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¿Concentración de un promotor específico en una célula?

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Quiero simular la activación de la transcripción por un factor de transcripción (TF) dado con cinética conocida. La tasa de unión $ k_ {on} $ se da en $ mu M ^ {- 1} s ^ {- 1} $, que describe un mecanismo de reacción bimolecular (cinética de reacción de segundo orden). Sin embargo, ¿cuál es la concentración de un promotor específico en una célula?


En un organismo diploide hay dos copias de ADN, lo que significa dos copias o "moléculas" de promotor en toda la célula. El volumen de una célula eucariota típica (HeLa) sería 2,25 × 10-12 litros (Zhao et al. 2007, BioNumbers).

$$ text {Concentración} (M) = frac { text {Moléculas por celda}} { text {Avogadro No.} times text {Volumen de la celda} (l)} $$

Esto viene a alrededor de 1.4758 × 10-12 M para 2 moléculas de promotor. En consecuencia, puede calcular una célula haploide, varios alelos o una célula procariota.

También puede asumir un modelo de 2 compartimentos con núcleo y citoplasma como dos compartimentos diferentes. En este caso, el ADN estaría localizado en el núcleo y por tanto su concentración efectiva sería mayor en el núcleo. Puede buscar el volumen nuclear en BioNumbers e insertarlo en la fórmula anterior para obtener la concentración efectiva.


Zhao, L. y col. "RM específica de agua intracelular de células adherentes a microperlas: la vida útil del intercambio de agua intracelular de las células HeLa". RMN en biomedicina 21.2 (2008): 159-164.


Un promotor inducible por estradiol permite un control rápido y graduado de la expresión génica en la levadura de fisión

La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe carece de un conjunto de herramientas diverso de promotores inducibles para la manipulación experimental. Los promotores inducibles disponibles adolecen de una cinética de inducción lenta, un control limitado de los niveles de expresión y / o un requisito de un medio de crecimiento definido. En particular, ningún sistema promotor inducible de S. pombe exhibe una dosis-respuesta lineal, lo que permitiría ajustar la expresión a niveles específicos. Hemos adaptado un sistema promotor ortogonal rápido con un amplio rango dinámico y una respuesta lineal a la dosis, basado en la función regulada por β-estradiol del receptor de estrógeno humano, para su uso en S. pombe. Mostramos que este sistema promotor, denominado Z3 El EV, se enciende rápidamente, puede alcanzar una inducción máxima de 20 veces y exhibe una respuesta de dosis lineal en todo su rango de inducción, con pocos efectos fuera del objetivo. Demostramos la utilidad de este sistema regulando el inhibidor mitótico Wee1 para crear una cepa en la que el tamaño de las células está regulado por la concentración de β-estradiol. Este sistema promotor será de gran utilidad para regular experimentalmente la expresión génica en levaduras de fisión. Copyright © 2017 John Wiley & amp Sons, Ltd.

Palabras clave: Pombe promotor inducible de levadura de fisión de estradiol ZEV de Schizosaccharomyces.

Derechos de autor © 2017 John Wiley & Sons, Ltd.

Cifras

Figura 1. Z 3 EV regula la dosis dependiente ...

Figura 1. Z 3 EV regula la expresión dependiente de la dosis en S. pombe

(A) Representación esquemática del β-estradiol inducido ...

Figura 2. Z 3 EV regula la expresión ...

Figura 2. Z 3 EV regula la expresión en un amplio rango dinámico

Figura 3. Z 3 EV exhibe rápido ...

Figura 3. Z 3 EV exhibe cinética de inducción rápida

(A) Z 3 EVpr: cinética de inducción de ARNm de GFP. Z…

Figura 4. Efectos globales de Z 3…

Figura 4. Efectos globales de Z 3 Actividad de EV sobre el crecimiento celular y la expresión génica


¿Concentración de un promotor específico en una célula? - biología

Resumen del artículo:

Promotores utilizados en la regulación genética y sus tipos
Autor: Ekatpure Sachin Chandrakant

Introducción :
El flujo de información genética en la célula comienza en el ADN, que se replica para formar más ADN. Luego, la información se "transcribe" en ARN y luego se "traduce" en proteína. Para el proceso completo de regulación génica se necesitan elementos reguladores como promotores y elementos que actúan en cis. El efecto coordinado de estos elementos puede inducir la expresión de un gen.

Definición
Los promotores de genes son secuencias de ADN ubicadas corriente arriba de las regiones codificantes de genes y contienen múltiples elementos que actúan en cis, que son sitios de unión específicos para proteínas involucradas en el inicio y regulación de la transcripción. En la mayoría de las unidades de transcripción, los promotores están ubicados junto al sitio de inicio de la transcripción, pero no se transcriben en sí mismos. Los promotores normalmente contienen un "promotor central", que es una región que se encuentra & # 876440 pb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción que contiene la caja TATA. TATA caja es el sitio de unión para el factor de inicio de la transcripción TFIID Subunidad TBP (proteína de unión a caja TATA).

Aguas arriba de la región promotora del núcleo se encuentran las regiones proximal y distal de los promotores. Las regiones proximales y distales del promotor contienen varias secuencias reguladoras como potenciadores, silenciadores, aislantes y elementos Cis que contribuyen a la regulación fina de la expresión génica a nivel transcripcional (Figura 1).

Figura 1: Diferentes elementos regulatorios y posiciones relativas

Durante la transcripción, los coactivadores y factores de transcripción se unen a motivos de ADN específicos e interactúan simultáneamente con la maquinaria transcripcional unida al promotor central. Esta compleja relación ADN / proteína conduce a la activación, mejora o supresión de la transcripción. Por tanto, la regulación de la transcripción depende de: Disponibilidad y actividad de los factores de transcripción. El tipo, número, posición y combinación de elementos reguladores presentes en y alrededor de la región promotora. La regulación de la expresión génica a nivel del promotor está controlada principalmente por los elementos que actúan en cis localizados corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción.

Elementos promotores eucariotas conservados
Caja CAAT: Una secuencia de consenso cercana a -80 pb desde el punto de inicio (+1). Desempeña un papel importante en la eficiencia del promotor, aumentando su fuerza. Parece funcionar en cualquier orientación. Esta caja se reemplaza en las plantas por una secuencia de consenso conocida como caja AGGA.
Caja TATA: Una secuencia que generalmente se encuentra alrededor de -25 pb aguas arriba del punto de inicio. La caja TATA tiende a estar rodeada de secuencias ricas en GC. La caja TATA une la ARN polimerasa II y una serie de factores de transcripción.
Caja GC: Una secuencia rica en nucleótidos guanidina (G) y citosina (C). Suele encontrarse en múltiples copias en la región promotora, normalmente cerca de la caja TATA.
Sitio CAP: Es una secuencia de inicio de la transcripción o un punto de inicio definido como +1, en el que realmente comienza el proceso de transcripción.


Secuencias de consenso

Tipos de promotores utilizados para regular la expresión génica
Hay diferentes tipos de promotores disponibles en biología molecular que se enumeran a continuación. Promotores que tienen sus diferentes funciones y papel en la regulación de genes.

Estos promotores dictan la expresión en casi todos los tejidos y son en gran medida, si no totalmente, independientes de los factores ambientales y de desarrollo. Dado que su expresión en general no está condicionada por factores endógenos. Los promotores constitutivos suelen estar activos en todas las especies e incluso en todos los reinos.
Promotores de patógenos vegetales: CAMV 35 S y promotor Opine Promotores monocotiledóneas: Promotor de ubiquitina vegetal (Ubi), Actina de arroz 1 (Acto 1) y maíz
deshidrogenasa 1 (Adh1)

Ventajas de los Promotores constitutivos:
Alto nivel de producción de proteínas utilizadas para elegir células o plantas transgénicas
Alto nivel de expresión de proteínas informadoras o marcadores puntuables, lo que permite una fácil detección y cuantificación
Producción de alto nivel de un factor de transcripción que forma parte de un sistema de transcripción regulador.
Fabricación de compuestos que requieren una actividad ubicua en la planta y
Producción de compuestos necesarios durante todas las etapas del desarrollo de la planta.

Promotores específicos de tejido o específicos de la etapa de desarrollo:
Promotores específicos de tejido: que operan en tejidos particulares y en ciertas etapas de desarrollo de una planta. Pueden ser producidos por factores endógenos y exógenos, por lo que también pueden clasificarse como inducibles. Para las plantas, los elementos promotores que se expresan o afectan la expresión de genes en el sistema vascular como tejidos fotosintéticos, Tubérculos, Raíces, Otros órganos vegetativos, Semillas, Órganos reproductivos se pueden encontrar en sistemas heterólogos. Los promotores específicos de tejido son de tres tipos. 1. Promotores de raíces, 2. Promotores de frutas, 3. Promotores de semillas.

Promotores inducibles:
Estos solo se expresan en presencia de factores / compuestos porque su expresión normalmente se limita a ciertos tejidos vegetales. También se pueden considerar como específicos de tejido En función de la naturaleza de los factores que desencadenan su expresión, se clasifican en dos grupos:

Regulado químicamente: Estos son los compuestos químicos, que normalmente no se encuentran naturalmente en las plantas, activan la actividad promotora. Varios de los tipos de promotores implican componentes quiméricos obtenidos de fuentes humanas, animales, fúngicas y bacterianas. Relacionados con patógenos: etileno, SA, tiamina, benzol

Regulado por esteroides: receptores de glucocorticoides (GR) y elemento de respuesta de glucocorticoides (GRE)

Metal regulado: Cobre, Zinc, Oro, Cobalto

Regulado por tetraciclina: resistencia a los antibióticos

Regulado físicamente: donde factores abióticos y externos como la luz, el calor y las lesiones mecánicas inducen la actividad promotora

Temperatura regulada: inducible por calor e inducible por frío
Regulado por luz: luz inducible y luz reprimible

Promotores sintéticos
Los promotores sintéticos son secuencias de ADN que no se encuentran en la naturaleza y que están diseñadas para regular la actividad de los genes, controlando la capacidad de un gen para producir su propia proteína codificada de forma única.

Referencias:
1. Potenza, C., Alemán, L. y Sengupta-Gopalan, C. 2004. Apuntando a la expresión transgénica en investigación, aplicaciones agrícolas y ambientales: promotores utilizados en la transformación de plantas. In Vitro Cellular & Developmental Biol. 40, págs. 1-22.

2. Peremarti, A. et al. 2010. Promotor de la diversidad en la transformación multigénica. Plant Mol. Biol., 73, págs. 363-378.


Acerca del autor / información adicional:
Becario de investigación de doctorado (biotecnología vegetal), interesado en estudios de ingeniería genética y biología molecular

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Introducción

Los lípidos, con sus propiedades hidrófilas e hidrófobas, proporcionan una potente caja de herramientas para la nanotecnología [1]. Pueden autoensamblarse en nanopelículas y otras nanoestructuras, incluidas micelas, micelas inversas y liposomas [1]. Los complejos de lípido-protamina-ADN (LPD) se han caracterizado por en vivo entrega de genes con construcciones de plásmidos informadores [23]. Nuestro laboratorio ha demostrado que la focalización celular y los péptidos específicos de la célula (péptidos homing) integrados en LPD pueden aumentar la eficiencia de la entrega de genes en células de mamíferos [45]. En 2014, demostramos por primera vez que la administración dirigida asistida por nanopartículas de genes específicos del ojo mejoró significativamente la visión de ratones ciegos. en vivo [6].

Una de las limitaciones de LPD es la especificidad celular [7]. Sin embargo, en nuestro estudio anterior, la entrega de genes mediada por LPD restauró con éxito la función visual en ratones que carecían de esta función, ya que el gen entregado solo se expresó en un tipo de célula de la retina [6]. Si el mismo gen se expresa en múltiples tipos de células, la entrega de genes mediada por LPD puede tener efectos fuera del objetivo. La retina está compuesta por siete tipos diferentes de células neurales. Por lo tanto, existe la necesidad de un suministro específico de células de nanopartículas de LPD.

Para demostrar la importancia y la naturaleza innovadora de LPD en la retina, primero mostramos que los promotores específicos de células permitían que las nanopartículas basadas en lípidos transmitieran genes a células específicas de la retina. en vivo. En el presente estudio, logramos especificidad de células del epitelio pigmentario de la retina con distrofia macular viteliforme (VMD2), especificidad de células bastón con rodopsina de ratón, especificidad de células cónicas con opsina roja / verde y especificidad de células ganglionares con promotores de antígenos de timocitos (Fig.1).

Entrega de genes específicos de células de la retina. Se construyó un liposoma protamina / lipoplex de ADN (LPD) integrado con un péptido de señal de localización nuclear (NLS) y un péptido transactivador de transcripción (TAT) para la entrega de genes a las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), bastones, conos y ganglios células de la retina que utilizan promotores específicos de células. Logramos especificidad de células RPE con distrofia macular viteliforme (VMD2, 583 pb), especificidad de células bastón con rodopsina de ratón (225 pb), especificidad de células cónicas con opsina roja / verde humana (2100 pb) y especificidad de células ganglionares con antígeno de timocitos (Thy1.2, 6500 pb) promotores.

(Haga clic en la imagen para ampliar).


Examen final de biología celular

B. posición de aminoácido 173 en la mayoría de las proteínas mitocondriales y de cloroplasto.

C. el N-terminal de la proteína precursora.

una. Hidrólisis de ATP por proteínas chaperonas en el citosol.

B. Hidrólisis de ATP por proteínas chaperonas en la matriz mitocondrial.

C. la fuerza motriz del protón a través de la membrana mitocondrial interna.

una. un receptor citosólico común.

B. un receptor de importación común y una maquinaria de translocación en la membrana peroxisomal.

C. un receptor común en el poro nuclear que cataliza la entrada al núcleo a través de secuencias dirigidas a los poros.

C. señales básicas de localización nuclear en proteínas de carga.

“Los peroxisomas son orgánulos interesantes con una sola membrana y poseen el talento de poder importar proteínas nativas. Pex5 es una de las proteínas que ayuda a guiar las proteínas hacia el peroxisoma. Luego asocia muchas otras proteínas Pex para que libere la proteína importada y salga del peroxisoma. El peroxisoma tiene un gran complemento de proteínas Pex que facilitan la importación e inserción de proteínas.

una. El ácido butírico se difunde en el liposoma 100 veces más rápido que el butanodiol.

B. Los dos se difunden en el liposoma a la misma velocidad.

C. El butanodiol se difunde en el liposoma 100 veces más rápido que el butanodiol.

una. Similar a la difusión simple, el transporte unipuerto es inespecífico.

B. El transporte unipuerto es más lento pero más específico que la simple difusión.

C. El transporte Uniport es mucho más rápido y específico que la simple difusión.

una. Bombas de superfamilia ABC y clase P

B. Bombas de superfamilia ABC y clase P

C. Bombas de clase F y bombas de clase P

una. la membrana plasmática activada por calmodulina Ca2 + ATPasa.

B. el retículo sarcoplásmico Ca2 + ATPasa.

C. la bomba de protones vacuolar de clase F.

una. Durante el transporte, el sitio de unión del ligando se expone alternativamente al lado exoplasmático y al citoplásmico de la membrana.

B. Durante el transporte, se fosforila un residuo de aspart conservado.

C. Esta clase de bombas transporta solo iones H +.

B. Están presentes en las membranas de las vacuolas vegetales.

c Sirven para disminuir el pH dentro de un lisosoma.

una. evolución a partir de proteínas parentales distintas y diferentes.

B. evolución divergente de un solo tipo de proteína de canal.

C. baja energía de activación para el paso selectivo del ion deshidratado.

una. Aumenta el Na + citosólico y, por tanto, disminuye la exportación de Ca2 +.

B. Aumenta el K + citosólico y, por tanto, disminuye la exportación de Ca2 +.

C. Disminuye el Na + citosólico y, por lo tanto, disminuye la exportación de Ca2 +.

una. aumento de la acumulación de Na +

B. disminución de la acumulación de Na +

una. acoplando el transporte de glucosa al movimiento de protones.

B. acoplando el transporte de glucosa al movimiento de Na +.

C. acoplando el transporte de glucosa al movimiento de Ca2 +.

una. exportar & cotizar excedente & quot citosólico OH- como HCO3-.

C. preservando la electroneutralidad al acompañar el movimiento de cada ion Cl- en la luz del estómago por un K +.

una. un gradiente de voltaje a través de la membrana externa.

B. un gradiente de voltaje a través de la membrana interna.

C. un gradiente de pH a través de la membrana externa.

una. el complejo F0 de la ATP sintasa.

B. el complejo F1 de ATP sintasa.

C. una proteína del canal de protones.

una. expresan constitutivamente el represor lac.

B. bloquear la unión de la ARN polimerasa al promotor.

C. expresan -galactosidasa constitutivamente.

una. PhoB tiene actividad quinasa.

B. PhoB es una proteína citosólica.

C. PhoB fosforilado es un activador transcripcional inactivo.

una. La unión del represor lac impide que la ARN polimerasa interactúe con el ADN en el sitio de inicio.

B. La unión del represor lac induce una ADNasa que escinde el ADN en el sitio de inicio de la transcripción.

C. La unión del represor lac provoca un cambio conformacional en la ARN polimerasa.

B. incubación con trifosfato de ribonucleósido marcado con 32P

C. Exposición de células a un precursor de ARN marcado.

una. El CTD está presente en la ARN polimerasa I, II y III.

B. El CTD puede fosforilarse.

C. El CTD es fundamental para la viabilidad.

una. sirve como secuencia promotora de genes transcritos por la ARN polimerasa III.

B. se encuentra aproximadamente a 100 pares de bases corriente arriba del sitio de inicio de los ARNm.

C. está presente en todos los genes eucariotas.

una. TFIID, TFIIB, Pol II, TFIIH

B. PolII, TFIID, TFIIB, TFIIH

C. TFIIB, PolII, TFIIH, TFIID

una. vinculante a la caja TATA

B. desenrollando el dúplex de ADN

C. catalizar la síntesis de ARN

una. es un elemento de ADN que estimula la transcripción de promotores eucariotas.

B. se une a la ARN polimerasa y estimula la transcripción.

C. actúa como un sitio de unión para la ARN polimerasa.

una. un tramo de cinco residuos de leucina seguidos.

B. un residuo de leucina en cada séptima posición.

C. un residuo de leucina complejado con un ion zinc.

una. La heterocromatina se tiñe de manera más oscura con tintes de ADN que la eucromatina.

B. La heterocromatina contiene más ADN altamente condensado que la eucromatina.

C. La heterocromatina está asociada con genes inactivos.

una. puede formar un puente molecular entre los activadores de la transcripción y la maquinaria de replicación del ADN.

B. puede funcionar para mantener un promotor en un estado hipoacetilado.

C. tiene actividad histona acetilasa.

una. siempre se encuentran dentro de la eucromatina.

B. no se encuentran dentro de los nucleosomas.

una. región variable, dominio de unión a ADN, dominio de unión a ligando

B. dominio de acetilasa, dominio de unión a ADN, dominio de unión a ligando

C. región variable, dominio acetilasa, dominio de unión a ligando

una. No se requiere hidrólisis de ATP para la iniciación.

B. Pol III es responsable de sintetizar ARNt y ARNr 5S.

C. Los elementos promotores de los genes de ARNt se encuentran completamente dentro de la secuencia transcrita.

una. No se requiere hidrólisis de ATP para la iniciación.

B. Pol III es responsable de sintetizar ARNt y ARNr 5S.

C. Los elementos promotores de los genes de ARNt se encuentran completamente dentro de la secuencia transcrita.

una. el retículo endoplásmico rugoso

una. Proteínas transportadoras de Na + y OH− en la membrana lisosomal.

B. Proteínas transportadoras de H + y Cl− en la membrana plasmática.

C. enzimas productoras de ácido en la luz lisosomal.

B. retículo endoplasmático rugoso.

una. El retículo endoplásmico

una. microscopio de transmisión por electrones

B. microscopía electrónica de barrido

una. tinción de muestras para microscopía óptica.

B. muestras de capa para microscopía electrónica de sombra de metales.

C. muestras de tinción para microscopía electrónica de transmisión.

una. ubicación de proteínas específicas.

B. concentración de iones H + en regiones específicas de la célula.

C. la cantidad de ARN en una célula.

una. microcopia de fluorescencia de reflexión interna total

B. microscopía de localización fotoactivada

C. microscopía de inmunofluorescencia indirecta

una. el retículo endoplásmico

una. una máquina clasificadora de células activadas por fluorescencia.

B. anticuerpos unidos a portadores bacterianos y centrifugación a baja velocidad.

una. una célula precursora que da lugar a gametos.

B. una célula inmune inmortal que no puede producir.

C. una célula madre autorrenovable.

una. un anticuerpo monoclonal de catalasa y microscopía electrónica de transmisión

B. platino u oro y microscopía electrónica de barrido

B. capacidad de diferenciarse.

una. contienen muchos residuos de aminoácidos hidrófobos.

B. contienen dominios que atraviesan la membrana.

C. tienen anclajes de lípidos o ácidos grasos unidos covalentemente.

una. Mecanismos dependientes de Golgi.

B. Poblaciones de vesículas caracterizadas de forma incompleta.

C. contacto directo entre membranas y, hasta cierto punto, pequeñas proteínas solubles de transferencia de lípidos.

tipo II en ER que ancla la cadena en la membrana y obliga al extremo N a girar extracelularmente, y al C a entrar en el citosol

entre dos celdas hay uniones de celdas. Necesita uniones estrechas.

transporte transepitelial de glucosa = glucosa que ingresa a la célula desde el intestino a través del simportador glucosa / 2 Na +

la glucosa se difunde de la célula a la sangre a través del transporte pasivo GLUT2.

¡PERO! el Na + tiene que salir. por lo que lo hace a través de una ATPasa Na + / K +. (K + podría salir a través de un canal de reposo)

El H20 se divide en H + y OH- para donar el H + secretado. por lo que el OH- se acumula. que se envía a la sangre a través del antiportador HCO3 con Cl- (mantiene la carga de las células).

cabeza de fosfato eliminada. colina añadida en la cara citoplásmica.

El GPCR se acopla a una proteína Gai, que inhibe su proteína efectora, a través de la acción de la subunidad GBy, que es la subunidad responsable de interactuar con la proteína efectora, un canal de K +.

Ocurre lo siguiente:
-GPCR está unido por acetilcolina,
= Proteína G para interactuar con ella.
El GDP se disocia de la subunidad Gai y es reemplazado por GTP, esto permite que la subunidad Gai se disocie de la subunidad GPCR y GBy.

La rodopsina contiene una proteína llamada opsina, que posee siete hélices alfa transmembrana unidas además a un pigmento que absorbe la luz, la retina.

La rodopsina no es un GPCR típico porque no depende de un ligando. Requiere la isomerización inducida por fotones de su pigmento absorbente de luz (desde 11-cis-retinal hasta completamente trans - también denominada meta-rodopsina II, o rodopsina quotactivada, indicada como "R *").

Esto provoca un cambio conformacional en las hélices de la membrana GPCR, lo que permite la unión posterior de la subunidad Gat (el & quott & quot significa transducina, que es el nombre de la proteína G acoplada al receptor de rodopsina) y permite el intercambio de GDP por GTP.

Entonces, Gat-GTP puede liberarse e interactuar con su proteína efectora, cGMP fosfodiesterasa (PDE), que hidroliza cGMP a 5'-GMP.

sintetiza monofosfato de adenosina cíclico (cAMP).

cAMP es un mensajero secundario. Una vez sintetizado, el cAMP puede transducir una variedad de señales fisiológicas.

Cuando cAMP interactúa con la proteína quinasa A (PKA), que posee dos sitios de unión a cAMP: CNB-A y CNB-B. Cuando el AMPc se une a ambos sitios de forma cooperativa, y se activa la actividad quinasa de la PKA.


Materiales y métodos

Cultivo de células

Los fibroblastos de riñón humano HEK-293T, las células tumorales colorrectales humanas HCT116 + / + y HCT116 - / -, junto con los fibroblastos de pulmón embrionario humano WI38-T / Neo y WI38-T3 fueron amablemente proporcionados por el profesor Varda Rotter (WIS). Se cultivaron células HEK-293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero de ternero fetal (FCS) al 10%, L -glutamina 2 mM y antibióticos. Las células WI-38 se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con FCS al 10%, piruvato de sodio 1 mM, L -glutamina 2 mM y antibióticos. Se cultivaron células HCT116 en medio de McCoy complementado con FCS al 10%, L -glutamina 2 mM y antibióticos.

Reactivos

Se disolvió BVDU (Sigma B9647) en DDW hasta soluciones de reserva de 1 µg / µl, y se utilizó a una concentración final de 10 µg / ml. GCV: (Roche, adquirido como el fármaco Cymevene) se disolvió en DDW a reservas de 50 μg / μl, y se utilizó a una concentración final de 100 μg / ml. Solución de tinción de violeta cristal (CV): la solución de tinción consistía en 1 g de polvo CV (Sigma C3886), 25 ml de EtOH al 99%, 225 ml de DDW.

Entrega de ADN

Las células se sembraron en placas de seis pocillos 48 h antes de la transfección, a densidades de células iniciales de (1) 104 células WI38 / pocillo, (2) 2,5x105 células HCT116 / pocillo y (3) 2,5x105 células HEK- Células 293T / pocillo para ensayos de luciferasa, o (3) 104 células WI38 / pocillo, y (4) 5x103 células 293T / pocillo para ensayos de viabilidad. Las transfecciones se realizaron con el reactivo de transfección FuGENE-HD (Roche, 04-709-691-001) según el protocolo del fabricante, con relaciones de ADN / reactivo de 2: 7 para el ensayo de luciferasa y 1,7: 6 para el ensayo de viabilidad celular. diluido en 100 μl de medio de suero reducido (Opti-MEM, GIBCO 31985-047).

Plásmidos

Todos los mapas de plásmidos se detallan en la sección de información complementaria.

Plásmido pPromotor-1

La proteína de fusión DocS / VP16-AD está regulada por un promotor humano de interés ("Promotor"). El plásmido se compone de tres casetes modulares: (1) El promotor, que regula la proteína de fusión (2) el gen DocS y (3) la secuencia PEST opcional. La secuencia PEST opcional se encuentra aguas abajo del gen DocS. Consiste en los aminoácidos 422–461 del gen de la ornitina descarboxilasa del ratón, lo que reduce significativamente la vida útil de las proteínas fusionadas con él (Evan y Littlewood, 1998). La traducción del péptido PEST requiere la clonación del gen de fusión DocS / AD en marco a la secuencia PEST. Para excluir la secuencia PEST de la proteína de fusión, la secuencia DocS se clona con un codón STOP cadena abajo. Los mismos plásmidos, en los que el DocS de tipo salvaje se reemplazó con DocS15 o DocS102, se utilizaron para experimentos con DocS mutante.

Plásmido pPromotor-2

La proteína de fusión Coh2 / GAL4-BD está regulada por un duplicado de un promotor humano de interés ("Promotor"). De manera similar al plásmido 1, el plásmido 2 también tiene tres casetes modulares: (1) el promotor, que regula la proteína de fusión (2) el gen Coh2 y (3) la secuencia PEST opcional.

PG5-luc

La expresión de luciferasa de luciérnaga está regulada por el promotor de levadura GAL4. El gen de la luciferasa está flanqueado por sitios de restricción únicos, que permiten un reemplazo simple del gen.

PG5-TK1

Este plásmido es idéntico a pG5-luc, excepto con TK1 en lugar del gen de luciferasa.

Plásmido pPromoter-5

La luciferasa de luciérnaga está regulada directamente por un promotor humano de interés ("Promotor"), que se utilizó para calibrar los niveles de entrada de cada promotor humano. El plásmido tiene tres casetes modulares: (1) la región promotora, (2) el gen de la luciferasa y (3) una secuencia PEST opcional.

Plásmido pPromoter-6

  • Los plásmidos pPromoter-1 + pPromoter-2 (plásmidos de entrada) y pG5-luc (plásmido del módulo de salida) comprenden el DPI con salida de luciferasa.
  • Los plásmidos pPromoter-1 + pPromoter-2 (plásmidos de entrada) y pG5-TK1 (plásmido de salida) comprenden el DPI con salida de TK1.

Ensayos de luciferasa

Las mezclas de plásmidos, utilizadas en un total de 2 μg de ADN / muestra, se detallan en las Tablas complementarias S1 y S2. El plásmido pGEM-t-Easy circular vacío (Promega A3600) se utilizó como ADN no específico cuando fue necesario, para completar el ADN total a 2 µg de ADN / muestra. Las células se recogieron, 48 h después de la transfección, se centrifugaron y se lavaron con 1 ml de PBS en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. El sedimento lavado se lisó con 50 μl de tampón de lisis (Promega E194A), y los niveles de actividad luciferasa de luciérnaga y renilla se midieron en una alícuota de 50 μl con el kit Promega Dual-Luciferase® Reporter Assay (Promega E1980), en un Victor 1420 multi- lector de etiquetas (Perkin-Elmer), según protocolo del fabricante. La eficiencia de transfección en cada muestra se estimó de acuerdo con los niveles de actividad de luciferasa de renilla, que se expresó a partir del plásmido pLXSN-Renilla, regulado por el promotor LXSN viral estable.

Ensayos de viabilidad celular

Antes de la siembra en placa, se recubrieron placas de seis pocillos con hidrobromuro de poli-L-lisina (Sigma P1274) para mejorar la adhesión celular. Las mezclas de plásmidos, utilizadas en un total de 1,7 μg de ADN / muestra, se detallan en las Tablas complementarias S3 y S4. El plásmido pGEM-t-Easy vacío (Promega A3600) se utilizó como ADN no específico cuando fue necesario, para completar el contenido total de ADN a 1,7 μg de ADN / muestra. Las células se cultivaron 48 h después de la transfección en ausencia de BVDU / GCV, y se midió la expresión de GFP total (generada por el plásmido pCMV-GFP, en el que la expresión de GFP está regulada por el potente promotor de CMV viral) en cada pocillo a una resolución de 200 μM en el escáner de fluorescencia Typhoon 9400 (Amersham). Esta medición inicial de células no tratadas se usó para estimar la eficiencia de transfección general para cada muestra (Figura complementaria S2). En este punto, las células se observaron bajo un microscopio de fluorescencia para determinar el porcentaje de células positivas para GFP en el cultivo, para estimar el porcentaje de células transfectadas. Poco después de que se realizó la medición de GFP, las células se incubaron en presencia de BVDU 10 μg / ml (para HEK-293T) o GCV 100 μg / ml (WI38-T / Neo y WI38-T3) para activar la citotoxicidad de TK1. Tinción CV: las células se incubaron durante 10 días en presencia de BVDU / GCV. Después del tratamiento, las células se lavaron con 2 ml de PBS, se incubaron durante 15 min con 1 ml de solución CV y ​​se lavaron 2 veces con 2 ml de DDW. Las placas se secaron y escanearon con un escáner de imágenes Canon 5200 para el análisis cualitativo de la densidad celular. Para cuantificar las densidades celulares, la tinción CV inmovilizada en cada muestra se disolvió en 1 ml de ácido acético al 10% / pocillo. A continuación, se transfirieron alícuotas de 100 μl a placas de 96 pocillos y se midieron a OD590 en el lector de microplacas multimodo Synergy ™ HT. Normalización de datos: para comparar el efecto de la expresión del integrador sobre el crecimiento celular entre las líneas celulares, los datos tuvieron que ser corregidos por dos factores importantes que afectan la densidad celular final: El efecto citotóxico del proceso de transfección, que varía entre las líneas celulares y el diferentes tasas de proliferación de las líneas celulares. Por lo tanto, para cada línea celular, la densidad celular (CVS) se normalizó de acuerdo con la densidad final de una muestra de control negativo (CVCAROLINA DEL NORTE), en el que la salida del integrador de expresión fue el gen de la luciferasa en lugar de TK1, y que se definió como 0% de muerte celular. Los datos se muestran como porcentaje de muerte celular, que se calculó como: donde CVS es el OD590 absorbancia del CV disuelto en cada muestra y CVCAROLINA DEL NORTE es el OD590 absorbancia del CV disuelto de la muestra de control negativo.


Materiales y métodos

Cepas y plásmidos

La cepa que alberga la biblioteca de promotores sintéticos se derivó de la cepa haploide BY4742 (ESTERAα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) como se describe en Brachmann et al (1998). La biblioteca de promotores se construyó en el plásmido pJG102 (Gertz et al, 2009). Las fusiones TF-GFP se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se describen en Ghaemmaghami et al (2003) y Huh et al (2003). Para medir la actividad de los sitios Adr1 y Rgt1, usamos cepas de deleción BY4742 y MATα derivadas de BY4742 descritas en Brachmann et al (1998). Para ver la actividad de los sitios Mig1 / Mig2, usamos BY4742 y Δmig1Δmig2 cepa YM6682. YM6682, que fue proporcionado por Mark Johnston, Universidad de Washington, fue creado por apareamiento Δmig1 y Δmig2 cepas haploides, esporulándolas y seleccionando esporas de doble deleción.

Construcción de bibliotecas

Para crear los bloques de construcción que componen los promotores sintéticos, utilizamos el procedimiento y los pares de oligonucleótidos descritos en Gertz et al (2009). El sitio de Gcr1 que usamos fue:

Análisis de expresión

Todos los cultivos se hicieron crecer con agitación a 30 ° C. Los cultivos de cepas promotoras sintéticas (incluidos los experimentos de deleción) se hicieron crecer hasta la fase logarítmica en placas de 96 pocillos de 2 ml en 500 ul de medio sintético completo que carecía de uracilo con glucosa al 2%. Los cultivos de "glucosa" se fijaron en este punto. Para los cultivos de "diamida", se añadió diamida a una concentración final de 1,25 mM y se dejó crecer durante 7 h. Los cultivos de "inanición de aminoácidos" se centrifugaron primero a 3000 g durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron 500 ul de medio mínimo que contenía glucosa al 2% y complementado con histidina, leucina, lisina y triptófano, y los cultivos se dejaron crecer durante 6 h. Los cultivos de glicerol se centrifugaron primero a 3000 g durante 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron 500 ul de medio sintético completo que carecía de uracilo con glicerol al 2% y los cultivos se dejaron crecer durante 16 h. Las fusiones TF-GFP se cultivaron de la misma forma descrita anteriormente, excepto que se añadió uracilo a cada medio.

Each culture was fixed at the corresponding time point by adding a 4% paraformaldehyde solution (4% paraformaldehyde, 100 mM sucrose) to a final concentration of 1% and incubating at room temperature for 15 min. The cells were then spun down at 3000 g for 5 min. The supernatant was removed, and the cells were resuspended in 250 ul of phosphate-buffer saline and stored at 4°C.

The fluorescence intensities and electronic volumes of 25 000 events from each well were measured on a Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC with a multiplate loader. For each well, the mean of fluorescence divided by electronic volume for 25 000 events was taken as the expression value for that well. On each plate, the expression value of the four no insert controls were averaged to calculate a plate effect to account for changes in laser intensity or growth differences. Each expression value on the plate was then divided by the plate effect.

Sequencing

Synthetic promoters were sequenced and analyzed as described previously ( Gertz et al, 2009 ).

Thermodynamic model

All calculations were performed using the Matlab package from The Mathworks, Inc. (Natick, MA). To model gene expression, we implemented a thermodynamic model of polymerase occupancy that was proposed by Shea and Ackers (1985 ). The model and implementation was described previously in Gertz et al (2009). In brief, the parameters that comprise the model are ϖ's that describe the changes in free energies from the binding of two proteins (TFs and/or RNAP) and q's for each protein that are confounded parameters. los q parameters represent the natural log of 1/KD for the protein–DNA interaction plus the natural log of the active (meaning able to bind DNA) protein concentration. With these parameters, Boltzmann weights for each possible state of the promoter are calculated. Boltzmann weights are calculated by taking the sum of the q values for all DNA–protein interactions and ϖ values for all protein–protein interactions occurring in a particular state and exponentiating the negation of that sum. For instance, in a state where a TF and RNAP are bound to a promoter, the Boltzmann weight is equal to the exponentiation of −(qRNAP+qTF+ϖRNAP−TF). The probability of RNAP binding is then determined by dividing the sum of Boltzmann weights for the states with RNAP bound by the sum of Boltzmann weights for all states.

Different expression levels in different environments are modeled by changing the active TF concentrations and therefore the q valores. This is because changes in free energies (ϖ y KD) do not depend on environment. To fit expression levels, q values are allowed to change with the environments however, the q values in the reference environment (e.g., glycerol for gly- L ) are fixed at a neutral value of zero. As we are only measuring expression levels, q y ϖ values are dependent on each other. Por lo tanto, q values can only describe relative changes in active TF concentrations.

To model competition between TFs for the same site, we allow the site to have three states: unbound, bound by the first TF, or bound by the second TF compared with two states: bound or unbound by the TF. Therefore, the only difference is that there are more states where Boltzmann weights need to be calculated. Once the Boltzmann weights are calculated, the weights are partitioned in the same way as described previously ( Gertz et al, 2009 ).

Parameter fitting

Parameters were fit for the thermodynamic models as described previously ( Gertz et al, 2009). When fitting the models with competition, the initial guess for the parameter values was the final parameter fit for the model for the same library without competition and all zeros for parameters pertaining to the competing TF.

Cross-validation was performed by first partitioning the promoters randomly into 20% blocks. We removed one block at a time and fit parameters on the remaining 80%. The accuracy of the model was then measured on the block that was left out. This was repeated for all five blocks, and the results were combined to calculate the overall R 2 of the cross-validation.


15.2 Transcripción procariota

Al final de esta sección, podrá hacer lo siguiente:

  • Enumere los diferentes pasos de la transcripción procariota
  • Discutir el papel de los promotores en la transcripción procariota.
  • Describir cómo y cuándo finaliza la transcripción.

Los procariotas, que incluyen bacterias y arqueas, son en su mayoría organismos unicelulares que, por definición, carecen de núcleos unidos a la membrana y otros orgánulos. Un cromosoma bacteriano es un círculo cerrado que, a diferencia de los cromosomas eucariotas, no está organizado alrededor de proteínas histonas. La región central de la célula en la que reside el ADN procariótico se denomina región nucleoide. Además, los procariotas suelen tener abundantes plásmidos, que son moléculas de ADN circulares más cortas que pueden contener solo uno o unos pocos genes. Los plásmidos se pueden transferir independientemente del cromosoma bacteriano durante la división celular y, a menudo, portan rasgos como los relacionados con la resistencia a los antibióticos.

La transcripción en procariotas (y en eucariotas) requiere que la doble hélice de ADN se desenrolle parcialmente en la región de síntesis de ARNm. La región de desenrollado se llama burbuja de transcripción. La transcripción siempre procede de la misma hebra de ADN para cada gen, que se denomina hebra plantilla. El producto de ARNm es complementario a la hebra molde y es casi idéntico a la otra hebra de ADN, denominada hebra sin plantilla o hebra codificante. The only nucleotide difference is that in mRNA, all of the T nucleotides are replaced with U nucleotides (Figure 15.7). En una doble hélice de ARN, A puede unirse a U a través de dos enlaces de hidrógeno, al igual que en el apareamiento A – T en una doble hélice de ADN.

El par de nucleótidos en la doble hélice de ADN que corresponde al sitio desde el cual se transcribe el primer nucleótido de ARNm 5 'se denomina sitio +1, o sitio de iniciación. Los nucleótidos que preceden al sitio de inicio se indican con un "-" y se designan nucleótidos aguas arriba. Por el contrario, los nucleótidos que siguen al sitio de inicio se indican con una numeración "+" y se denominan nucleótidos corriente abajo.

Inicio de la transcripción en procariotas

Los procariotas no tienen núcleos encerrados en membranas. Por lo tanto, los procesos de transcripción, traducción y degradación del ARNm pueden ocurrir todos simultáneamente. The intracellular level of a bacterial protein can quickly be amplified by multiple transcription and translation events that occur concurrently on the same DNA template. Prokaryotic genomes are very compact, and prokaryotic transcripts often cover more than one gene or cistron (a coding sequence for a single protein). Polycistronic mRNAs are then translated to produce more than one kind of protein.

Nuestra discusión aquí ejemplificará la transcripción al describir este proceso en Escherichia coli, a well-studied eubacterial species. Aunque existen algunas diferencias entre la transcripción en E. coli y transcripción en arqueas, una comprensión de E. coli la transcripción se puede aplicar a prácticamente todas las especies bacterianas.

ARN polimerasa procariota

Los procariotas usan la misma ARN polimerasa para transcribir todos sus genes. En E. coli, la polimerasa está compuesta por cinco subunidades polipeptídicas, dos de las cuales son idénticas. Cuatro de estas subunidades, denotadas α, α, β, y β', comprise the polymerase core enzyme . Estas subunidades se ensamblan cada vez que se transcribe un gen y se desensamblan una vez que se completa la transcripción. Cada subunidad tiene un papel único que los dos α-subunidades son necesarias para ensamblar la polimerasa en el ADN el β-subunit binds to the ribonucleoside triphosphate that will become part of the nascent mRNA molecule and the β' subunit binds the DNA template strand. La quinta subunidad, σ, está involucrado solo en el inicio de la transcripción. Confiere especificidad transcripcional tal que la polimerasa comienza a sintetizar ARNm a partir de un sitio de iniciación apropiado. Sin σ, la enzima central se transcribiría desde sitios aleatorios y produciría moléculas de ARNm que especificaban un galimatías de proteínas. La polimerasa compuesta por las cinco subunidades se llama holoenzima.

Promotores procarióticos

A promoter is a DNA sequence onto which the transcription machinery, including RNA polymerase, binds and initiates transcription. En la mayoría de los casos, los promotores existen corriente arriba de los genes que regulan. La secuencia específica de un promotor es muy importante porque determina si el gen correspondiente se transcribe todo el tiempo, algunas veces o con poca frecuencia. Although promoters vary among prokaryotic genomes, a few elements are evolutionarily conserved in many species. At the -10 and -35 regions upstream of the initiation site, there are two promoter consensus sequences, or regions that are similar across all promoters and across various bacterial species (Figure 15.8). The -10 sequence, called the -10 region, has the consensus sequence TATAAT. The -35 sequence has the consensus sequence TTGACA. These consensus sequences are recognized and bound by σ. Una vez que se realiza esta interacción, las subunidades de la enzima central se unen al sitio. La región -10 rica en A-T facilita el desenrollamiento de la plantilla de ADN y se forman varios enlaces fosfodiéster. La fase de inicio de la transcripción termina con la producción de transcripciones abortivas, que son polímeros de aproximadamente 10 nucleótidos que se producen y liberan.

Enlace al aprendizaje

Vea esta animación de MolecularMovies para ver el proceso de transcripción tal como ocurre en la célula.

Elongation and Termination in Prokaryotes

The transcription elongation phase begins with the release of the σ subunidad de la polimerasa. La disociación de σ permite que la enzima central avance a lo largo de la plantilla de ADN, sintetizando ARNm en la dirección 5 'a 3' a una velocidad de aproximadamente 40 nucleótidos por segundo. A medida que avanza el alargamiento, el ADN se desenrolla continuamente por delante de la enzima central y se rebobina detrás de ella. El emparejamiento de bases entre el ADN y el ARN no es lo suficientemente estable como para mantener la estabilidad de los componentes de síntesis del ARNm. En cambio, la ARN polimerasa actúa como un enlazador estable entre la plantilla de ADN y las cadenas de ARN nacientes para garantizar que el alargamiento no se interrumpa prematuramente.

Prokaryotic Termination Signals

Once a gene is transcribed, the prokaryotic polymerase needs to be instructed to dissociate from the DNA template and liberate the newly made mRNA. Dependiendo del gen que se transcribe, existen dos tipos de señales de terminación. Uno está basado en proteínas y el otro está basado en ARN. La terminación dependiente de Rho está controlada por la proteína rho, que sigue detrás de la polimerasa en la cadena de ARNm en crecimiento. Cerca del final del gen, la polimerasa encuentra una serie de nucleótidos G en la plantilla de ADN y se detiene. Como resultado, la proteína rho choca con la polimerasa. La interacción con rho libera el ARNm de la burbuja de transcripción.

La terminación independiente de Rho está controlada por secuencias específicas en la hebra molde de ADN. A medida que la polimerasa se acerca al final del gen que se transcribe, encuentra una región rica en nucleótidos C – G. El ARNm se pliega sobre sí mismo y los nucleótidos C-G complementarios se unen. El resultado es una horquilla estable que hace que la polimerasa se detenga tan pronto como comienza a transcribir una región rica en nucleótidos A – T. La región U-A complementaria del transcrito de ARNm forma solo una interacción débil con el ADN molde. Esto, junto con la polimerasa estancada, induce suficiente inestabilidad para que la enzima central se desprenda y libere la nueva transcripción de ARNm.

Tras la terminación, se completa el proceso de transcripción. By the time termination occurs, the prokaryotic transcript would already have been used to begin synthesis of numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently. The unification of transcription, translation, and even mRNA degradation is possible because all of these processes occur in the same 5' to 3' direction, and because there is no membranous compartmentalization in the prokaryotic cell (Figure 15.9). In contrast, the presence of a nucleus in eukaryotic cells precludes simultaneous transcription and translation.

Enlace al aprendizaje

Visit this BioStudio animation to see the process of prokaryotic transcription.


INTRODUCCIÓN

Transcription of eukaryotic genes is a highly complex and ordered process governed by a combination of trans-factors binding to distal cis-DNA sequence elements and general transcription factors (GTFs) assembling at the proximal core promoter. The stepwise assembly of a transcription preinitiation complex consisting of several GTFs, a mediator, and Pol II occurs stochastically. Once a transcription preinitiation complex (PIC) is fully assembled, multiple transcription reinitiation events lead to the rapid escape of a series of RNA Pol II polymerases, resulting in bursts of transcription (Blake et al., 2003). The number of transcripts generated during a burst varies according to its duration (Golding et al., 2005). The stochastic nature of transcription results in a heterogeneity of expression among cells in a population (Singh et al., 2010). To characterize this quantal behavior of transcription in eukaryotic cells, several single-cell techniques have been developed, including single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH), FRET, and live cell imaging (Chen and Larson, 2016). These techniques have shown that bursting dynamics is highly varied among genes, with burst sizes ranging from two transcripts to hundreds, and periods of inactivity between bursts ranging from minutes to hours (Suter et al., 2011a, b Dar et al., 2012 Chen and Larson, 2016). Both burst size and frequency can vary among genes and within a single gene under different conditions, leading to modulated gene expression (Larson et al., 2013 Bartman et al., 2016 Fukaya et al., 2016).

Although the role of upstream enhancer elements in establishing bursting dynamics has been examined, the role of core promoter elements, with the exception of the TATAA box (Blake et al., 2006 Hornung et al., 2012 Ravarani et al., 2016 Tantale et al., 2016), has not. The core promoter encompasses the transcription start site and is defined as the 50–100 base pair region within which transcription initiates (Sandelin et al., 2007 Roy and Singer, 2015). Canonical core promoter elements, such as the TATAA box and Initiator (Inr), are commonly found in promoters, although many promoters have no identifiable core promoter elements. The composition of core promoters (Larson et al., 2013) is loosely correlated with the type of genes they regulate: tissue-specific genes are enriched for TATAA box and Inr elements, whereas promoters of housekeeping genes often contain Inr, TCT, DPE, DCE, or other motifs (Zabidi et al., 2015).

Recent evidence demonstrates that the core promoter is not, as previously thought, a passive platform upon which regulation is imposed by mediator and transcription factors. Rather, it actively contributes to the regulation of gene expression. In the case of major histocompatibility complex (MHC) class I genes, individual core promoter elements contribute to the overall regulation of transcription (Barbash et al., 2013). MHC class I genes encode cell surface receptors that present intracellularly-derived peptides, eliciting cellular immunity against intracellular pathogens. Consistent with this role of providing immune surveillance, MHC class I genes are ubiquitously expressed, although their levels of RNA vary dramatically among tissues. Expression is constitutively highest in lymphoid cells, such as B-cells, and lower to varying degrees in other tissues. Expression is dynamically modulated by hormones and cytokines, which decrease and increase levels, respectively. Thus MHC class I transcription is subject to both intracellular, tissue-specific and extracellular, hormone/cytokine regulatory pathways that converge on, and are integrated at, the core promoter.

These complex patterns of MHC class I gene expression make it an ideal model system in which to study the molecular mechanisms of transcriptional regulation. We have shown previously that expression of a transgene derived from the porcine MHC class I gene, PD1, is indistinguishable both from its endogenous pattern of expression and from the endogenous mouse MHC class I genes (Frels et al., 1985). The PD1 transgene contains all of the regulatory elements required for normal tissue-specific and hormone/cytokine-mediated patterns of expression (Ehrlich et al., 1989). The core promoter of the PD1 gene extends from –68 to +14 base pairs and consists of 1) a TATAA-like element, 2) an Inr, 3) a CCAAT box and 4) an Sp1 binding site (Sp1BS) and actively contributes to the regulation of transcription of the PD1 transgene. Surprisingly, mutation of any one of these elements results in increased transcription (without altering transcription start site usage), defining these as negative regulators of transcription that differentially regulate either tissue specific expression, interferon response, or both (Barbash et al., 2013). Thus the individual core promoter elements actively participate in the integration of both tissue-specific and hormonal upstream regulatory signals to achieve appropriate levels of transcription (Barbash et al., 2013).

The finding that the individual core promoter elements have distinct effects on the regulation of MHC class I transcription led to the question of their role(s) in transcriptional bursting. Here we report that transcription of the MHC class I gene PD1 occurs in bursts and that the individual core promoter elements contribute differentially to establishing the overall bursting pattern in a context-dependent manner. In primary splenic B-cells during basal transcription, burst size is modulated primarily by the Sp1BS, while the Inr establishes burst frequency. The TATAA-like element governs both burst size and frequency. Their individual contributions change in response to transcriptional activation by the cytokine γ-interferon. This plasticity in regulating the bursting of MHC class I transcription enables rapid fine-tuning of transcription levels to respond to intrinsic and extrinsic signaling events, such as viral infections.


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Material complementario electrónico

Figure S1: Schematic representation of

Additional file 1: NDUFV1 upstream region. 3665 bp-long NUS sequence contains highly conserved 91 bp-long genomic fragment located exactly upstream NDUFV1 transcriptional start site. At the 5' terminus of NUS there is an insert of HERV-K (HML-2) solitary LTR. (TIFF 78 KB)

12896_2010_526_MOESM2_ESM.TIFF

Additional file 2: Figure S2: Comparison of herpes virus thymidine kinase promoter - driven renillaluciferase activities in cell lines Tera-1, NGP127, HepG2, A549 and HEK293. The column height reflects the mean value of detected luciferase activity from at least six transfection experiments, and error bars indicate the value of a standard error. Each experiment was made at least in quadruplicate. (TIFF 102 KB)

12896_2010_526_MOESM3_ESM.TIFF

Additional file 3: Figure S3: Comparison of mNUS and CMV promoter activities in cell lines Tera-1 and HEK293. The column height reflects the mean value of relative luciferase activity from at least four transfections, and error bars indicate the value of a standard error. (TIFF 126 KB)

12896_2010_526_MOESM4_ESM.TIFF

Additional file 4: Figure S4: Schematic map of the putative transcriptional factor binding sites within the 3665 bp-long entire NUS region. HERV-K(HML-2) LTR sequence and 91 bp-long deletion are shown by magenta boxes. Signs above/below represent putative transcription factor binding sites identified in the sense/antisense orientations, respectively. Large red circle represent putative SRY/SOX3 binding site perfectly matching the consensus sequence (ACAAAACA), small circles - sites with single nucleotide mismatches. The detailed data on transcriptional factor binding sites is presented on the additional table 1. (TIFF 53 KB)


Ver el vídeo: Jacque Fresco - Depression, Self Image - Sept. 5, 2011 12 (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Cliftun

    Algo asi no aparece

  2. Mill

    Este es un mensaje valioso.

  3. Sorrell

    Y entonces no lo es)))))

  4. Corey

    How curious. :)

  5. Iaokim

    Estoy de acuerdo, este pensamiento será útil



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