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Regulación de la estructura de la cromatina.

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Recientemente, revisé los diferentes niveles de estructura de la cromatina. El nivel primario son los nucleosomas, donde el ADN está unido a las histonas y tiene una similitud estructural con las "cuentas en una cuerda". El nivel secundario es una fibra de 30 nm y el nivel terciario se forma enrollando radialmente las fibras.

También he estado aprendiendo sobre el código de las histonas y cómo las diferentes modificaciones de las histonas centrales se relacionan con la regulación transcripcional. ¿Son estas modificaciones el mecanismo de regulación principal de la estructura de la cromatina? En otras palabras, ¿la cromatina asume la estructura más compacta posible hasta que se realizan modificaciones de histonas para permitir la transcripción? ¿O se han descubierto y caracterizado otros mecanismos reguladores no relacionados con la transcripción?


"¿Son estas modificaciones el mecanismo de regulación principal de la estructura de la cromatina?"

Depende de cómo defina primario, actualmente podríamos pensar en las modificaciones de histonas como primarias porque otros mecanismos reguladores aún no se han estudiado bien. Otra cosa en la que puede pensar son las diversas proteínas reguladoras que interactúan con las marcas de histonas para modificar la cromatina.

No creo que deba imaginarse que la cromatina asume "la estructura más compacta posible hasta que se realicen modificaciones de histonas para permitir la transcripción", sino que las modificaciones de histonas son un proceso dinámico con varios factores de transcripción (una clase de proteínas) que ingresan y agregan / eliminan marcas de histonas, así como 'cromatina remodeladora' (agregar / eliminar nucleosomas)

Como nota al margen, no creo que se sepa mucho sobre la etapa terciaria que mencionaste inicialmente, así que tal vez eso podría jugar un papel muy importante en los mecanismos reguladores de la estructura de la cromatina, simplemente no se ha explorado bien.


Regulación de la estructura de la cromatina y la expresión génica

El objetivo a largo plazo de mi laboratorio es obtener una comprensión molecular de los procesos epigenéticos que regulan la estructura de la cromatina y la expresión génica. Con este fin, hemos identificado una nueva quinasa en tándem en Drosophila, JIL-1, que se localiza específicamente en las regiones interbandas genéticamente activas de los cromosomas politeno larvarios, fosforila la histona H3S10 y se enriquece casi dos veces en la larva masculina transcripcionalmente hiperactiva. cromosoma X politeno. En los hipomorfos de JIL-1, las regiones interbandas ordenadas de los cromosomas politénicos se rompen y los brazos cromosómicos están muy condensados. La variación del efecto de posición (PEV) en Drosophila ha servido como un paradigma importante para la identificación y el análisis genético de los determinantes conservados evolutivamente de la regulación epigenética de la estructura de la cromatina y el silenciamiento génico, y proporcionamos evidencia de que los alelos con pérdida de función de la histona JIL-1 La quinasa H3S10 puede actuar como supresores o potenciadores de PEV dependiendo del entorno de cromatina del locus informador. Estos efectos sobre el PEV se correlacionaron con la propagación de los principales marcadores de heterocromatina dmH3K9 y HP1 a ubicaciones ectópicas en los brazos cromosómicos con la regulación al alza más pronunciada encontrada en los cromosomas X masculino y femenino. Con base en estos hallazgos, proponemos un modelo en el que la actividad de la quinasa JIL-1 y la fosforilación de la histona H3S10 en la interfase funcionan para antagonizar la heterocromatización mediante la regulación de un equilibrio dinámico entre los factores que promueven la represión y la activación de la expresión génica.

El silenciamiento de genes es un proceso de desarrollo crítico relevante para muchos problemas de salud humana que incluyen el cáncer. Además, JIL-1 es el homólogo de Drosophila de la quinasa MSK1 de mamífero que también funciona como regulador de la estructura de la cromatina al fosforilar el residuo de histona H3S10. En la actualidad, los estudios en mamíferos se han dirigido a analizar la fosforilación de histonas en el contexto de la transcripción génica temprana inmediata. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que el concepto de fosforilación de histonas debería ampliarse para ser considerado en el contexto de la regulación del silenciamiento génico también. Por lo tanto, nuestros estudios servirán para proporcionar conocimientos generales sobre los mecanismos moleculares de cómo la actividad de la quinasa modula la estructura de la cromatina y la regulación de genes que son directamente relevantes para los seres humanos.


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Principios del vínculo metabólico con la epigenética.

A pesar de los desafíos para comprender completamente las funciones dependientes del contexto del eje metabolismo y la epigenética y la complejidad de las vías metabólicas y las modificaciones de la cromatina reguladas por ellas, existen varios principios universales que subyacen a esta conversación cruzada, que demuestran el surgimiento evolutivo de mecanismos moleculares específicos. que facilitan la dinámica epigenómica bajo alteraciones metabólicas.

La capacidad de las modificaciones epigenéticas para responder a las fluctuaciones en las actividades metabólicas es una consecuencia de los parámetros termodinámicos y cinéticos intrínsecos de las enzimas modificadoras de la cromatina (Cuadro 1). La adición y eliminación de la mayoría de estas modificaciones son catalizadas por enzimas (es decir, & # x02018writers & # x02019 y & # x02018erasers & # x02019) que utilizan metabolitos como sustratos o cofactores (es decir, metabolitos modificadores de la cromatina (Figura 1)). Enzimas modificadoras de cromatina que utilizan sustratos de metabolitos cuyas concentraciones fisiológicas son cercanas o inferiores a las enzimas & # x02019 intrínseca Kmetro y KD valores [GRAMO] son más susceptibles a alteraciones de la vía metabólica que aquellos cuyos sustratos están presentes en cantidades excesivas 13. Así, esta propiedad permite que las fluctuaciones metabólicas influyan en las actividades de ciertas enzimas modificadoras de la cromatina y modulen los niveles de modificaciones epigenéticas específicas, y la diferencia en las disponibilidades de sustrato y los valores de Km puede determinar la sensibilidad relativa de las modificaciones epigenéticas a las alteraciones metabólicas 24,25 (Recuadro 1 ). Por otro lado, también se pueden añadir modificaciones de cromatina de forma no enzimática, cuyas propiedades cinéticas y termodinámicas detalladas están menos bien caracterizadas pero están influenciadas en cierta medida por la ley de acción de masas.

La abundancia de metabolitos modificadores de la cromatina está regulada intracelularmente por varios mecanismos. Los metabolitos captados por las células pueden difundirse pasiva o activamente a través del plasma y la membrana nuclear para modificar la cromatina. Alternativamente, los metabolitos pueden procesarse internamente mediante la actividad de enzimas metabólicas que los convierten en sustratos o cofactores para las enzimas remodeladoras de la cromatina. Estas enzimas también pueden trasladarse al núcleo donde pueden producir localmente sustratos para la modificación de la cromatina. La consecuencia resultante de la abundancia de metabolitos sobre la tasa de modificación de la cromatina depende de los parámetros cinéticos y termodinámicos de la enzima. Las enzimas con relaciones iniciales [S] / Km en la parte lineal resaltada de la curva mostrada son más susceptibles a perturbaciones en las concentraciones de sustrato & # x02014, estas incluyen metiltransferasas y acetiltransferasas, entre otras. Finalmente, una vez que se han depositado las modificaciones, las proteínas efectoras pueden reconocerlas y unirlas utilizando módulos de unión a proteínas específicos, sobre los cuales determinan una variedad de destinos intracelulares, incluida la regulación de la homeostasis, el desarrollo, la regulación inmunitaria y la tumorigénesis.

Recuadro 1:

Propiedades cinéticas y termodinámicas de las enzimas modificadoras de la cromatina

Las velocidades de las reacciones enzimáticas dependen de muchos factores, incluidos los parámetros enzimáticos intrínsecos, como el número de rotación y la constante de Michaelis & # x02013Menten (Kmetro) valores, abundancia de enzimas, sustratos, cofactores y activadores o inhibidores alostéricos, y otros factores ambientales como pH, temperatura y viscosidad local. Estas variables juntas determinan la velocidad de reacción global a través de una relación cuantitativa que depende del mecanismo molecular de la reacción enzimática 236. Los estudios que describen la bioquímica y la biología estructural de las enzimas modificadoras de la cromatina han proporcionado conocimientos cruciales sobre sus mecanismos catalíticos y reguladores. Los mecanismos cinéticos de las enzimas implicadas en la metilación del ADN, la acetilación de histonas y la metilación de histonas se han investigado exhaustivamente, especialmente cuando se trata de cuestiones relacionadas con el desarrollo de fármacos, lo que demuestra que el mecanismo catalítico exacto de cada enzima modificadora de la cromatina es diverso y en gran medida dependiente del contexto (ver la figura). ). Por ejemplo, las histonas acetiltransferasas PCAF y GCN5 exhiben un mecanismo catalítico ternario ordenado en el que la acetil-CoA se une a la enzima antes que el péptido histona, que es seguido por la liberación de histona acetilada y finalmente, la molécula de CoA 237 & # x02013239. Por el contrario, p300 y HAT8 funcionan a través de un mecanismo de ping-pong que comienza con la unión de acetil-CoA y termina con la liberación de la histona acetilada 240,241. Finalmente, se observó una cinética ternaria aleatoria en la histona de levadura acetiltransferasa Rtt109 242.

Dada la diversidad en los mecanismos catalíticos de las enzimas modificadoras de la cromatina y la variabilidad en los parámetros cinéticos enzimáticos específicos, es probable que las modificaciones epigenéticas muestren especificidad debido a estos diferentes mecanismos. Las propiedades termodinámicas y cinéticas de las modificaciones epigenéticas dependen del tipo de modificación, la enzima modificadora de cromatina correspondiente, el locus genómico específico y la abundancia de reguladores y cofactores alostéricos. Esta variabilidad da como resultado una dinámica distinta de deposición y recambio en respuesta a las perturbaciones del metabolismo. Dirigirse directamente a estas modificaciones epigenéticas ha demostrado que la dinámica de la acetilación de histonas es en general más rápida que los cambios en la metilación del ADN y las histonas 243, y que la acetilación y desacetilación ocurren en una escala de tiempo de minutos. en vivo 244.245. La metilación de histonas y ADN, por otro lado, son más estables en comparación con la acetilación, que podría constituir un tipo de memoria epigenética en respuesta a perturbaciones más fuertes pero transitorias 243. Una capa adicional de complejidad surge de la afinidad heterogénea y la actividad de los modificadores de cromatina hacia diferentes modificaciones de cromatina 246 y diferentes loci genómicos 247, 248. Variación en la abundancia de metabolitos modificadores de la cromatina y K aparentemetro Por tanto, los valores en diferentes células y tejidos podrían conducir a una heterogeneidad en la sensibilidad de las marcas epigenéticas a las alteraciones metabólicas en diferentes contextos.

Existen varios mecanismos adicionales que permiten la regulación eficiente y precisa de las modificaciones de la cromatina catalizadas por enzimas mediante la actividad metabólica. Enzimas metabólicas implicadas en la síntesis de metabolitos modificadores de la cromatina, como acetil-CoA y S-adenosilmetionina (SAM), puede ser capaz de localizarse en el núcleo e interactuar con nucleosomas y enzimas modificadoras de cromatina para producir eficientemente metabolitos en loci genómicos específicos 26 & # x0201332. Los niveles de metabolitos modificadores de la cromatina, como SAM, están controlados por múltiples mecanismos que incluyen tanto aportes ambientales como la disponibilidad de nutrientes y sumideros intracelulares de grupos metilo. [GRAMO] que consumen SAM 33 & # x0201335. Los sumideros de grupos metilo están mediados por enzimas que metabolizan SAM, lo que les permite desviar los grupos metilo de enzimas como las histonas metiltransferasas, lo que afecta su actividad. Estos mecanismos proporcionan vías para el control de los niveles de metabolitos y, por lo tanto, para que la cromatina detecte el estado metabólico intracelular.

Las modificaciones epigenéticas influyen en los programas transcripcionales a través de varios mecanismos (Cuadro 2). Todos estos resultados pueden verse potencialmente influenciados por la regulación metabólica del epigenoma. Además, estudios recientes han encontrado que los compartimentos de cromatina con diferente actividad transcripcional pueden segregarse en orgánulos sin membrana a través de la separación de fases líquidas y líquidas. [GRAMO] en respuesta a las modificaciones de la cromatina, estableciendo distintos dominios de cromatina con distintos patrones de regulación. La heterocromatina transcripcionalmente inactiva puede formar gotitas líquidas separadas en fases interactuando con la proteína heterocromatina 1 (HP1) que reconoce y se une a la modificación de histona H3K9me, permitiendo que la cromatina se condense de manera estable dentro de estas gotitas 36 & # x0201338. Por otro lado, las regiones de cromatina activa, como las que contienen acetilación de histonas, potenciadores [GRAMO] y superpotenciadores [GRAMO] , también pueden separarse en fases mediante la interacción con proteínas de unión como el bromodominio [GRAMO] que contienen proteínas 39 & # x0201341. También se ha encontrado que efectos similares que promueven la separación de fases están mediados por la interacción entre norte 6-metiladenosina (m 6 A) en el ARNm y las proteínas YTHDF de unión a m 6 A 42. Aunque es una cuestión abierta si la separación de fases de la cromatina está regulada por el metabolismo, estos hallazgos sugieren que la capacidad de la cromatina para separarse en fases dentro de las células puede estar regulada por modificaciones epigenéticas derivadas de metabolitos y podría ser sensible al metabolismo celular. Además, se ha demostrado que la separación de fases de otras biomoléculas concentra moléculas en una determinada fase para activar los procesos de señalización bioquímica 43. Se desconoce si la separación de fases de cromatina también da como resultado la localización de metabolitos y la activación o inhibición de reacciones de modificación de cromatina en una fase específica, pero potencialmente sirve como un mecanismo adicional para el control preciso de los niveles de metabolitos locales y modificaciones de cromatina.

Recuadro 2:

Influencias de las modificaciones epigenéticas en la estructura de la cromatina y la expresión génica

Las primeras pistas que sugieren las consecuencias funcionales de modificaciones epigenéticas particulares son su enriquecimiento específico del locus y su asociación con los niveles de expresión génica y la regulación génica. Aunque no implican de manera concluyente causalidad, estos hallazgos se han utilizado para teorizar sobre la existencia de un & # x02018histone code & # x02019, que postula que la presencia y combinación de modificaciones específicas de ADN e histonas se vinculan con la regulación de programas transcripcionales y eventos de expresión génica 249 . Los estudios realizados en las últimas décadas han revelado dos formas principales para que las modificaciones epigenéticas regulen la expresión génica: cambiando la estructura de la cromatina local o influyendo en el reclutamiento de efectores de proteínas no histonas a la cromatina 250. La cromatina se puede clasificar aproximadamente en dos categorías según sus propiedades estructurales y bioquímicas: heterocromatina condensada, transcripcionalmente silenciada y eucromatina descondensada y transcrita activamente. La formación de heterocromatina y eucromatina depende de la existencia de modificaciones epigenéticas. La acetilación de histona, típicamente enriquecida en eucromatina, es capaz de neutralizar la carga positiva del residuo de lisina modificado, interrumpiendo así la interacción entre la histona y el ADN y dando como resultado una estructura de cromatina abierta que facilita la transcripción activa. La heterocromatina está típicamente enriquecida con la trimetilación de la histona 3 lisina 9 (H3K9me3), que está unida por la proteína heterocromatina 1 (HP1) que promueve la compactación y propagación de la heterocromatina 251 y desencadena la separación de fases líquidas y líquidas mediante la formación de oligómeros 38.

Las afinidades de unión a cromatina de una plétora de proteínas, incluidos factores de transcripción, remodeladores de cromatina y componentes de la maquinaria de transcripción, pueden modularse mediante estas modificaciones. Esto se demuestra mejor por la presencia de módulos & # x02018reader & # x02019 de unión a cromatina en estas proteínas, como los cromodominios y los dedos PHD que reconocen y se unen a histonas metiladas, y los dominios bromodominios y dominios YEATS que se unen a histonas acetiladas 252,253. Se ha planteado la hipótesis de que la asociación entre H3K4me3 y la transcripción activa está mediada en gran medida por la unión de H3K4me3 por el dedo PHD de la subunidad TAF3 de TFIID, un componente del complejo de preiniciación de la ARN polimerasa 254. Recientemente se ha demostrado que la metilación del ADN reduce la afinidad de unión de la mayoría de los factores de transcripción al tiempo que promueve la unión de proteínas que contienen PHD a través de interacciones hidrofóbicas con la citosina metilada 255. Los lectores de algunas de las modificaciones de histonas no canónicas emergentes, como la succinilación 116 y la crotonilación 256,257, también se han identificado recientemente 258.


Cromatina

Células germinales en profase de meiosis I de un hermafrodita him-8. Los cromosomas X sin sintetizar están enriquecidos en H3K9me2 (puntas de flecha). H3K9ac está enriquecido en autosomas.

El silenciamiento meiótico de la cromatina desapareada es un fenómeno generalizado que se ha descrito en muchos organismos vertebrados e invertebrados. En C. elegans, como en otras especies, los cromosomas no apareados acumulan un alto nivel de modificaciones represivas de la cromatina que no se observan en los cromosomas sinápticos. Por ejemplo, el cromosoma X masculino acumula un alto nivel de dimetilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9me2), al igual que los hermafroditas X que no logran hacer sinapsis debido a la mutación (ver figura). Esta modificación de histona ampliamente conservada se asocia con el ensamblaje de la estructura de cromatina cerrada y la represión transcripcional. Nuestros objetivos son comprender los mecanismos mediante los cuales se reconoce y silencia la cromatina desapareada durante la meiosis e identificar los objetivos cromosómicos del silenciamiento meiótico.

Hemos demostrado que una rama del C. elegansLa pequeña red de ARN funciona regulando la acumulación y distribución de H3K9me2 meiótico. Los componentes de esta vía incluyen la ARN polimerasa dirigida por ARN, EGO-1, y la proteína Argonaute / Slicer, CSR-1. MET-2 es la histona metiltransferasa responsable de la acumulación de H3K9me2 en la línea germinal. Estamos trabajando para comprender cómo la actividad de la vía del ARN pequeño EGO-1 / CSR-1 influye en la actividad de MET-2 para dirigirla hacia los cromosomas sin sinapsis.

Células germinales en profase de meiosis I de machos mutantes de tipo salvaje y ego-1. H3K9me2 está enriquecido en el cromosoma X en tipo salvaje (flechas) pero no en el macho ego-1.

C. elegans proporciona un sistema incomparable para estudiar el mecanismo del silenciamiento meiótico en el contexto del desarrollo de la línea germinal. los C. elegans La línea germinal ha demostrado ser un modelo excelente para estudiar la regulación genética y las cuestiones del desarrollo. Amplias herramientas genéticas disponibles en C. elegans nos permiten estudiar la maquinaria de silenciamiento meiótico y abordar cuestiones más amplias sobre el papel del silenciamiento meiótico en el desarrollo y la función de la línea germinal. Un enfoque de nuestro trabajo actual es identificar factores adicionales que actúan junto con MET-2 y / o la vía EGO-1 / CSR-1 para regular la acumulación de H3K9me2. Otro enfoque es identificar los sitios donde las modificaciones de H3K9me2 se depositan en cromosomas no apareados. Al comprender el mecanismo y los objetivos de la acumulación de H3K9me2, estaremos en condiciones de investigar las implicaciones de este proceso en el desarrollo. Esperamos que nuestros resultados faciliten el estudio del silenciamiento meiótico en animales más complejos, incluidos los mamíferos.


PERSPECTIVAS Y CONCLUSIÓN

Nuestras estructuras crio-EM 3D a una resolución de 11 Å han proporcionado las características estructurales fundamentales de la elusiva fibra de cromatina de 30 nm y una base sólida para comprender el principio básico de la compactación de cromatina, mientras que las estructuras de mayor resolución de la fibra de cromatina son necesarias para descubrir mucho más detalles estructurales para las interacciones nucleosoma-nucleosoma, nucleosoma-H1 y H1-H1 en las fibras de cromatina. Además, nuestras estructuras crio-EM implican claramente la presencia de tres interfaces de interacción importantes en la fibra de 30 nm, mientras que aún no está claro cómo estas interfaces están reguladas por diferentes factores de cromatina. Con respecto a la variación de los NRL in vivo, las fibras de cromatina reconstituidas con una combinación de diferentes NRL también serán buenos candidatos para estudios de molécula única y crio-EM en el futuro. Estos estudios adicionales no solo mejorarán nuestra comprensión de la diversidad de estructuras de cromatina in vivo, sino que también proporcionarán una base estructural para cómo se pueden coordinar diferentes combinaciones de secuencias de ADN, NRL, variantes de histonas, modificaciones de cromatina y proteínas arquitectónicas de cromatina para regular con precisión los factores biológicos. función del ADN genómico en el núcleo.

Sigue siendo un misterio si los resultados estructurales de los estudios in vitro pueden representar la estructura real de las fibras de cromatina in situ. Por lo tanto, la organización tridimensional de las fibras de cromatina en los núcleos intactos debe estudiarse más a fondo mediante el uso de técnicas desarrolladas recientemente. Las fibras de cromatina bien caracterizadas reconstituidas in vitro, incluidas las fibras compactadas de 30 nm y las matrices nucleosómicas abiertas, serían referencias estructurales perfectas para analizar la organización 3D de las fibras de cromatina in situ en estos estudios. La combinación de crio-EM con técnicas de imágenes de fluorescencia de superresolución se ha desarrollado recientemente para visualizar y cuantificar la ultraestructura de las células crioconservadas (Chang et al. 2014 Liu et al. 2015). La combinación de técnicas de obtención de imágenes basadas en enfoques genómicos (como micro-C y RICC-seq) y CRISPR (repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada) puede permitirnos sondear la ultraestructura y la organización 3D de la fibra de cromatina en regiones genómicas definidas en la zona intacta. núcleos. Sin duda, se pueden obtener más detalles estructurales para la organización 3D de las fibras de cromatina in situ mediante la aplicación de estas técnicas de imagen avanzadas en el futuro.


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Temas actuales en biología del desarrollo. Vol. 56 2003. pág. 55-83 (Temas actuales en biología del desarrollo vol. 56).

Resultado de la investigación: Capítulo en libro / Informe / Acta de congreso ›Capítulo

T1 - Regulación de la estructura de la cromatina y la actividad genética por las polimerasas poli (ADP-ribosa)

N2 - La poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) es una proteína nuclear abundante que juega un papel importante en la reparación del ADN y en la respuesta a la infección. Aquí revisamos la evidencia reciente de que PARP1 y las proteínas relacionadas también llevan a cabo funciones cruciales que regulan los genes durante el desarrollo normal. Los estudios genéticos en mamíferos y Drosophila han implicado que las PARP median respuestas rápidas a los estímulos ambientales, incluidas la infección, el estrés, las hormonas y las señales de crecimiento. Además, estas polimerasas pueden controlar procesos fundamentales que moldean y remodelan diferencialmente la cromatina dentro de los muchos tipos de células de un embrión en desarrollo. Discutimos un mecanismo unificado de acción de PARP durante la reparación del ADN, la transcripción de genes y la modulación de la cromatina.

AB - La poli (ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1) es una proteína nuclear abundante que desempeña un papel importante en la reparación del ADN y en la respuesta a las infecciones. Aquí revisamos la evidencia reciente de que PARP1 y las proteínas relacionadas también llevan a cabo funciones cruciales que regulan los genes durante el desarrollo normal. Los estudios genéticos en mamíferos y Drosophila han implicado que las PARP median respuestas rápidas a los estímulos ambientales, incluidas infecciones, estrés, hormonas y señales de crecimiento. Además, estas polimerasas pueden controlar procesos fundamentales que moldean y remodelan diferencialmente la cromatina dentro de los muchos tipos de células de un embrión en desarrollo. Discutimos un mecanismo unificado de acción de PARP durante la reparación del ADN, la transcripción de genes y la modulación de la cromatina.


Metilación de ADN dirigida por ARN

Steven E. Jacobsen es investigador del Instituto Médico Howard Hughes y profesor de Biología del Desarrollo y Células Moleculares en la Universidad de California, Los Ángeles, EE. UU. Su investigación se centra en los mecanismos de herencia epigenética en las plantas, incluida la genética y la genómica de la metilación del ADN, la metilación de histonas y las pequeñas vías de silenciamiento impulsadas por el ARN. Con más de 130 publicaciones relacionadas con la epigenética, hizo contribuciones fundamentales a este campo emergente de investigación.

Jacobsen dio una conferencia sobre la vía de metilación del ADN dependiente de ARN (RdDM) que Arabidopsis thaliana se utiliza para mantener y probablemente establecer la metilación del ADN de citosina para silenciar genes y transposones. Si bien las bien estudiadas ADN metiltransferasas MET1, CMT3 y DRM2 son responsables de mantener patrones de metilación preestablecidos a través de mecanismos clásicos, aparentemente DRM2, un homólogo de Dnmt3 & # 8211 de mamíferos, es el único que media RdDM. El reclutamiento de DRM2 al sitio de ADN respectivo está mediado por una interacción compleja de la polimerasa IV (PolIV), la polimerasa V (PolV), las especies de ARN producidas por ellas y muchos otros factores.

Dado que la unión al ADN de PolIV y PolV no muestra ninguna especificidad de secuencia significativa, es más probable que las marcas epigenéticas representen sus sitios de reconocimiento. Se demostró que PolIV interactúa con SHH1, que se une a H3K9me, una marca de silenciamiento que se encuentra con frecuencia en los sitios RdDM, mientras que la interacción indirecta de PolV con SUVH2 lo dirige al ADN metilado. Mediante la fusión de SUVH2 con un dominio de dedo de zinc dirigido a un epialélico no metilado del factor de transcripción homeodominio FWA, el laboratorio de Jacobsen demostró que SUVH2 es suficiente para reclutar PolV, establecer la metilación del ADN y finalmente causar el silenciamiento génico.

Mecánicamente, PolV y PolV asociados con sitios RdDM producen ARNip e lncRNA de 24 nucleótidos, respectivamente. Estos ARN interactúan con una serie de factores adicionales como AGO4 para establecer una red muy compleja que finalmente da como resultado el reclutamiento de DRM2 para preservar los patrones de metilación existentes. Curiosamente, existe una estrecha interdependencia entre tales marcas de metilación y otras modificaciones epigenéticas como, por ejemplo, la metilación de histonas, que genera bucles de refuerzo robustos. Sin embargo, no está claro cómo se lleva a cabo el establecimiento inicial de RdDM.


Abstracto

Los factores de transcripción pioneros desempeñan un papel principal en el establecimiento de la competencia para la expresión génica y en el inicio de la programación y reprogramación celular, y su desregulación causa efectos graves en la salud humana, como la promoción de la tumorigénesis. Aunque se expresan más de 200 factores de transcripción en cada tipo de célula, solo se necesita una pequeña cantidad de factores de transcripción para provocar cambios dramáticos en el destino celular en el desarrollo embrionario y la conversión del destino celular. Entre estos factores de transcripción clave, un subconjunto llamado "factores de transcripción pioneros" tiene una capacidad notable para dirigirse al ADN nucleosómico, o cromatina cerrada, en las primeras etapas del desarrollo, lo que a menudo conduce a la apertura local de la cromatina, lo que establece la competencia para la expresión génica. Aunque se han identificado más factores de transcripción clave como factores de transcripción pioneros, los mecanismos moleculares detrás de sus propiedades especiales apenas comienzan a revelarse. Comprender los mecanismos pioneros mejorará nuestra capacidad para controlar con precisión el destino de las células a voluntad con fines terapéuticos y de investigación.

  • Mecanismos biológicos y destinos de células gt
  • Mecanismos biológicos y biología reguladora gt
  • Biología del desarrollo y linajes gt

8.4: Genes y cromatina en eucariotas

  • Contribución de Gerald Bergtrom
  • Profesor emérito (biociencias) en la Universidad de Wisconsin-Milwaukee

Los cromosomas y la cromatina son una asociación eucariota única de ADN con más o menos proteína. El ADN bacteriano (y el ADN procariótico en general) está relativamente "agitado" y no está asociado visiblemente con la proteína.

La micrografía electrónica de un interfase celda (abajo) revela que la cromatina en sí misma puede existir en varios estados de condensación.

La cromatina se condensa al máximo durante la mitosis, formando cromosomas. Durante la interfase, la cromatina existe en formas más o menos condensadas, llamadas Heterocromatinay eucromatinarespectivamente. La transición entre estas formas de cromatina implica cambios en las cantidades y tipos de proteínas unidas a la cromatina, y esto puede ocurrir durante la regulación de genes, es decir, cuando los genes se activan o desactivan. Los genes activos tienden a estar en la eucromatina más dispersa para que las enzimas de replicación y transcripción tengan un acceso más fácil al ADN. Los genes que son inactivos en la transcripción son heterocromáticos, oscurecidos por proteínas de cromatina adicionales presentes en la heterocromatina. Veremos algunos experimentos que demuestran esto en un capítulo posterior.

Podemos definir tres niveles de organización de la cromatina en términos generales:

1. Se forma el ADN envuelto alrededor de las proteínas histonas nucleosomas en una estructura de & quot; cuentas en una cadena & quot.

2. Múltiples nucleosomas se enrollan (condensan), formando estructuras de fibra (solenoide) de 30 nm.

3. El empaquetamiento de orden superior de la fibra de 30 nm conduce a la formación de cromosomas en metafase que se observan en la mitosis y la meiosis.

Los niveles de estructura de la cromatina se determinaron en parte mediante el aislamiento selectivo y la extracción de la cromatina celular en interfase, seguido de la extracción química selectiva de los componentes de la cromatina. Los pasos son:

& middot Nuclei se aíslan primero de las células.

& middot La envoltura nuclear se rompió suavemente para no alterar físicamente la estructura de la cromatina.

& middot, la cromatina se puede extraer suavemente mediante uno de varios tratamientos químicos diferentes (alto contenido de sal, bajo contenido de sal, ácido).

Los niveles de estructura de la cromatina se ilustran a continuación.

La extracción de sal disocia la mayoría de las proteínas de la cromatina. Cuando se centrifuga un extracto bajo en sal y se resuspende el sedimento, la cromatina restante se ve como cuentas de un collar. Envuelto en ADN nucleosomas son las cuentas, que a su vez están unidas por longitudes uniformes de ADN metafórico y ldquostring y rsquo ( # 1 en la ilustración de arriba). Un extracto de cromatina con alto contenido de sal aparece como una espiral de nucleosomas, o Fibra de solenoide de 30 nm (# 2 encima). Otros protocolos de extracción revelaron otros aspectos de la estructura de la cromatina que se muestran en #s 3 y 4 encima. Los cromosomas que se ven en la metafase de la mitosis son el orden más alto y rsquo, la forma más condensada de cromatina.

El filamento de 10 nm de nucleosoma & lsquobeads-on-a-string & rsquo que queda después de una extracción baja en sal se puede ver en un microscopio electrónico como se muestra a continuación.

Cuando estos collares de nucleosomas fueron digeridos con la enzima desoxirribonucleasa (ADNasa), el ADN entre las & lsquobeads & rsquo se degradó, dejando filamentos de 10 nm acortados después de un período de digestión corto, o simplemente perlas individuales de las perlas después de una digestión más larga (abajo).

Roger Kornberg (hijo del premio Nobel Arthur Kornberg, quien descubrió la primera enzima de replicación de ADN polimerasa) participó en el descubrimiento y caracterización de nucleosomas cuando aún era un postdoctorado. La electroforesis del ADN extraído de estos digestiones reveló nucleosomas separados por un tramo de ADN & ldquolinker & rdquo de aproximadamente 80 pares de bases. El ADN extraído de los nucleosomas tenía aproximadamente 147 pares de bases de largo. Este es el ADN que se había envuelto alrededor de las proteínas del nucleosoma.

Después de separar todas las proteínas del ADN nucleosómico, se identificaron cinco proteínas (ilustradas a continuación).

Las histonas son proteínas básicas que contienen muchas lisina y arginina aminoácidos. Sus cadenas laterales cargadas positivamente permiten que estos aminoácidos se unan a los ácidos, cargados negativamente espina dorsal del fosfodiéster de ADN de doble hélice. El ADN se envuelve alrededor de un octamer de histonas (2 de cada 4 de las proteínas histonas) para formar el nucleosoma. Aproximadamente un gramo de histonas se asocia con cada gramo de ADN. Después de una extracción de cromatina con alto contenido de sal, la estructura visible en el microscopio electrónico es el solenoide de 30 nm, la bobina de nucleosomas modelada en la figura siguiente.

As shown above, simply increasing the salt concentration of an already extracted nucleosome preparation will cause the &lsquonecklace&rsquo to fold into the 30nm solenoid structure.

As you might guess, an acidic extraction of chromatin should selectively remove the basic histone proteins, leaving behind an association of DNA with non-histone proteins. This proved to be the case. An electron micrograph of the chromatin remnant after an acid extraction of metaphase chromosomes is shown on the next page.

DNA freed of the regularly spaced histone-based nucleosomes, loops out, away from the long axis of the chromatin. Dark material along this axis is a protein scaffolding that makes up what&rsquos left after histone extraction. Much of this protein is topoisomerase, an enzyme that prevents DNA from breaking apart under the strain of replication.


Ver el vídeo: Regulación de la Expresión Genética A nivel de la cromatina. (Agosto 2022).