecuencia de un cristal de cuarzo piezoeléctrico en soluciones y aplicación a la determinación de sal total", Analytica Chimica Acta, vol. 193, págs. 97-105, 1987. Ver en: Google Scholar
  137. H. Wang, C. Lei, J. Li, Z. Wu, G. Shen y R. Yu, "Un ensayo de inmunoaglutinación piezoeléctrica para anticuerpos de Toxoplasma gondii usando nanopartículas de oro", Biosensores y bioelectrónica, vol. 19, no. 7, págs. 701–709, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  138. Y. Ding, J. Liu, X. Jin, H. Lu, G. Shen y R. Yu, "Nanocompuesto híbrido de poli-L-lisina / hidroxiapatita / nanotubos de carbono aplicado para inmunoensayo piezoeléctrico del antígeno de carbohidrato 19-9", Analista, vol. 133, no. 2, págs. 184–190, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  139. R. De Palma, G. Reekmans, W. Laureyn, G. Borghs y G. Maes, "La optimización de los ensayos magnetosandwich para la detección sensible y específica de proteínas en suero", Química analítica, vol. 79, no. 19, págs. 7540–7548, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  140. H. Zeng, H. Wang, F. Chen et al., "Desarrollo de una matriz de inmunosensores basada en microbalanzas de cristales de cuarzo para la inmunofenotipificación clínica de leucemias agudas", Bioquímica analítica, vol. 351, no. 1, págs. 69–76, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  141. D.-Q. Tang, D.-J. Zhang, D.-Y. Tang y H. Ai, "Amplificación de la interacción antígeno-anticuerpo de inmunosensores de microbalanza de cristal de cuarzo mediante la inmovilización de relleno de nano-oro en la superficie de biorreconocimiento", Revista de métodos inmunológicos, vol. 316, no. 1-2, págs. 144-152, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  142. H. Wang, J. Wu, J. Li, Y. Ding, G. Shen y R. Yu, "Adsorción orientada mejorada con partículas de nano oro de fragmentos de anticuerpos para plataformas de inmunosensibilidad", Biosensores y bioelectrónica, vol. 20, no. 11, págs. 2210–2217, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  143. J. Wang, Instrumentación para el análisis de stripping en el manual de instrumentación analítica, Marcel Dekker, Nueva York, NY, EE. UU., 2da edición, 1997.
  144. D. Tang, R. Yuan y Y. Chai, "Caracterización bioquímica e inmunoquímica de la reacción antígeno-anticuerpo en una interfaz biomimética no tóxica inmovilizados glóbulos rojos de carpa cruciana y nanopartículas de oro", Biosensores y bioelectrónica, vol. 22, no. 6, págs. 1116–1120, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  145. S. Li, R. Zhang, P. Li et al., "Desarrollo de un método novedoso para medir el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) en sueros de pacientes con artritis reumatoide mediante inmunosensor electroquímico combinado", Inmunofarmacología internacional, vol. 8, no. 6, págs. 859–865, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  146. D. Du, X. Xu, S. Wang y A. Zhang, "Inmunosensor de antígeno de carbohidrato amperométrico 19-9 sin reactivo basado en electroquímica directa de peroxidasa de rábano picante inmovilizada", Talanta, vol. 71, no. 3, págs. 1257–1262, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  147. L. Wu, J. Chen, D. Du y H. Ju, "Inmunoensayo electroquímico para CA125 basado en antígeno estabilizado con acetato de celulosa / membrana de nanopartículas de oro coloidal", Electrochimica Acta, vol. 51, no. 7, págs. 1208–1214, 2006. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  148. R. Kotitz, T. Bunte, W. Weitschies y L. Trahms, "Medición de relajación de nanopartículas magnéticas basada en dispositivos de interferencia cuántica superconductora como una herramienta novedosa para la detección específica de unión de reacciones de unión biológica", Revista de física aplicada, vol. 81, págs. 4317–4317, 1997. Ver en: Google Scholar
  149. Y. R. Chemla, H. L. Grossman, Y. Poon et al., "Biosensor magnético ultrasensible para inmunoensayo homogéneo", Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, vol. 97, no. 26, págs. 14268–14272, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  150. K. S. Kim y J.-K. Park, "Inmunoensayo multiplexado basado en fuerzas magnéticas con nanopartículas superparamagnéticas en canales de microfluidos", Laboratorio en un chip, vol. 5, no. 6, págs. 657–664, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  151. D. R. Baselt, G. U. Lee, M. Natesan, S. W. Metzger, P. E. Sheehan y R. J. Colton, "Un biosensor basado en la tecnología de magnetorresistencia", Biosensores y bioelectrónica, vol. 13, no. 7-8, págs. 731–739, 1998. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  152. J. M. Perez, F. J. Simeone, Y. Saeki, L. Josephson y R. Weissleder, "El autoensamblaje de nanopartículas magnéticas inducido por virus permite la detección de partículas virales en medios biológicos", Revista de la Sociedad Química Estadounidense, vol. 125, no. 34, págs. 10192–10193, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  153. T. A. Taton, C. A. Mirkin y R. L. Letsinger, "Detección de matriz de ADN escanométrica con sondas de nanopartículas", Ciencias, vol. 289, no. 5485, págs. 1757–1760, 2000. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  154. S. Zhang, Z. Bian, C. Gu et al., "Preparación de nanopartículas inmunomagnéticas anti-troponina I cardíaca humana y ensayos de actividad biológica", Coloides y superficies B, vol. 55, no. 2, págs. 143–148, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  155. M. Varshney, L. Yang, X.-L. Su y Y. Li, "Conjugados de nanopartículas magnéticas-anticuerpo para la separación de Escherichia coli O157: H7 en carne molida", Revista de protección alimentaria, vol. 68, no. 9, págs. 1804–1811, 2005. Ver en: Google Scholar
  156. H. Wartlick, K. Michaelis, S. Balthasar, K. Strebhardt, J. Kreuter y K. Langer, "Captación celular de nanopartículas modificadas con anticuerpos en células tumorales mediada por HER2 altamente específica", Journal of Drug Targeting, vol. 12, no. 7, págs. 461–471, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  157. N. Dinauer, S. Balthasar, C. Weber, J. Kreuter, K. Langer y H. von Briesen, "Orientación selectiva de nanopartículas conjugadas con anticuerpos a células leucémicas y linfocitos T primarios", Biomateriales, vol. 26, no. 29, págs. 5898–5906, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  158. L. Nobs, F. Buchegger, R. Gurny y E. Allémann, "Nanopartículas de poli (ácido láctico) marcadas con Neutravidin TM biológicamente activa para la focalización activa", Revista europea de farmacia y biofarmacia, vol. 58, no. 3, págs. 483–490, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  159. L. Nobs, F. Buchegger, R. Gurny y E. Allémann, "Métodos actuales para unir ligandos dirigidos a liposomas y nanopartículas", Revista de Ciencias Farmacéuticas, vol. 93, no. 8, págs. 1980–1992, 2004. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  160. G. F. Bickerstaff, Inmovilización de enzimas y células, Methods in Biotechnology, Humana Press, Nueva York, NY, EE. UU., 1997.
  161. T. L. Goodfriend, L. Levine y G. D. Fasman, "Anticuerpos contra bradiquinina y angiotensina: un uso de carbodiimidas en inmunología", Ciencias, vol. 144, no. 3624, págs. 1344–1346, 1964. Ver en: Google Scholar
  162. H. Font, J. Adrian, R. Galve et al., "Ensayos inmunoquímicos para la detección directa de antibióticos de sulfonamida en muestras de leche y cabello utilizando nanopartículas magnéticas derivatizadas con anticuerpos", Diario de la química agrícola y alimentaria, vol. 56, no. 3, págs. 736–743, 2008.Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  163. P. Kocbek, N. Obermajer, M. Cegnar, J. Kos y J. Kristl, "Dirigirse a las células cancerosas mediante nanopartículas de PLGA modificadas en la superficie con anticuerpo monoclonal", Diario de liberación controlada, vol. 120, no. 1-2, págs. 18–26, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  164. C. J. Scott, W. M. Marouf, D. J. Quinn et al., "Direccionamiento inmunocoloidal del receptor siglec-7 endocitótico mediante la unión periférica de anticuerpos siglec-7 a nanopartículas de poli (lactida-co-glicólido)" Investigación farmacéutica, vol. 25, no. 1, págs. 135–146, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  165. S. C. March, I. Parikh y P. Cuatrecasas, "Un método simplificado para la activación de agarosa con bromuro de cianógeno para cromatografía de afinidad", Bioquímica analítica, vol. 60, no. 1, págs. 149-152, 1974. Ver en: Google Scholar
  166. L. Nobs, F. Buchegger, R. Gurny y E. Allémann, "Modificación superficial de nanopartículas de poli (ácido láctico) por unión covalente de grupos tiol mediante tres métodos", Revista Internacional de Farmacia, vol. 250, no. 2, págs. 327–337, 2003. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  167. A. Cirstoiu-Hapca, L. Bossy-Nobs, F. Buchegger, R. Gurny y F. Delie, "Direccionamiento diferencial de células tumorales de nanopartículas acopladas anti-HER2 (Herceptin ®) y anti-CD20 (Mabthera ®)", Revista Internacional de Farmacia, vol. 331, no. 2, págs. 190–196, 2007. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  168. M. Fuentes, C. Mateo, J. M. Guisán y R. Fernández-Lafuente, “Preparación de nanopartículas magnéticas inertes para la inmovilización dirigida de anticuerpos”, Biosensores y bioelectrónica, vol. 20, no. 7, págs. 1380-1387, 2005. Ver en: Sitio del editor | Google Académico
  169. W. W. K. Cheng y T. M. Allen, "Entrega dirigida de doxorrubicina liposomal anti-CD19 en linfoma de células B: una comparación de anticuerpos monoclonales completos, fragmentos Fab 'y Fv de cadena sencilla", Diario de liberación controlada, vol. 126, no. 1, págs. 50–58, 2008. Ver en: Sitio del editor | Google Académico

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Referencias

1. Zaroff, S. y Tan, G. (2019). Tecnología de hibridoma: el método preferido para la generación de anticuerpos monoclonales para aplicaciones in vivo.
2. Zhang, C. (2012). Tecnología de hibridoma para la generación de anticuerpos monoclonales. En Métodos y protocolos de anticuerpos (págs. 117-135). Humana Press, Totowa, Nueva Jersey.
3. Liu, J. K. (2014). La historia del desarrollo de anticuerpos monoclonales: progreso, desafíos pendientes e innovaciones futuras. Anales de Medicina y Cirugía, 3 (4), 113-116.
4. Greenfield, E. A. (2018). Fusión de polietilenglicol para la producción de hibridomas. Protocolos de Cold Spring Harbor, 2018 (3), pdb-prot103176.