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Laboratorio 4: Tinciones ácido-resistentes, esporas y cápsulas - Biología

Laboratorio 4: Tinciones ácido-resistentes, esporas y cápsulas - Biología



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ÁCIDO RÁPIDO

La tinción acidorresistente es una tinción diferencial que se utiliza para identificar organismos acidorresistentes como los miembros del género Mycobacterium. Los organismos acidorresistentes se caracterizan por tener paredes celulares cerosas, casi impermeables; contienen ácido micólico y grandes cantidades de ácidos grasos, ceras y lípidos complejos. Este tipo de pared celular es resistente a la mayoría de los compuestos, por lo que los organismos acidorresistentes requieren una técnica de tinción especial.

El tinte principal utilizado en la tinción acidorresistente, carbol fucsina, es soluble en lípidos y contiene fenol, que ayuda a que el tinte penetre en la pared celular. Esto se ve reforzado por la adición de calor en forma de calor (vapor). El vapor ayuda a aflojar la capa cerosa y promueve la entrada de la mancha primaria dentro de la celda. Luego, el frotis se enjuaga con un decolorante muy fuerte, que quita la mancha de todas las células no resistentes a los ácidos pero no penetra en la pared celular de los organismos resistentes a los ácidos. Las células decoloradas no acidorresistentes luego toman la contratinción, que en nuestro caso es azul de metileno.

1. Trabajando en parejas, prepare TRES portaobjetos como se indica a continuación (2 para respaldo y uno para teñir).

2. Etiquete cada diapositiva y dibuje un círculo en el centro de la diapositiva con un lápiz de cera.

3. Prepare una emulsión en cada portaobjetos con 4 lazos llenos de Staphylococcus epidermidis de su cultivo de caldo en el portaobjetos (estas serán sus bacterias ácido-resistentes negativas).

4. Luego, agregue un bucle lleno de Mycobacterium chelonae (estas son sus bacterias positivas ácidas) y mezcle las dos bacterias.

5. Deje que los portaobjetos se sequen al aire sobre los calentadores de portaobjetos (mientras estos portaobjetos se secan, prepare los portaobjetos para la tinción de esporas).

6. Una vez que el líquido se haya evaporado por completo, fije las bacterias con calor pasándolas a través de la llama tres veces.

7. Asegúrese de que la rejilla deslizante en la parte superior de su vaso de precipitados esté completamente nivelada. Luego, hierva el agua mientras se secan los portaobjetos.

Solo necesitas unos 200 mililitros de agua. Si agrega más, estará esperando todo el período de laboratorio para que hierva el agua.

8. Una vez que el agua esté hirviendo, coloque el portaobjetos en la rejilla para portaobjetos sobre el agua hirviendo.

9. Cubra el área de su frotis en el portaobjetos con un pedazo cuadrado de toalla de papel PRECUT. Asegúrese de que nada de papel cuelgue de la diapositiva.

10. Aplique con cuidado el tinte CARBOL FUCHSIN sobre la toalla de papel.

Si aparece una mancha en el agua que está hirviendo, deténgase y deseche el agua manchada en el triturador de desechos líquidos. Los vapores de la carbol fucsina pueden ser tóxicos.

11. Cocine al vapor con el tinte en el portaobjetos durante 7 minutos mientras aplica continuamente más tinte para que el cuadrado de papel nunca se seque.

12. Retire suavemente el papel con unas pinzas y deséchelo en el pequeño vaso de papel usado que se le proporcionará en su banco. Luego, enjuague el portaobjetos con agua.

13. Coloque el portaobjetos en su palangana de tinción y enjuague suavemente con agua.

14. Decolore con 6 gotas de alcohol ácido (no etanol de su kit de tinción de Gram), luego enjuague con agua.

15. Vuelva a teñir con azul de metileno durante 2 minutos.

16. Enjuague con agua y seque con papel absorbente (no use el calentador de portaobjetos).

17. Examine debajo de la lente del objetivo 100X con inmersión en aceite y registre sus resultados.

Los colores de esta imagen pueden estar ligeramente apagados debido a la impresión / copia.

MANCHA DE SPORE

La tinción de endosporas es una tinción diferencial que se utiliza para visualizar endosporas bacterianas. Una endospora es una forma inactiva de una bacteria, que algunas especies de bacterias producen en condiciones estresantes como mala nutrición, altas temperaturas o ambientes secos. La capa exterior está compuesta de queratina resistente a las manchas. La mancha verde malaquita se introduce en la espora con vapor. Las esporas pueden ser centrales, terminales y sub terminales. Esta tinción se usa comúnmente para detectar esporas producidas a partir de los géneros de Bacillus y Clostridium.

18. Prepare dos portaobjetos con emulsiones, uno de la placa A y otro de la placa B.

19. Caliente los portaobjetos y colóquelos en la rejilla para portaobjetos sobre el agua hirviendo.

20. Cubra el área de su frotis en cada portaobjetos con un pedazo cuadrado de toalla de papel PRECUT.

21. Aplique con cuidado el tinte VERDE MALAQUITA sobre la toalla de papel.

22. Cocine al vapor durante 10 minutos y mantenga el papel empapado con la mancha durante este tiempo.

23. Retire suavemente el papel con unas pinzas, deséchelo en el pequeño vaso de papel usado que se le proporcionará en su banco y luego enjuague el portaobjetos con agua.

24. Coloque los portaobjetos en la cubeta de tinción y enjuáguelos suavemente con agua.

25. Vuelva a teñir con SAFRANIN durante 1 minuto y luego enjuague con agua. Seque con papel absorbente.

26. Examine debajo de la lente del objetivo 100X con inmersión en aceite y registre sus resultados.

Los colores de esta imagen pueden estar ligeramente apagados debido a la impresión / copia.

MANCHA CÁPSULA

La mayoría de las cápsulas están compuestas por polisacáridos o polipéptidos que son una capa gruesa, detectable y discreta fuera de la pared celular. Algunas cápsulas tienen límites bien definidos, mientras que otras tienen bordes de salida difusos. Las cápsulas protegen a las bacterias de la acción fagocítica de las células inmunes y permiten que los patógenos invadan el cuerpo. Si un patógeno pierde su capacidad para formar cápsulas, a menudo deja de ser patógeno.

27. Rotule y prepare un portaobjetos con una emulsión de Klebsiella pneumoniae.

28. Déjelo secar al aire (NO USE EL CALENTADOR DE DIAPOSITIVAS, NO CALIENTE FIX).

29. Teñir con violeta cristal al 1% durante 2 minutos (NO UTILIZAR VIOLETA CRISTAL DE GRAM STAIN).

30. Enjuagar MUY SUAVEMENTE con 6 gotas de sulfato de cobre.

31. Déjelo secar al aire sobre la encimera (no use el calentador de portaobjetos).

32. Examine debajo de la lente del objetivo 100X con inmersión en aceite y registre sus resultados.


Tinción de la cápsula: principio, reactivos, procedimiento y resultado

El propósito principal de la tinción de cápsulas es distinguir el material capsular de la célula bacteriana. A cápsula es una capa exterior gelatinosa secretada por la célula bacteriana y que rodea y se adhiere a la pared celular. La mayoría de las cápsulas están compuestas por polisacáridos, pero algunas están compuestas por polipéptidos. los cápsula difiere del capa de limo que la mayoría de las células bacterianas producen porque es una capa gruesa, detectable y discreta fuera de la pared celular. La tinción de la cápsula emplea una tinción ácida y una tinción básica para detectar la producción de la cápsula.


Mancha de cápsula

La tinción de cápsula es un tipo de tinción diferencial que implica el uso de dos tinciones, la tinción primaria y la contratinción. Aquí, vale la pena señalar que, en su mayor parte, las cápsulas no son iónicas.

Como resultado, las manchas ácidas y básicas a menudo no se adhieren a ellas. Por este motivo, es necesario teñir el fondo con un tinte ácido mientras que la célula se tiñe con un tinte básico.

Dos de los métodos más utilizados en la tinción de cápsulas incluyen:


Manchas

La mayoría de las bacterias no solo son muy pequeñas, sino que también son muy claras y difíciles de ver al microscopio sin la primera tinción. Debe sujetar firmemente sus bacterias a un portaobjetos de vidrio antes de poder teñirlas. Hay dos cosas importantes a considerar al preparar un portaobjetos para la tinción:

  1. Las bacterias deben dispersarse uniforme y ligeramente. Si hay demasiadas bacterias en el portaobjetos, formarán un gran globo y no podrá ver la morfología de las células individuales. Las manchas grandes de células tampoco se tiñen correctamente y podrían producir resultados erróneos debido a una tinción inadecuada.
  2. Las bacterias deben estar firmemente adheridas al portaobjetos para que no se eliminen durante los procedimientos de tinción. Todos los procedimientos que unen las bacterias al portaobjetos producen algunos cambios morfológicos. Las células normalmente se encogen de tamaño y mostrarán algunos cambios en la forma y las matrices extracelulares.

Estará preparando portaobjetos para teñir tanto de caldo como de superficies de agar. Si bien los objetivos son los mismos para ambos, las células uniformemente y ligeramente dispersas se adhieren firmemente a la superficie del portaobjetos, las técnicas son ligeramente diferentes. La tinción es tanto un arte como una ciencia. Sin duda, le tomará varios intentos antes de tener éxito.

Materiales

  • Portaobjetos de vidrio limpio
  • Bucles de inoculación o agujas
  • Agua esteralizada
  • Rotulador
  • Cultivos surtidos de caldos y platos

Consideraciones de seguridad

Tenga cuidado con los aerosoles cuando transfiera bacterias de su asa al portaobjetos. El bucle es muy flexible y es fácil hacer un bucle lleno de organismos. No asuma que su organismo está muerto. No se garantiza que la fijación de calor o metanol mate al organismo. Deseche los portaobjetos completos en el balde desinfectante de su banco.

Consideraciones Generales

Se está esforzando por obtener una suspensión ligera de células que deje un leve depósito turbio en su portaobjetos. Tienes mucho espacio en tu tobogán ¡úsalo! Es útil dibujar inicialmente un círculo en la parte inferior de la diapositiva para que sepa dónde buscar su frotis. Es muy fácil confundirse en qué lado del portaobjetos está el frotis. Asegúrese de etiquetar el borde más alejado de la diapositiva. Haga esto constantemente en el mismo extremo de la diapositiva para ayudar a orientar su diapositiva.

Sea paciente y tómese el tiempo para dejar que el portaobjetos se seque al aire antes de proceder a adherirlo al portaobjetos. Si su portaobjetos está mojado y lo fija con calor, las bacterias hervirán y se perderá la morfología celular. Si su portaobjetos está mojado y lo fija en metanol, lo más probable es que se lave el portaobjetos. Lo más probable es que los frotis que sean demasiado gruesos se eliminen del portaobjetos independientemente del método de fijación.

Frotis de caldo

Los cultivos en caldo suelen ser más fáciles de trabajar porque las células ya están diluidas en el caldo. Asegúrese de mezclar cuidadosamente el tubo de cultivo para suspender las bacterias en el caldo.

  1. Etiqueta tu diapositiva. Transfiera asépticamente un bucle lleno de organismo al centro de su portaobjetos.
  2. Use la parte plana del lazo para untar la gota de caldo alrededor del portaobjetos. Utilice un movimiento circular en espiral para extender la gota. Debido a que el caldo está lleno de proteínas, el frotis generalmente permanecerá extendido y no formará gotas en la superficie del portaobjetos.
  3. Deje el portaobjetos a un lado para que se seque al aire. Esto llevará al menos varios minutos. No apresure este paso.

Frotis del plato

Puedes sacar muchos organismos con tu bucle. Es posible que desee utilizar una aguja de inoculación para transferir su organismo al portaobjetos. Asegúrese de usar agua esterilizada para diluir sus muestras. El agua corriente del grifo o el agua desionizada de las botellas de enjuague suelen estar contaminadas con bacterias.

  1. Etiqueta tu diapositiva. Transfiera asépticamente un asa llena de agua esterilizada al centro del portaobjetos.
    • Esto sirve tanto para diluir las bacterias como para darle algo para esparcir.
  2. Elija una colonia bien aislada.
  3. Pínchelo con su aguja esterilizada o saque ligeramente el borde de la colonia con su asa esterilizada.
  4. Coloque su aguja / bucle en el centro de la gota y con un movimiento circular en espiral esparza las bacterias en el portaobjetos.
  5. Deje el portaobjetos a un lado para que se seque al aire. Esto llevará al menos varios minutos. No apresure este paso.

Fijación

El procedimiento de fijación es el mismo independientemente de la fuente de frotis, placa o caldo. Hay dos métodos para adherir las bacterias al portaobjetos, la fijación con calor o la fijación con metanol. La fijación por calor solo se usa con organismos BSL1. Los organismos con los que trabajaremos son BSL2, por lo que deberá utilizar la técnica de fijación con metanol. La fijación con calor del portaobjetos puede crear aerosoles y, con los organismos BSL2, debemos prevenir esto tanto como sea posible. La fijación de metanol provoca menos cambios en la morfología celular y no genera aerosoles.

Tenga cuidado al trabajar con el metanol, si olvida que lo ha fijado con metanol y su portaobjetos no está totalmente seco, el metanol restante se incendiará.

Fijación de metanol (BSL2)

  1. Asegúrese de que su tobogán esté totalmente seco. Colóquelo en la rejilla de tinción sobre el fregadero.
  2. Inunda cuidadosamente el portaobjetos con metanol al 95%. Déjalo reposar durante dos minutos.
  3. Incline el portaobjetos y vierta el metanol.
    • Toque el borde del portaobjetos con una toalla de papel para eliminar el exceso de metanol.
  4. Deje el portaobjetos a un lado para que se seque al aire antes de teñirlo.

Mancha simple

Las manchas simples son solo eso: agregue una mancha a un portaobjetos de frotis fijo, déjelo reposar, enjuáguelo, déjelo secar y vea. Es un procedimiento rápido para determinar la presencia y morfología de bacterias en muestras clínicas como heces y secreciones.

El azul de metileno se utiliza para determinar la morfología de fusiformes y espiroquetas en infecciones bucales. También es el tinte de elección para identificar los gránulos metacromáticos en Corynebacterium diphtheriae. Los gránulos se tiñerán de un azul claramente más profundo que las bacterias azules circundantes. Otras especies de Corynebacterium no tienen los gránulos metacromáticos. Cualquier colorante básico, como azul de metileno, violeta cristal, verde malaquita o safranina, funciona bien.

Los colorantes básicos (catiónicos o cargados positivamente) se unen a componentes cargados negativamente en la membrana celular y el citoplasma.

Materiales

  • Azul de metileno
  • Safranina
  • Cristal violeta
  • Verde malaquita
  • Gradillas de tinción
  • Cajas de microherramientas
  • Portaobjetos de frotis preparados

Consideraciones Generales

La tinción es parte arte y parte ciencia. No existen reglas estrictas para los tiempos de tinción y enjuague. Los tiempos enumerados son sugerencias que generalmente funcionan bien. Deberá experimentar con lo que funciona para las bacterias que tiene y las técnicas que utiliza.

Es esencial que registre exactamente lo que hace y los resultados que observa en su libro de laboratorio. Repetirá estas tinciones más adelante en el semestre y no querrá perder el tiempo reinventando su exitoso procedimiento de tinción. Sería útil que cada miembro de la mesa de laboratorio eligiera una mancha diferente para que pueda ver cómo se ven todas.

Procedimiento de tinción simple

  1. Coloque sus portaobjetos de frotis fijos cuidadosamente preparados en la rejilla de tinción sobre el fregadero.
    • Haz una diapositiva a la vez.
    • Cubre el frotis con cualquiera de los tintes básicos disponibles.
    • Solo necesitas suficiente tinte para cubrir el frotis. La mancha no debe gotear del portaobjetos.
  2. Deja que la mancha repose durante 1 a 5 minutos.
  3. Con la pinza de ropa, agarre el extremo largo del portaobjetos, incline el portaobjetos sobre el fregadero y enjuague la mancha con un chorro de agua de la botella de lavado.
    • Asegúrese de rociar sobre la mancha y dejar que gotee.
    • Si rocía directamente sobre el frotis, es probable que lo elimine del portaobjetos.
    • Enjuague hasta que el agua salga clara o esté ligeramente coloreada.
  4. Toque el borde del portaobjetos con una toalla de papel para eliminar el exceso de agua. Ahora puede dejar que se seque al aire. Alternativamente, puede secarlo con papel secante colocándolo en el libro de papel secante y presionando ligeramente. Si bien este método es más rápido, también puede secar un frotis mal adherido.
  5. Vea su diapositiva bajo inmersión en aceite y registre sus observaciones en su libro de laboratorio.
  6. Deseche los portaobjetos manchados usados ​​en el balde desinfectante del fregadero.

Mancha negativa

Las manchas negativas son incluso más simples que las simples porque no es necesario hacer un frotis. Se extiende una gota de células en un portaobjetos y se observa sin fijación. La mancha es una suspensión de carbón, que se encuentra en la tinta china o nigrosina. Las partículas de carbono están cargadas negativamente, al igual que la membrana celular. El fondo se ve de color negro o sepia y las células quedan claras, ya que repelen el tinte.

Algunos cuerpos de inclusión con carga positiva, como el azufre, pueden manchar. Esta tinción proporciona información precisa sobre la morfología celular y la presencia de cápsulas porque las células no están fijadas. El tamaño de la célula parece un poco más grande porque los recubrimientos extracelulares o secreciones en el exterior de la membrana celular tampoco se tiñen. Las tinciones negativas son útiles para la determinación rápida de la presencia de Cryptococcus neformans, el agente causante de la criptococisis, en el líquido cefalorraquídeo. Esta técnica también se utiliza cuando se tiñe para endosporas y cápsulas.

Materiales

Consideraciones Generales

Al igual que para preparar un frotis, solo necesita una pequeña cantidad de organismo. Si tiene demasiados organismos, no podrá ver la morfología de las células individuales. También es importante no utilizar demasiada nigrosina. Si es demasiado espeso, el fondo tendrá una apariencia agrietada similar a los charcos de barro que se secan al sol. Quieres conseguir una película ligera. Su instructor le demostrará esta técnica.

Procedimiento de tinción negativa

  1. Etiqueta tu diapositiva. Si está trabajando a partir de un cultivo de caldo, coloque un bucle lleno de organismos aproximadamente a las tres cuartas partes del camino en el lado izquierdo del portaobjetos. Si está trabajando a partir de un cultivo en placa, agregue una gota de agua esterilizada al portaobjetos y diluya su organismo en la gota sin esparcir la gota.
  2. Ponga una o dos gotas de nigrosina en otro portaobjetos. Use su lazo esterilizado para recoger un lazo lleno de nigrosina. Mézclalo cuidadosamente con la gota de células, sin esparcir demasiado la gota.

  1. Sostenga el extremo derecho del portaobjetos en su mano derecha con su mano izquierda y tome otro portaobjetos en un ángulo de 45 ° o menos con respecto al primer portaobjetos, justo después de su caída de nigrosina / célula.
  2. Mueva el portaobjetos en ángulo hacia atrás a lo largo de la superficie del primer portaobjetos hasta que solo toca la gota de nigrosina y las células. Espere a que la acción capilar extraiga el líquido a lo largo del borde delantero del portaobjetos en ángulo.
  3. Empuje el tobogán en ángulo a través de la superficie del tobogán plano. La mayor parte de la nigrosina debe dejarse en el lugar original. Deseche el portaobjetos en el balde desinfectante.
  4. Deje el portaobjetos teñido a un lado para que se seque al aire antes de observarlo bajo inmersión en aceite. Asegúrese de comenzar a examinar su diapositiva en el área con el fondo gris más tenue.
  5. Registre sus observaciones en su libro de laboratorio.
  6. Deseche el portaobjetos teñido usado en el balde desinfectante.

Nota especial

La nigrosina se desprende del portaobjetos y se coloca en la lente de inmersión en aceite con mucha facilidad. Asegúrese de limpiar a fondo su lente de aceite cuando haya terminado. Luego límpialo de nuevo. Una vez que se seca en la lente, es muy difícil de quitar y afectará su capacidad (y los otros micro estudiantes que usan ese alcance) para ver claramente fuera de la lente.

Tinción de Gram

La tinción de Gram es la tinción diferencial más utilizada en microbiología. Las tinciones diferenciales utilizan más de un tinte. Los componentes celulares únicos de las bacterias determinarán cómo reaccionarán a los diferentes tintes. El procedimiento de tinción de Gram se ha mantenido básicamente sin cambios desde que se desarrolló por primera vez en 1884. Casi todas las bacterias se pueden dividir en dos grupos, Gram negativas o Gram positivas. Algunas bacterias son gram variables. Trichomonas, Strongyloides, algunos hongos y algunos quistes de protozoos también tienen una reacción de Gram. Bacterias muy pequeñas o bacterias sin pared celular, como Treponema, Micoplasma, Clamidia, o Rickettsia no tiene una reacción de gramo. La caracterización de cualquier nueva bacteria debe incluir su reacción de gramo.

Por lo general, una mancha diferencial tiene cuatro componentes: la mancha primaria, un mordiente que fija la mancha, un agente decolorante para eliminar la mancha primaria y una contramancha. En la tinción de Gram, la tinción principal es cristal violeta. Esto le da a la célula un color púrpura intenso. El mordiente, el yodo, forma un complejo con el cristal violeta dentro de la pared celular. Luego, la celda se lava con decolorante de Gram o con etanol al 95%. Las células grampositivas retendrán el complejo de tinte y permanecerán púrpuras. El tinte se aclara en células gram negativas. La contratinción, safranina, se usa para colorear las células que perdieron la mancha primaria; de lo contrario, permanecerían incoloras y no podrías verlas.

El gran complejo de yodo-cristal violeta se retiene dentro de las paredes celulares de las células gram positivas debido a la estructura molecular de las muchas capas de peptidoglicano en la pared celular. Hay muchos ácidos teicoicos reticulados y el complejo de tinte de yodo no puede salir físicamente. También hay menos lípidos en la membrana y el agente decolorante no puede llegar a ella. Las células gram negativas tienen una membrana externa y solo una capa de peptidoglicano, con más lípidos. El tinte cristal violeta se lava fácilmente.

Consideraciones Generales

La precisión de la tinción de Gram depende de la integridad de la pared celular bacteriana. Hay una variedad de cosas que pueden influir en la integridad de la pared celular de las células viejas (es decir, cultivos de más de 24 horas), la muestra es de alguien tratado con antibióticos que se dirigen a esa pared celular, como la penicilina, las células han sido manipuladas bruscamente o usted el calor los arreglaba. En estas condiciones, las células grampositivas se convertirán en gramnegativas. Si decolora demasiado tiempo, las células grampositivas se verán como células gramnegativas. Por el contrario, si no decolora lo suficiente, los Gram-negativos se verán como Gram-positivos. La única forma en que puede confiar en sus resultados es ejecutar siempre un Gram-positivo conocido y un Gram-negativo conocido en la misma diapositiva. Si se tiñen como se predijo, puede estar bastante seguro de que el resultado de su muestra desconocida es confiable.

La tinción de Gram requiere práctica para ser correcta. No espere obtener una buena tinción de Gram en su primer intento. ¡Es una buena idea sujetar el tobogán con una pinza para la ropa, sus guantes se volverán bastante psicodélicos al igual que todo lo que toque!

Procedimiento de tinción de Gram

  1. Etiqueta tu diapositiva. Prepare sus frotis en un portaobjetos con un Gram negativo a la izquierda, su desconocido en el medio y un Gram positivo a la derecha.
    • ¡No olvides arreglar el tobogán con metanol!
  2. Colocando su portaobjetos en la rejilla de tinción, cubra los frotis con violeta cristal durante 1 minuto.
    • Use la cantidad suficiente de tinte para cubrir completamente el frotis, pero no tanto como para que corra o gotee del portaobjetos.
  3. Incline el portaobjetos y vierta el cristal violeta y enjuague brevemente con agua de su botella de lavado.
    • Recuerde no rociar directamente sobre los frotis o los lavará.
  4. Inunde el portaobjetos con mordiente de yodo durante 1 minuto.
  5. Incline el portaobjetos, elimine el exceso de yodo y decolore suavemente con el decolorante de Gram hasta que empiece a aclararse.
    • ¡Esta es la parte complicada!
  6. Incline su portaobjetos sobre algunas toallas de papel para eliminar el exceso de decolorante.
  7. Inunda su tobogán con safranina durante 1 minuto.
  8. Incline el portaobjetos para eliminar el exceso de safranina y enjuague suavemente con agua hasta que salga transparente.
  9. Deje que la diapositiva se seque al aire
  10. Observar bajo inmersión en aceite.
    • El control Gram positivo debe ser violeta y el control Gram negativo debe ser rosado.
  11. Deseche el portaobjetos usado en el balde desinfectante.

Tinción de cápsula de rojo Congo

La tinción de la cápsula de rojo Congo es una modificación de la tinción negativa de nigrosina que puede haber realizado anteriormente. Las bacterias absorben el tinte rojo del Congo y el fondo se tiñe luego con tinte ácido fucsina. Las capas de cápsula o limo, polímeros altamente hidratados, excluyen ambos colorantes. El fondo aparecerá azul, las células bacterianas aparecerán rosadas y los halos claros son las cápsulas.

Clínicamente, las cápsulas de algunas bacterias altamente patógenas (es decir, neumococos, Haemophilis influenzae, y meningococos), se pueden distinguir con el uso de antisueros específicos para ese tipo de cápsula. Las bacterias se suspenden en los antisueros y luego se mezclan con azul de metileno. En el procedimiento de tinción de antisueros, las bacterias aparecerán de color azul rodeadas por un halo transparente y luego rodeadas por una delgada línea azul donde los antisueros se han adherido a la cápsula.

Materiales

  • Tinción de rojo Congo
  • Tinción de fucsina ácida
  • Alcohol ácido
  • Klebsiella pneumoniae cultura
  • Enterobacter aerogenes cultura

Procedimiento de tinción con cápsula de rojo Congo

  1. Coloque un bucle lleno de rojo Congo en un tobogán
  2. Mezcle una pequeña cantidad de su organismo en la gota de Rojo Congo.
    • Extienda bien la suspensión de organismo / colorante en el portaobjetos
  3. Deje que el portaobjetos se seque completamente al aire.
    • ¡No lo arregles con metanol!
  4. Fije el portaobjetos seco con alcohol ácido durante 15 segundos.
  5. Enjuague con agua destilada y cubra el portaobjetos con fucsina ácida durante 1-5 minutos.
  6. Enjuague con agua y deje secar al aire.
  7. Examine el portaobjetos bajo inmersión en aceite.
    • Las células se tiñen de rojo / rosa y las cápsulas aparecen como halos incoloros sobre un fondo azul oscuro.

Tinción de endosporas de Wirtz

La formación de endosporas es característica de Clostridum y Bacilo spp. La capacidad de concentrar y recubrir su protoplasma les permite sobrevivir a las condiciones ambientales adversas que experimentan en su hábitat del suelo. Esto también permite que las esporas resistan las manchas. Los organismos "vivos" se visualizan fácilmente con tinciones simples y tinciones de Gram.

Las endosporas son típicamente muy refráctiles, la luz que las golpea se desvía. Muchos Bacilo las especies tienen cuerpos de inclusión que son altamente refractiles. Estos cuerpos de inclusión pueden parecer endosporas con tinción regular. La presencia de endosporas debe confirmarse con tinciones específicas de endosporas. La presencia y la forma y posición características de las endosporas requieren procedimientos especiales para penetrar la capa de endosporas. La mayoría de las manchas de endosporas implican calentar los portaobjetos mientras se mantienen continuamente húmedos con el tinte. Si bien es más rápido, produce sustancias químicas volátiles y es un gran desastre. Se pueden obtener los mismos resultados dejando que el tinte se asiente en el portaobjetos durante 30 minutos. Es una buena idea comenzar esta diapositiva primero y trabajar en otra mancha mientras espera que el tinte penetre en la endospora.

Consideraciones Generales

Estarás usando un Bacilo especies para la tinción de endosporas. La forma y posición de B. cereus las esporas son muy similares a las de B. anthracis. Bacilo no comienza a formar esporas hasta que se acaba el alimento. Si los cultivos son demasiado jóvenes, la mayoría de las veces solo verá las varillas rosadas de la bacteria. Si los cultivos son demasiado antiguos, la mayoría de las veces solo verá los pequeños óvalos verdes de las endosporas. Idealmente, debería ver los cuerpos ovalados verdes de la endospora rodeados por la célula bacteriana vegetativa rosada. Seleccione una muestra del medio de una colonia con la aguja de inoculación recta para obtener los mejores resultados. El borde de la colonia todavía está creciendo activamente y tendrá pocas endosporas.


TÉCNICA DE TINCIÓN DE CÁPSULAS & # 8211 INTRODUCCIÓN, MÉTODOS, PRINCIPIO, PROCEDIMIENTO & # 038 RESULTADOS

Una cápsula en bacterias es el resultado de una secreción viscosa amorfa liberada por las bacterias. Cuando esta secreción permanece suelta y sin demarcar, se llama capa de limo y cuando se organiza en una estructura claramente definida se llama Cápsula.

La mayoría de las cápsulas están compuestas por polisacáridos, pero hay muchas que están compuestas por polipéptidos (proteínas).

Las cápsulas suelen ser frágiles y pueden destruirse o distorsionarse fácilmente al calentarlas, por lo que la tinción de la cápsula está diseñada de tal manera que mantiene la morfología general de las bacterias y conserva la estructura de la cápsula para que podamos identificarla fácilmente.

Además, para obtener mejores resultados y aumentar el tamaño de la cápsula bacteriana, se puede usar una gota de suero mientras se prepara un frotis, lo que hace que sea más conveniente observar la cápsula bacteriana con un compuesto típico / microscopios ópticos.

No se utilizan procesos complejos y múltiples reactivos fuertes o tinciones en el proceso de tinción de cápsulas y los métodos más simples como el método de tinta china brindan resultados satisfactorios para que podamos determinar fácilmente la presencia o ausencia de cápsulas en la célula bacteriana.

También se evita la fijación por calor, ya que destruirá o distorsionará la cápsula, lo que la hace más conveniente y, además, los novatos en microbiología pueden hacerlo fácilmente y explorar más en el mundo microbiano ...

Brevemente, en la técnica de tinción de cápsula, el fondo y el cuerpo de la célula bacteriana se tiñen mientras que la cápsula permanece incolora. Sin embargo, el resultado varía según la metodología utilizada para la tinción de cápsulas.

PRINCIPIO DE TINCIÓN EN CÁPSULA

En primer lugar, analicemos las estructuras de las células bacterianas que participan en esta técnica de tinción y, más adelante, pasaremos a los principios implicados en la técnica de tinción de cápsulas.

Una bacteria encapsulada adquiere una cápsula alrededor de su cuerpo que aparece como un halo claro. Una cápsula bacteriana es de naturaleza no iónica, por lo que existe una mínima posibilidad de que las manchas ácidas o básicas se adhieran a sus superficies, por lo que permanece incolora.

La excelente manera de demostrar la cápsula es teñir el cuerpo de la célula bacteriana y el fondo dejando la cápsula bacteriana incolora.

El cuerpo de la célula bacteriana se tiñe mejor con tintes básicos como violeta cristal, safranina, azul de metileno, etc., mientras que el fondo se tiñe mejor con tintes ácidos que incluyen tinta china, nigrosina, eosina, rojo Congo, etc.

Existen numerosos métodos disponibles para la demostración de la cápsula en células bacterianas. El resultado de la tinción varía según el método seguido, pero comúnmente todos los métodos tienen una cosa en común que tiñen la célula bacteriana, la cápsula y / o el fondo. Los dos métodos más utilizados son los siguientes:

Método de tinta china / método de nigrosina

Éste es el método más sencillo de tinción de cápsulas. En esta técnica se utilizan dos tintes que es Crystal violet y la tinta china / nigrosin.

La cápsula de la célula bacteriana aparece como un halo claro alrededor del cuerpo de la célula bacteriana teñida y el fondo oscuro (el color depende del tinte utilizado: tinta china o nigrosina).

Anthonymétodo de tinción

Este es otro método más utilizado de tinción de cápsulas. En esta técnica, el tinte cristal violeta se utiliza como tinte principal.

Además de eso, se usa una solución al 20% de sulfato de cobre que juega un papel importante en el procedimiento de tinción al actuar como agente decolorante y como contratinción.

20% CuSO4 decolora las cápsulas bacterianas eliminando el cristal violeta que se adhiere pero no tiene tal efecto en el cuerpo de la célula bacteriana y también tiñe la cápsula que luego aparece como una zona de color azul tenue o un halo alrededor del cuerpo de la célula bacteriana púrpura.

Una cosa importante a tener en cuenta aquí es que no hay mordiente y no se utilizan decolorantes fuertes.

MATERIALES NECESARIOS PARA EL MÉTODO DE TINCIÓN EN CÁPSULA

  • Portaobjetos de vidrio microscópico.
  • Asa de inoculación.
  • Lámpara Spirit.
  • Rejilla de tinción.
  • Lavar botella.
  • Microscopio (con lente objetivo 100X).

Para el método de tinta china / nigrosina

Para el método de tinción Anthony & # 8217s

PROCEDIMIENTO DE LA TÉCNICA DE TINCIÓN DE CÁPSULAS

El procedimiento de tinción de la cápsula utilizando el método de tinta china / nigrosina

Tome un portaobjetos de vidrio microscópico limpio, seco, sin rayones ni grasa y coloque una gota de tinta china o nigrosina en un extremo cerca del borde.

Tome una pequeña porción de la colonia bacteriana o un asa de caldo de cultivo con la ayuda de un asa de inoculación esterilizada.

Mezclar bien el cultivo con el tinte tomado en el portaobjetos de vidrio.

Ahora, tome otro portaobjetos de vidrio microscópico, colóquelo cerca de la mezcla de muestra y tinte en un ángulo de aproximadamente 30 ° - 45 °.

Mueva el portaobjetos hacia la gota de la mezcla de muestra y tinte hasta que el contacto se haga con la gota en el ángulo específico. A continuación, mueva el portaobjetos esparcidor de manera suave y rápida hacia adelante sobre el portaobjetos de la muestra, dibujando la mezcla de tinte detrás de él en una película delgada.

Deje que el frotis se seque al aire.

NOTA: No caliente ya que el calor derretirá la cápsula y distorsionará la forma real de la célula bacteriana.

Ahora, enjuague el portaobjetos de frotis con una solución de violeta cristal durante 1 minuto y enjuague cuidadosa y suavemente con agua.

NOTA: Tenga cuidado al realizar este paso, ya que el agua puede quitar la cápsula de la celda y lavar el frotis.

Deje que el frotis se seque al aire.

NOTA: No seque el portaobjetos, ya que puede distorsionar la cápsula y el frotis.

Observe bajo el microscopio en objetivos de alta potencia (45X) y objetivos de inmersión en aceite (100X). Para visualizar fácilmente la cápsula, asegúrese de disminuir la cantidad de luz mientras observa bajo el microscopio.

El procedimiento de tinción de la cápsula usando Anthony método de tinción

El procedimiento del método de tinción de Anthony es bastante similar al del método de tinta china / nigrosina inicialmente, que es el siguiente:

Tome un portaobjetos de vidrio microscópico limpio, seco, sin rayones ni grasa y coloque una gota de violeta cristal en un extremo cerca del borde.

Take a small portion of the bacterial colony or a loopful of broth culture with the help of sterilized Inoculating loop.

Mix well the culture with dye taken on the Glass slide.

Now, take another Microscopic Glass slide, place it near to the specimen-dye mixture at an angle of about 30° – 45°.

Move the slide toward the drop of the specimen-dye mixture until the contact is made with the drop at the specific angle. Then move the spreader slide smoothly and rapidly forward over the specimen slide, drawing the dye mixture behind it into a thin film.

Allow the smear to Air dry.

NOTE: Do not Heat as heat will melt the capsule and distorts the actual shape of the bacterial cell.

Now, Tilt the smear slide and rinse it with the 20% copper sulfate (CuSO4) solution.

NOTE: Do not Blot dry the slide as it may distort the capsule as well as the smear.

Observe under the microscope at High power objective (45X) and oil immersion (100X) objectives. To easily visualize the capsule make sure to decrease the amount of light while observing under the microscope.

OBSERVATIONS & RESULTS OF CAPSULE STAINING

Results of Capsule staining using India ink / Nigrosin Method

The capsule appears as the Clear halo or clear zone around the purple colored bacterial cell body on a dark background. The Background color is due to the India ink or Nigrosin whatever you’ll use.

MICROSCOPIC VIEW OF INDIA INK PREPARATION SHOWING CAPSULE, BACTERIAL CELL BODY (PURPLE) & BLUISH BACKGROUND

Results of Capsule staining using Anthony’s stain Method

The capsule appears as the Faint blue halo around the purple bacterial cell body on a transparent background as there is no background stain is used in this technique.

MICROSCOPIC VIEW OF ANTHONY’s CAPSULE STAIN PREPARATION SHOWING PURPLE BACTERIAL CELL BODY AND LIGHT BLUE CAPSULE

THINGS TO BE NOTED…..

By using India ink / Nigrosin technique, we stain the background and bacterial cell body, not the bacterial capsules actually.

By Anthony’s Stain method we stain the Bacterial cell body as well as the Capsule but not the Background.


Further Reading:

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Capsule Stain:

Capsules are the gelatinous outer layer of the bacterial cells and these structures cannot retain the color of the staining agents. The capsules can be visualized by means of two methods.

Positive Capsule Staining

Since capsule is water soluble in nature, it is too difficult to stain the capsule with normal staining methods. The positive capsule staining method (Anthony Method) uses two reagents to stain the capsular material. The primary stain Crystal violet is applied over a non heat fixed bacterial smear so that both the bacterial cells and capsular material take up the color of the primary stain. The ionic nature of the bacterial cell binds the crystal violet stain more strongly while the non-ionic nature of the capsule get adhere with the crystal violet stain. When the decolorizing agent copper sulfate is added over the bacterial smear, the loosely adhered crystal violet stain is washed off from the capsular material without removing the tightly bound crystal violet from the cell wall. The capsular material absorbs the light blue color of the copper sulfate in contrast to the purple bacterial cell.

Negative Capsule Staining

Another simple method to visualize the bacterial capsules is by using negative staining Technique. During staining the non heat fixed bacterial smear with the acidic stains such as Nigrosin will not penetrate the bacterial cells (since both acidic stain and bacterial surface has negative charge). Instead the acidic stain deposits around the bacterial cells and create a dark back ground and the bacteria appear as unstained with a clear area around them, capsule.


Nota: If you heat fix the bacterial smear for capsule staining, the cells will shrink creating a hallow zone around the bacterial cell and will be mistaken for the capsule.


What are Acid Fast Bacteria

The acid fast bacteria are a type of bacteria that resist decolorizing by acid after staining. Acid fastness is a physical property of bacteria, which rely on the structure of the bacterial cell wall. Typically, the cell wall of bacteria is made up of proteins, carbohydrates, and lipids. Acid fast bacteria comprise a thin layer of peptidoglycans. The mycolic acid is a long chain of fatty acids, attached to the peptidoglycans. Once the primary stain, carbol-fuchsin is added to the slide containing bacteria, the mycolic acid is attached to carbol-fuchsin. This makes the acid fast bacteria to stain in pink even after decolorization.

Figure 1: Acid Fast Bacteria

Mycobacteria is a common type of bacteria, which grows slowly hence, they are composed of a thick layer of mycolic acid. In addition to mycolic acid, acid fast bacteria consist of a large amount of fatty acids, complex lipids, and waxes. Due to the presence of thick bacterial cell wall, acid fast bacteria are highly resistant to disinfectants as well as dry conditions. The cell wall structure and the staining of acid fast bacteria are shown in Figura 1.


Biochemical properties (continued)

Another test is whether or not your unknown has an hemolytic reaction. Most bacteria are gamma-hemolytic, which means that they do not have an hemolytic reaction. This test is mostly used on streptococci species: it differentiates non pathogenic streptococci from pathogenic streptococci. This is tested on a blood agar plate: a beta-hemolysis creates a white discoloration around the colony whereas an alpha-hemolysis has a brownish green zone around the colony. Streptococcus pyogenes is not a pathogen and therefore is beta-hemolytic whereas steotococos neumonia o Streptococcus salivarius are alpha-hemolytic.

Another biochemical property is the production of H2S from the oxidation of sulfur containing compounds like cysteine or the reduction of inorganic compounds like thiosulfates, sulfates or sulfites. The media used is peptone-iron agar. The peptone has sulfur containing amino acids which are used by the bacteria to produce H2S and the iron detects the H2S by forming a black residue along the stab line. Proteus vulgaris for example produces H2S.

The following test is the coagulase test which shows if bacteria are capable of coagulating oxolated plasma. It is an indication of pathogenicity since if a bacteria can coagulate the blood, it can wall off from the immune system. Staphylococcus aureus can coagulate oxolated plasma and therefore blood. It is also capable of secreting gelatinase which is the enzyme that hydrolyzes gelatine into polypeptides and amino acids.

The following series of tests is called IMVIC which stands for Indole, Methyl red, Voges-Proskauer and Citrate.

  • The indole production test shows if the bacterial strain is capable of breaking down tryptophan by tryptophanophase into indole, ammonia and pyruvate. We can detect this reaction by using Kovac&aposs reagent which is contained in amyl alcohol (not miscible in water). Kovac&aposs reagent reacts with indole to form Rosindol dye, forming a red color that will rise to the top of the broth culture. This test is positive for Escherichia coli y Proteus vulgaris but negative for Enterobacter aerogenes for example.
  • The methyl red test tests for glucose fermentors. It turns red when the pH is inferior to 4,3. It is positive for E. coli but negative for E. aerogenes.
  • The Voge-Proskauer tests shows the production of acetoin. The reagent used is potassium hydroxide, a creatine solution. The medium turns red if the test is positive for E. aerogenes for example. It is negative for E. coli.
  • Finally, the citrate test is used to differentiate enterics. It tests if the bacterium has the permease required to take up the citrate and use it as the sole carbon source. The indicator used is bromothymol blue: the black medium turns blue if the citrate is used. E. aerogenes has the permease however E. coli doesn&apost.

Preparing Specimens for Electron Microscopy

Samples to be analyzed using a TEM must have very thin sections. But cells are too soft to cut thinly, even with diamond knives. To cut cells without damage, the cells must be embedded in plastic resin and then dehydrated through a series of soaks in ethanol solutions (50%, 60%, 70%, and so on). The ethanol replaces the water in the cells, and the resin dissolves in ethanol and enters the cell, where it solidifies. Próximo, thin sections are cut using a specialized device called an ultramicrotome (Figura 9). Finally, samples are fixed to fine copper wire or carbon-fiber grids and stained—not with colored dyes, but with substances like uranyl acetate or osmium tetroxide, which contain electron-dense heavy metal atoms.

Figure 9. (a) An ultramicrotome used to prepare specimens for a TEM. (b) A technician uses an ultramicrotome to slice a specimen into thin sections. (credit a: modification of work by “Frost Museum”/Flickr credit b: modification of work by U.S. Fish and Wildlife Service Northeast Region)

When samples are prepared for viewing using an SEM, they must also be dehydrated using an ethanol series. However, they must be even drier than is necessary for a TEM. Critical point drying with inert liquid carbon dioxide under pressure is used to displace the water from the specimen. After drying, the specimens are sputter-coated with metal by knocking atoms off of a palladium target, with energetic particles. Sputter-coating prevents specimens from becoming charged by the SEM’s electron beam.

Piénsalo

  • Why is it important to dehydrate cells before examining them under an electron microscope?
  • Name the device that is used to create thin sections of specimens for electron microscopy.

Using Microscopy to Diagnose Syphilis

The causative agent of syphilis es Treponema pallidum, a flexible, spiral cell (spirochete) that can be very thin (<0.15 μm) and match the refractive index of the medium, making it difficult to view using brightfield microscopy. Additionally, this species has not been successfully cultured in the laboratory on an artificial medium therefore, diagnosis depends upon successful identification using microscopic techniques and serology (analysis of body fluids, often looking for antibodies to a pathogen). Since fixation and staining would kill the cells, darkfield microscopy is typically used for observing live specimens and viewing their movements. However, other approaches can also be used. For example, the cells can be thickened with silver particles (in tissue sections) and observed using a light microscope. It is also possible to use fluorescence or electron microscopy to view Treponema (Figura 10).

Figure 10. (a) Living, unstained Treponema pallidum spirochetes can be viewed under a darkfield microscope. (b) In this brightfield image, a modified Steiner silver stain is used to visualized T. pallidum spirochetes. Though the stain kills the cells, it increases the contrast to make them more visible. (c) While not used for standard diagnostic testing, T. pallidum can also be examined using scanning electron microscopy. (credit a: modification of work by Centers for Disease Control and Prevention credit b: modification of work by Centers for Disease Control and Prevention credit c: modification of work by Centers for Disease Control and Prevention)

In clinical settings, indirect immunofluorescence is often used to identify Treponema. A primary, unstained antibody attaches directly to the pathogen surface, and secondary antibodies “tagged” with a fluorescent stain attach to the primary antibody. Multiple secondary antibodies can attach to each primary antibody, amplifying the amount of stain attached to each Treponema cell, making them easier to spot (Figure 11).

Figure 11. Indirect immunofluorescence can be used to identify T. pallidum, the causative agent of syphilis, in a specimen.


Lab 4: Acid-Fast, Spores, and Capsule Stains - Biology

Before staining, the specimen must be mounted and fixed on the slides, as previously done in the simple staining technique. Because of the 2 dyes used in the procedure–crystal violet and safrinin—as well as the decolorizer acetone-alcohol, bacteria will fall into 2 groups based on their gram reactivity. Gram positive bacteria retain the crystal violet even through the decolorizor step: gram negative bacteria do not retain the crystal violet, are decolorized, and then pick up the safrinin dye. Both gram + and – bind to the crystal violet: the key step to their differentiation is the decolorization.

Take a look at the accompanying diagram of the stain procedure and its effects on the bacterial color. During the crystal violet-iodine step, the bound molecules within the peptidoglycan of the gram + cell wall and within the membrane are held tightly. The acetone-alcohol actually causes the peptidoglycan molecules (arranged in a latticework) to shrink, thereby holding the crystal violetiodine even tighter. In the gram – cell, the outer lipopolysaccharide layer of the wall is dissolved by the decolorizer agents, and because the peptidoglycan layer is so thin in that group of bacteria, the crystal violet is leached out of the wall.

Although there is a standard routine and set reagents used in this stain, each person has to find a particular method that works best for them. The many variables that can affect this stain are age of the culture, amount of decolorizer used, the time of decolorization, the type of organism (acid-fast bacteria and spores do not stain well), thickness of the smear, and the general care of the stainer.


Ver el vídeo: Técnicas básicas de Microbiología: Tinción de endosporas (Agosto 2022).