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Óptica adaptativa en microscopía: ¿cuáles son los procesos más rápidos en la muestra que causan aberraciones ópticas?

Óptica adaptativa en microscopía: ¿cuáles son los procesos más rápidos en la muestra que causan aberraciones ópticas?



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Algunas empresas, p. Ej. el del ganador del premio Nobel Stefan Hell (Abberior) está ofreciendo mejoras de Óptica Adaptativa para microscopios para permitir un enfoque más profundo en muestras refractivas ópticamente cambiantes localmente. El principio subyacente está bastante bien explicado bajo las palabras clave "visión astronómica" u "óptica adaptativa".

Soy (no soy un biólogo y) me pregunto cómo rápido estos patrones locales de refracción diferente pueden cambiar en cualquier tarea de microscopía?


Microscopía de reconstrucción óptica estocástica de óptica adaptativa (AO-STORM) utilizando un algoritmo genético

La resolución de la microscopía de localización de una sola molécula (SML) depende del ancho de la función de dispersión puntual (PSF) y del número de fotones recolectados. Sin embargo, las muestras biológicas tienden a degradar la forma de la PSF debido a la heterogeneidad del índice de refracción. Además, existen aberraciones causadas por imperfecciones en los componentes ópticos y la alineación, y el desajuste del índice de refracción entre el cubreobjetos y la muestra, todo lo cual reduce directamente la precisión de SML. La óptica adaptativa (AO) puede desempeñar un papel fundamental en la compensación de aberraciones para aumentar la resolución. Sin embargo, la naturaleza estocástica de la emisión de una sola molécula presenta un desafío para la optimización del frente de onda porque las grandes fluctuaciones en la emisión de fotones no permiten el uso de muchas técnicas de optimización tradicionales. Aquí presentamos un enfoque que optimiza el frente de onda durante la adquisición de SML mediante la combinación de una función de mérito independiente de la intensidad con un algoritmo genético (GA) para optimizar el PSF a pesar de la intensidad fluctuante. Demostramos el uso de AO con GA en células de cultivo de tejidos y a través de

50 µm de tejido en el Drosophila Sistema Nervioso Central (SNC) para lograr un aumento de 4 veces en la precisión de localización.

© 2015 Sociedad Óptica de América


1. Introducción

Investigar la conectividad funcional entre neuronas en el cerebro es la clave para comprender muchas preguntas fundamentales en neurociencia. El registro de la actividad neuronal con indicadores de calcio codificados genéticamente como GCaMP [1] permite la observación no invasiva de múltiples respuestas neuronales, si se combina con un método microscópico adecuado. Sin embargo, la actividad de imágenes rápidamente en grandes volúmenes dentro de un cerebro vivo sigue siendo uno de los mayores desafíos en la microscopía de neurociencia [2, 3]. Las imágenes de microscopios de fluorescencia de fotón único de campo amplio pueden abarcar un gran número de neuronas, pero las células de interés no se encuentran necesariamente en un plano de imagen. Además, la naturaleza volumétrica del tejido neural significa que el fondo desenfocado a menudo inunda las señales utilizables. La microscopía de barrido de dos fotones se prefiere comúnmente para la obtención de imágenes en los tejidos neurales en dispersión, ya que proporciona un alto contraste, una penetración profunda, una mayor resistencia a la dispersión y una baja fototoxicidad para la muestra. Sin embargo, para compilar un volumen es necesario adquirir varias imágenes planas. La recopilación de datos de esta manera es lenta porque la muestra u objetivo debe moverse. El movimiento natural e inducido por imágenes de la muestra es problemático porque el plano de interés puede perderse fácilmente de la vista & # x02013 nuestras propias investigaciones han revelado traducciones frecuentes de varios micrómetros cuando se toman imágenes de neuronas en Drosophila cerebro. Los métodos de escaneo de hojas de luz de un solo objetivo podrían ser una solución, aunque la resolución y la eficiencia de recolección no son óptimas debido a la apertura numérica limitada [4]. La microscopía de campo de luz puede obtener imágenes de grandes volúmenes simultáneamente, pero se basa en un etiquetado escaso [5]. Los métodos de fluorescencia de dos fotones presentan la vía más prometedora para obtener imágenes funcionales rápidas de muestras densamente marcadas. Aquí hemos adoptado un nuevo enfoque para la obtención de imágenes rápidas de dos fotones & # x02013 microscopía de dos fotones con detección de actividad volumétrica (AO-VAST) basada en óptica adaptativa & # x02013 que está optimizada para la extracción de información de tejido neural denso.

Las velocidades de obtención de imágenes volumétricas se pueden aumentar evitando la necesidad de mover la muestra o el objetivo. Con este fin, se han empleado diversas técnicas de exploración óptica axial. El principio de enfoque remoto, que es común a todas estas técnicas volumétricas de alta velocidad, implica cambiar el plano de la imagen mediante la aplicación de una fase de desenfoque en la pupila del sistema óptico. Los métodos más rápidos disponibles se basan en la exploración acústico-óptica para el acceso aleatorio en 3D de múltiples puntos predefinidos dentro de la muestra [6, 7]. Alternativamente, la excitación multisitio basada en moduladores de luz espacial combinada con proyección de volumen puede usarse para monitorear simultáneamente un subconjunto de celdas de interés predefinidas [8]. Estos métodos están optimizados para el muestreo de múltiples puntos dispersos espacialmente, pero no son prácticos para imágenes de volumen completo. Además, el enfoque no es ideal, ya que las funciones de fase cuadrática introducidas por los escáneres acústico-ópticos no coinciden perfectamente con la fase requerida para un enfoque sin aberraciones esféricas. Se han utilizado sistemas que utilizan lentes emparejados y reenfoque basado en espejos pequeños para escanear en 3D a velocidades de línea de varios kHz con enfoque sin aberraciones, pero la velocidad sigue siendo limitada para volúmenes completos [9]. Otras técnicas incluyen lentes líquidas eléctricamente sintonizables [10], que son lentas y no proporcionan un enfoque libre de aberraciones, o lentes controladas por ultrasonidos [11], que nuevamente sufren aberraciones de enfoque y están limitadas al escaneo sinusoidal rápido. La microscopía AO-VAST proporciona una combinación de capacidades que no se pueden lograr con estas tecnologías existentes.


Resultados

Configuración experimental

En la figura 1 y la figura S1 se muestran una ilustración esquemática y una fotografía del wao SPIM. Para evitar la contaminación de la imagen de la muestra por la fluorescencia de las perlas utilizadas como estrellas artificiales, creamos una independencia espectral entre la imagen de la muestra y la imagen de las perlas fluorescentes. Como fuente de luz, utilizamos un lanzamiento de láser compacto (Errol) que comprende las salidas de tres láseres de estado sólido bombeados por diodos (491 nm, 532 nm y 595 nm) combinados por espejos dicroicos en un solo haz de longitud de onda múltiple. Un filtro sintonizable acústico-óptico de cuatro canales (AOTF) con un canal de supresión separado proporcionó un control preciso sobre la intensidad de iluminación de cada láser. La salida del AOTF se acopló en una fibra. La salida de la fibra fue colimada y expandida por un telescopio fijo (T1). Una lente cilíndrica (CL) enfocó la luz en un eje que estaba conjugado con el plano de la pupila posterior de la lente de iluminación (10 & # x000d7 NA 0.25, microsistema Leica de aire) por un telescopio (T2). Un objetivo de inmersión en agua (20 & # x000d7 NA 0.5 Leica Microsystem) recogió la luz emitida por las perlas fluorescentes y la muestra. Un telescopio (T3) sirvió para conjugar el plano pupilar posterior de este objetivo en un espejo deformable (DM) con 52 actuadores, un diámetro efectivo de 15 mm y una carrera de 50 & # x000b5m pico a valle en inclinación (mirao & # x02122 52- e Imagine Optic). Para medir el frente de onda directamente desde la muestra, colocamos un sensor HSWF en la ruta de detección de nuestra configuración SPIM. La DM se conjugó con el sensor HSWF, compuesto por una matriz de 32 microlentes de 3,6 mm de diámetro efectivo (HASO & # x02122 32 Imagine Optic). Como emisores de fuente puntual, utilizamos perlas fluorescentes de 2,5 & # x000b5m, que eran más pequeñas que el límite de difracción del sensor HSWF y que proporcionaban suficiente luz para reconstruir el frente de onda. El divisor de haz dicroico de un solo borde (D1, FF 520.Dio1.25 & # x000d736, Semrock) dirigió las emisiones de señal de 488 & # x02013512 nm al sensor HSWF y la señal de 528 & # x02013655 nm a un sistema de imagen de longitud de onda dual simultánea que cuenta con dos CCD dispositivos (ORCA-D2 Hamamastu). Además, esta cámara dual ofrece la ventaja de corregir automáticamente el cambio de enfoque axial entre ambas longitudes de onda. Se había colocado un filtro & # x0201cStop Line "(no se muestra) en la ruta de detección antes del sensor HSWF para rechazar la línea láser de 491 nm. También aprovechamos el hecho de que las perlas fluorescentes tenían un gran espectro de emisión de fluorescencia y El sensor HSWF y la cámara CCD2 pueden tomar imágenes simultáneamente. La cámara CCD1 tomó imágenes de la muestra, que se tiñó con otro fluoróforo. El portamuestras se puede mover en cualquier dimensión (x, y, z) mediante etapas totalmente motorizadas.

En nuestra configuración experimental (Fig. S1), una lente cilíndrica enfoca la luz a una línea horizontal (hoja de luz) que se refleja en el plano focal posterior de un objetivo de iluminación (10 & # x000d7 NA 0.25) (trayectoria amarilla). La muestra se coloca en la hoja de luz dentro de una cámara fisiológica llena de medio acuoso. La luz emitida se recoge (trayectoria roja) mediante un objetivo de inmersión (20 & # x000d7 NA 0,5) instalado en la cámara fisiológica. AOTF, filtro sintonizable acústico-óptico T1 & # x02013T3, telescopios M1 & # x02013M5, espejos CL, lente cilíndrica DM, espejo deformable D1 y D2, espejos dicroicos HSWF, Hartmann & # x02013 Sensor de frente de onda Shack B, sistema de lentes para DM-HSWF, pupila Lente de tubo CCD 1 y CCD2, dispositivos cargados acoplados.

Bucle AO

El procedimiento para la corrección del bucle AO comenzó colocando una perla fluorescente en el centro del campo de visión del objetivo de detección. Para medir correctamente el frente de onda, un diafragma permitió recoger la fluorescencia emitida solo por la perla seleccionada. Cuando se encendió el bucle AO, un algoritmo de bucle cerrado de software minimizó los errores del frente de onda analizando la señal del sensor HSWF y calculando la forma DM adecuada para compensar los frentes de onda medidos. En el algoritmo de circuito cerrado implementado en el software CASAO & # x02122, la información del sensor HSWF se descompone en los modos ortogonales del DM utilizando un algoritmo estándar de descomposición de valor singular. Se resuelve un problema de ecuaciones lineales simples para encontrar la mejor forma del espejo para compensar las aberraciones. En el caso del DM mirao & # x02122 52-e, debido a su linealidad, el sistema de ecuaciones se reduce a una simple resta. En nuestras condiciones experimentales, el sistema logró un ancho de banda de bucle cerrado efectivo de 5 Hz y se necesitaron una o dos iteraciones para converger en un frente de onda correcto. En el sistema wao SPIM, el divisor de haz dicroico D1 (Fig. 1) es uno de los elementos más críticos porque introdujo aberraciones, especialmente astigmatismo y aberraciones de coma. Antes de los experimentos, medimos estas aberraciones & # x0201cstatic "debido a la ruta no común entre el sensor HSWF y el CCD dual colocando el sensor HSWF en el plano focal de la cámara de imágenes (Fig. 2a) y luego compensamos estas aberraciones usando el sistema de bucle AO. El propósito de este paso fue establecer la forma DM de modo que corrija las aberraciones de la trayectoria de la imagen. Nos referiremos a esta forma DM como & # x0201c sin AO "en las siguientes secciones. Luego, al reposicionar el sensor HSWF en su trayectoria, se registró un frente de onda de referencia (Fig. 2b) que corresponde a las aberraciones diferenciales. La Figura 2c muestra el tercer y quinto orden de los coeficientes de Zernike para los frentes de onda mostrados en la Figura 2a y la Figura 2b. Como mencionamos antes, las aberraciones diferenciales entre el sensor HSWF y la trayectoria de la imagen son esencialmente astigmatismo, coma y trébol. Estas aberraciones se deben principalmente al divisor de haz dicroico D1. En el bucle cerrado AO, el frente de onda de referencia (Fig. 2b) se usó para apuntar a todas las aberraciones y el frente de onda medido inicial de la perla se usó para apuntar a la punta / inclinación.

(a) Frente de onda registrado en el plano focal de la cámara de imagen correspondiente a las aberraciones de la trayectoria de imagen. (b) Frente de onda registrado de referencia en la trayectoria del sensor HSWF después de la corrección de las aberraciones de la trayectoria de formación de imágenes correspondientes a las aberraciones diferenciales. (c) Gráfico que muestra el 3º y 5º orden de los coeficientes de Zernike de (a) y (b).

Rendimiento de waoSPIM

Para evaluar la capacidad del circuito cerrado de AO para corregir aberraciones sustanciales en SPIM, medimos la relación de Strehl (un indicador del rendimiento del sistema de circuito AO), aplicando la aproximación de Mar & # x000e9chal en varias condiciones experimentales que introdujeron aberraciones en el sistema ( Fig. 3 ). En primer lugar, se incrustaron perlas fluorescentes en un cilindro de agarosa 1 & # x00025 y se obtuvieron imágenes a profundidad (360 & # x000b5m) sin o con AO (Fig. 3 ab). En estas condiciones, la principal aberración fue esencialmente el astigmatismo. Cuando se encendió el AO, observamos un aumento de 40 & # x00025 en la intensidad de la señal. El error de frente de onda de raíz cuadrada media (RMS) fue de 0.042 & # x000b5m antes de la corrección y se redujo a 0.011 & # x000b5m después de la corrección (Fig. 3c). Los valores de ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) estaban cerca del límite de rendimiento de SPIM (Tabla 1). La relación Strelh mejoró de S& # x0200a = & # x0200a0.756 & # x000b10.04 (sem) a S& # x0200a = & # x0200a0.974 & # x000b10.004 (sem). En el segundo experimento, las perlas se incrustaron en agarosa y se tomaron imágenes a través del vidrio de un capilar (Fig. 3 de), que introdujo una variedad de aberraciones, incluyendo coma, astigmatismo y aberraciones esféricas (Fig. 3f). La imagen de las perlas se deformó por completo lateral y axialmente. AO restauró la imagen correcta de las perlas (Fig. 3e). La intensidad de la señal aumentó en 70 & # x00025 y se logró de nuevo un rendimiento limitado por difracción cercana (Tabla 1). El error de frente de onda RMS se redujo de 0.374 a 0.011 & # x000b5m (Fig. 3f). Después de la corrección, la relación de Strehl fue S& # x0200a = & # x0200a0.982 & # x000b10.001 (sem).

a, byc corresponden respectivamente al bosquejo de la geometría de las cuentas fantasma, las vistas de perfil y los mapas de frente de onda para las cuentas incrustadas en agarosa 1 & # x00025 y fotografiadas a una profundidad de 360 ​​& # x000b5m. d, eyf corresponden respectivamente al bosquejo de la geometría de las perlas fantasma, las vistas de perfil y los mapas de frente de onda para perlas incrustadas en 1 & # x00025 de agarosa y obtenidas a través del vidrio capilar a una profundidad de 350 & # x000b5m. Las imágenes se adquirieron sin (w / o AO) y con AO (AO) a una intensidad de excitación fija a 491 nm y un tiempo de exposición de 100 ms. (a, d) En los bocetos SH, portamuestras C, capilar. (b, e) Vistas de perfil sin (w / o AO) y con AO (AO) de las proyecciones de intensidad máxima xy y xz para perlas incrustadas en un cilindro de agarosa (b), o en agarosa obtenida a través de un vidrio capilar (e ). Barra de escala, 5 & # x000b5m. (c, f) Mapas de frente de onda correspondientes al frente de onda sin procesar menos el frente de onda de referencia registrado con la forma DM configurada para corregir las aberraciones de configuración óptica (sin AO) o con el bucle cerrado AO (AO), la escala de color corresponde al frente de onda error en & # x000b5m.

Tabla 1

AgarosaVidrio
sin AOAO sin AOAO
FWHM x (& # x000b5m)3.1642.8518.7543.24
FWHM y (& # x000b5m)3.0412.8759.5143.102
FWHM z (& # x000b5m)2.8852.9693.03.128
RMS (& # x000b5m)0.0420.0110.3740.011
Relación de Strelh0.7690.983n / A0.982
Media de la relación de Strelh (n & # x0003e10)0.7560.974n / A0.982

En ambos experimentos, la corrección de AO aumentó la intensidad de la señal y mejoró la FWHM lateral. Por el contrario, los valores de la FWHM axial no fueron mayores después de la corrección que antes. Este efecto podría explicarse por el hecho de que AO, en esta configuración óptica, no corrige la iluminación de la hoja de luz que define la resolución axial del sistema.

Estos datos muestran que wao SPIM es eficaz y puede corregir aberraciones sustanciales con precisión.

Mejora de la señal y el contraste al obtener imágenes en profundidad con la corrección AO

Los MCTS son modelos de cultivo en 3D [16] que presentan atractivas ventajas para investigar la influencia de las interacciones de células malignas durante la proliferación celular, sin embargo, plantean desafíos importantes para la obtención de imágenes por microscopía óptica. Con muestras biológicas tan gruesas y no transparentes, las aberraciones inducidas por la muestra son significativas (Fig. 4). Para definir la forma y la magnitud de las aberraciones introducidas por el MCTS, obtuvimos imágenes de perlas fluorescentes integradas durante el cultivo dentro del MCTS (Fig. 4a, b) y registramos sus mapas de frente de onda. Encontramos que los términos de astigmatismo, coma y trébol fueron las aberraciones dominantes inducidas por el MCTS (Fig. S2) y sus amplitudes aumentaron con la profundidad de la imagen en el MCTS (Fig. 4c). Para evaluar nuestra configuración de wao SPIM para mejorar la calidad de la imagen al corregir las aberraciones introducidas por el MCTS, obtuvimos imágenes de MCTS fijos grandes (400 & # x000b5m de diámetro) que expresaban de manera estable una proteína nuclear fluorescente, Histone H2B & # x02013HcRed. Como se muestra en la Fig. S3, el wao SPIM en la posición & # x0201cAO off "da resultados similares a los de un SPIM convencional [7] en términos de calidad de imagen y profundidad de penetración. Definimos una medida de contraste de imagen adecuada basada en el gradiente de la imagen (YO G) para comparar los efectos de la corrección AO sobre la calidad de la imagen. La imagen se ha dividido en cuadrados Regiones de interés (ROI) y el IG se ha determinado en cada ROI. Para muestrear correctamente los objetos estudiados, cada ROI no debe ser más de la mitad del tamaño del objeto. Debido a esto, el tamaño lateral de los ROI (norte) se ha establecido en 36 píxeles, que corresponde a la mitad del diámetro típico de un núcleo en la imagen. Para cada ROI, determinamos el IG de la siguiente manera:

dónde tu es la intensidad del ROI. Esta integral en la forma discreta se convierte en

donde (i, j) son los índices horizontal y vertical de cada píxel en cada ROI.

(a) Imágenes de luz transmitida de semillas de células con perlas verdes de 2,5 & # x000b5m (InSpeck Green, I-7219, Invitrogen) en una placa de 96 pocillos (imagen inferior). Después de 4 días en cultivo, estas células formaron un MCTS incorporando las perlas (imagen de abajo). (b) Proyección máxima de una pila tridimensional de 100 imágenes (espaciado z 1 & # x000b5m) de un MCTS que expresa una proteína nuclear fluorescente, H2B & # x02013HcRed y cultivado en presencia de perlas de fluorescencia verde como se muestra en (a). Los recuadros muestran vistas ampliadas de la cuenta fuera (izquierda) o dentro (derecha) del esferoide. Barra de escala, 2 & # x000b5m. (c) Vistas de perfil de las proyecciones de intensidad máxima x-y y x-z para cuentas, ya sea en el exterior (panel superior) o dentro del MCTS (panel inferior) fotografiadas a diferentes profundidades. Las imágenes se adquirieron a una intensidad de excitación fija a 491 nm y un tiempo de exposición de 100 ms. Las imágenes comparten la misma escala de intensidad. Barra de escala, 2 & # x000b5m.

Esta definición de IG proporciona una cuantificación de las variaciones dentro del ROI, que representa una cuantificación del contraste de la imagen. Por lo tanto, al usar este método, la mejora lograda se puede medir objetivamente como la relación entre cada ROI correspondiente.

Las imágenes obtenidas con AO eran mucho más brillantes y tenían mayor contraste que las imágenes adquiridas sin AO (Fig. 5 y Películas S1 y S2). Para el cordón, AO aumentó la intensidad en 40 & # x00025 y redujo el error de frente de onda RMS a 0.028 & # x000b5m (Fig. 5b, d). Los núcleos que no estaban bien resueltos sin AO se resolvieron cuando se aplicó el método (Fig. 6a). La ganancia de información está claramente ilustrada por imágenes de células mitóticas profundas en el MCTS, que se resolvieron bien con AO mientras que no se identificaron fácilmente sin ellas (Fig. 6 b & # x02013c). Además, la corrección AO también es efectiva en las capas más profundas del MCTS, hasta 200 & # x000b5m de profundidad (Fig. 6). Vale la pena señalar que esta mejora de la calidad de la imagen no se pudo obtener aumentando la potencia de excitación o el tiempo de exposición de la adquisición. La corrección AO proporcionó una mejora significativa en la intensidad de la señal y en el contraste de las imágenes. Esta mejora fue suficiente para realizar la segmentación de núcleos y la reconstrucción 3D desde el interior del MCTS (Fig. S4 y Películas S3 y S4).

Proyección máxima de una pila 3D de 100 imágenes (espaciado z 1 & # x000b5m) de un MCTS grande que expresa una proteína nuclear fluorescente, H2B & # x02013HcRed, sin (w / o AO) y con AO (AO). Barra de escala, 50 & # x000b5m. El asterisco marca la cuenta utilizada como emisor de fuente puntual ubicada a una profundidad de 150 & # x000b5m. Ambas imágenes se adquirieron utilizando la misma intensidad de excitación a 595 nm y un tiempo de exposición de 300 ms. (b) Vistas ampliadas de la cuenta. Barra de escala, 5 & # x000b5m. (c) Perfiles de intensidad a lo largo de las líneas 1 y 2 indicadas en (a). (d) Valores de relación FWHM (& # x000b5m), RMS y Strelh para imágenes de cuentas en (b). (mi) YO GROI mapeo de imágenes calculadas a partir de imágenes en (a) y YO GROI Imagen de proporción calculada como

dónde es mapeo de imágenes calculadas a partir de imágenes obtenidas con AO y es mapeo de imágenes calculadas a partir de imágenes obtenidas sin AO.

(a) Imágenes de planos individuales de núcleos y figuras mitóticas a varias profundidades dentro del MCTS resueltas con AO o no (sin AO). Las imágenes se adquieren utilizando la misma intensidad de excitación a 595 nm y el mismo tiempo de exposición (300 ms). Barra de escala 5 & # x000b5m. (b) El correspondiente YO GROI Imagen de proporción. (c) Los gráficos de intensidad correspondientes a lo largo de la línea indicada.


↵ ¶ A quién deben dirigirse las solicitudes de reimpresión. Correo electrónico: sedatmsg.ucsf.edu.

Este documento fue enviado directamente (Track II) a la oficina de PNAS.

↵ ‖ Tenga en cuenta que la ref. 29 contiene un error en cuanto al signo del cizallamiento DIC en su figura 4, lo que lleva a una afirmación incorrecta de que el núcleo tenía un índice de refracción más alto que el citoplasma; de hecho, el índice nuclear era más bajo en esa muestra. Este error corresponde únicamente a esa cifra y no afecta las conclusiones de ese estudio.


4. Conclusión

En este artículo, presentamos un método para determinar las fases correctivas con mayor precisión en la corrección COAT multidireccional para imágenes de fluorescencia de dos fotones. A diferencia del método convencional de determinación de fase correctiva en el que la señal de intensidad de fluorescencia de dos fotones detectada se sirve como señal de retroalimentación, nuestro método calcula la raíz cuadrada de la señal detectada como sustituto. De esta forma, se puede evitar el solapamiento preexistente entre los componentes de la frecuencia de modulación y sus interferencias, que provocarán la inexactitud de la determinación de la fase correctiva. Como demostraron los resultados, se puede lograr una mejor compensación de frente de onda utilizando nuestro método en cuanto a diferentes distorsiones de frente de onda. Para tejido cerebral de ratón de 450 μ m de espesor, el PBR del punto focal de excitación corregido usando nuestro método es mayor que el que usa el método convencional. Además, el contraste de imagen de la imagen de fluorescencia de dos fotones corregida también es mayor para el mismo medio de dispersión. Por lo tanto, es razonable concluir que el rendimiento de corrección de COAT múltiple puede mejorarse mediante nuestro método en imágenes de fluorescencia de dos fotones. También se puede emplear un método similar en la corrección COAT de múltiples imágenes multifotónicas de orden superior. Este método tiene el potencial de extender los usos de la corrección COAT multidireccional en imágenes de fluorescencia y encontrar muchas aplicaciones en investigaciones biológicas que requieren imágenes de alta calidad en las profundidades del tejido.


El principio de la estrella guía brinda una visión más clara del cerebro del embrión

El uso de un enfoque AO para eliminar el ruido y la distorsión en microscopía sigue siendo un desafío en muchas muestras, debido a las grandes amplitudes de las aberraciones del frente de onda involucradas y lo dependientes que pueden ser de la posición exacta dentro de la muestra.

Durante algún tiempo, Eric Betzig y los investigadores del HHMI han estado investigando una posible solución mediante el uso de estrellas guía, un principio ya perfeccionado y empleado por los astrónomos para ayudar a compensar la interferencia atmosférica.

En su encarnación astronómica, el método utiliza un láser para estimular una fuente de luz temporal y completamente artificial en la atmósfera superior. El monitoreo de la distorsión de esa luz por la atmósfera permite eliminar esas distorsiones de la luz entrante de los objetos astronómicos más lejanos.

El equipo del HHMI ha estado utilizando un principio similar en muestras biológicas, creando una estrella guía a pequeña escala a partir de un punto fluorescente aislado en los tejidos y luego obteniendo imágenes desde diferentes ángulos para evaluar las correcciones relevantes necesarias. Pero este proceso lleva mucho tiempo y expone la muestra a mucha luz.

Su nuevo sistema todavía utiliza la detección directa de la luz por frente de onda de una estrella guía, creada en un volumen diminuto de una muestra viva por excitación de dos fotones (TPE). Pero lo que es más importante, esta estrella guía no permanece estacionaria y, en cambio, se barre un pequeño volumen de la muestra utilizando espejos de exploración.

Una segunda clave para el nuevo avance es descanalizar la señal recopilada, una técnica establecida en microscopía de fluorescencia que devuelve la luz emitida a través del mismo par de espejos de escaneo, cancelando efectivamente el movimiento de escaneo. Esto permite muestrear la pendiente promedio del frente de onda sobre el volumen de exploración y determinar con precisión la aberración promedio.

Una nueva combinación
"Tanto la estrella guía de TPE como el descanning se han probado antes por separado, pero no juntos", comentó Eric Betzig a Optics.org. "Nuestra combinación trae muchos beneficios, lo más importante es que generalmente proporciona una corrección más precisa sobre el subvolumen que la corrección en un solo punto. Promedia los modos de orden extremadamente alto, que de otro modo pueden confundir al sensor de frente de onda Shack-Hartmann que determina la aberración."

También se hicieron evidentes otras ventajas, incluida la propagación de cualquier daño y blanqueamiento en un área más grande, y la eliminación de la necesidad de identificar y apuntar una característica intrínseca brillante de la muestra para que sirva como base para la corrección.

El equipo probó su sistema en los modos de excitación de dos fotones y de fluorescencia lineal-confocal, apuntando a un subconjunto de neuronas marcadas con fluorescencia en las profundidades del cerebro de un embrión de pez cebra vivo. Obtuvieron imágenes de un volumen de 240 x 240 x 270 micrones, dividido en no menos de 19,584 subvolúmenes correctivos. Los resultados demostraron lo que el equipo caracterizó como rendimiento limitado por difracción.

La técnica también demostró ser claramente menos compleja que muchos enfoques AO anteriores. Fue lo suficientemente rápido y no invasivo para adaptarse a períodos prolongados de imágenes en el embrión de pez cebra en desarrollo, y en el proceso subrayó la variabilidad espacial y la complejidad de las aberraciones incluso en este organismo modelo nominalmente transparente y ópticamente benigno.

"Cuando el microscopio se utiliza en su modo de dos fotones, la óptica adaptativa funciona automáticamente", señaló Betzig. "La medición del frente de onda se produce simultáneamente con las imágenes de TPE, actualizando sus correcciones en solo 14 milisegundos. No solo es más rápido que la mayoría de las otras aplicaciones AO en microscopía, requiere muy pocos fotones para lograr una buena corrección, lo cual es esencial, ya que se necesitan muchas correcciones para cubren un gran volumen, y muchos especímenes son bastante sensibles a la luz ".

Las principales desventajas en la actualidad son la necesidad de un láser Ti-saphhire para generar la estrella guía, y una inadecuación básica para su uso en objetivos de mayor dispersión que el embrión de pez cebra convenientemente transparente. Para abordar ese tipo de muestras se necesitarán métodos de detección de frente de onda indirectos, que según Betzig no eran tan rápidos ni tan desarrollados como la nueva técnica.

Por otro lado, la implementación del método en escenarios donde pueda ser de utilidad debería ser relativamente sencilla, y Betzig cree que sería bastante fácil diseñar un paquete AO capaz de ser adaptado a los microscopios TPE existentes, encajando entre el láser y el microscopio.

Microscopía de hoja de luz
La principal motivación del equipo para desarrollar un método de detección de frente de onda directo rápido y no invasivo para cubrir grandes volúmenes en muestras transparentes es aplicarlo a la microscopía de lámina de luz, en la que la fluorescencia se genera mediante una lámina plana de iluminación láser.

Un interés particular del grupo HHMI es la microscopía de láminas de luz de haz de Bessel, una variante de la técnica básica que emplea láminas de luz particularmente delgadas. Esto reduce los efectos de la dispersión y otras interferencias, y está diseñado para permitir la obtención de imágenes dentro de las células en el límite de difracción y más allá.

"Creo que la próxima frontera de la biología celular es quitarla del cubreobjetos y devolverla a todo el organismo, donde estas células evolucionaron originalmente", comentó Betzig. "La microscopía de lámina de luz de Bessel es necesaria por su alta velocidad, alta resolución y gran relación señal / ruido en muestras 3D y se necesita AO para corregir las aberraciones del haz de Bessel entrante y la fluorescencia saliente".


Una nueva técnica se inspira en la astronomía y la oftalmología para mejorar la nitidez de las imágenes microscópicas

Esta imagen es una captura de fotogramas de un video que muestra imágenes de un microscopio de óptica adaptativa (AO) que funciona en modo de excitación de dos fotones (TPE). Las imágenes muestran un subconjunto de neuronas marcadas con una membrana en el cerebro de un embrión de pez cebra vivo. Esta imagen muestra lo que se vería con la óptica adaptativa (AO) y la deconvolución activadas. Crédito: Eric Betzig Lab, HHMI Janelia Farm Research Campus

La complejidad de la biología puede confundir incluso a los microscopios ópticos más sofisticados. Las muestras biológicas desvían la luz de formas impredecibles, devolviendo información difícil de interpretar al microscopio y distorsionando la imagen resultante. La nueva tecnología de imágenes desarrollada en el campus de investigación agrícola Janelia del Instituto Médico Howard Hughes corrige rápidamente estas distorsiones y agudiza las imágenes de alta resolución en grandes volúmenes de tejido.

El enfoque, una forma de óptica adaptativa, funciona en tejidos que no dispersan la luz, lo que lo hace muy adecuado para obtener imágenes de los cuerpos transparentes del pez cebra y el gusano redondo Caenorhabditis elegans, importantes organismos modelo en la investigación biológica. El líder del grupo Janelia, Eric Betzig, dice que su equipo desarrolló la nueva tecnología combinando estrategias de óptica adaptativa que los astrónomos y oftalmólogos usan para cancelar distorsiones similares en sus imágenes.

En un informe publicado en línea el 13 de abril de 2014, en la revista Métodos de la naturaleza, Betzig, el becario postdoctoral Kai Wang y sus colegas muestran cómo la técnica enfoca las estructuras finas y ramificadas y los orgánulos subcelulares de las células nerviosas en las profundidades del cerebro vivo de un pez cebra. Estas estructuras permanecen borrosas e indistintas bajo el mismo microscopio sin óptica adaptativa. "Los resultados son bastante sorprendentes", dice Betzig. "Esto realmente lleva la aplicación de la óptica adaptativa a la microscopía a un nivel completamente diferente".

"Nuestra técnica es realmente sólida y no necesita nada especial para aplicar nuestra tecnología. [En el futuro] podría ser un componente adicional muy conveniente para los microscopios disponibles comercialmente", dice Wang, investigador postdoctoral en el laboratorio de Betzig. .

Durante la última década, Betzig y otros han seguido el ejemplo de los astrónomos en el uso de la óptica adaptativa para corregir la heterogeneidad de los tejidos biológicos en la flexión de la luz. Los astrónomos aplican la óptica adaptativa al hacer brillar un láser alto en la atmósfera en la misma dirección que un objeto que quieren observar, explica Betzig. La luz que regresa de esta llamada estrella guía se distorsiona a medida que viaja a través de la atmósfera turbulenta de regreso al telescopio. Usando una herramienta llamada sensor de frente de onda, los astrónomos miden esta distorsión directamente, luego usan las medidas para deformar el espejo de un telescopio para cancelar las aberraciones atmosféricas. La corrección brinda una vista mucho más clara del objeto de destino que desean observar.

A microscopy technique that Betzig developed in 2010 with Na Ji, who is now also a group leader at Janelia, achieves similar results by using an isolated fluorescent object such as a cell body or an embedded bead in the tissue as the "guide star." This target is imaged many times from many different angles to determine the correction that should be applied. While this approach works even in scattering tissues such as the mouse brain—where the new technique does not—the process is slow and exposes a sample to a lot of potentially damaging light. To improve images of large samples where the aberration changes quickly with position, researchers needed to speed up the correction process.

Betzig and Wang focused on devising an adaptive optics strategy for new microscopy methods that image dynamic processes non-invasively and at high resolution. Such technologies – such as the Bessel beam plane illumination microscope that Betzig's team developed in 2011 and the simultaneous multiview light sheet microscope developed by Janelia lab head Philipp Keller in 2012 – perform well on cells or small embryos, but image quality degrades in larger samples.

Those microscopes are used exclusively to image transparent samples, narrowing the scope of the problem. Betzig and Wang needed a rapid, non-invasive way to correct for heterogeneities in the composition of cells and tissues, but because it would only be used on transparent tissue, they did not need to compensate for light-scattering.

"If you're in a regime where there is no scattering, then you can do exactly what the astronomers do," Betzig says, explaining that because transparent tissue would not scramble the light waves returned from a guide star, they could detect and measure its wavefront directly.

The team created a guide star by focusing light from the microscope into a glowing point within the sample. Using a technique called two-photon excitation, they could penetrate infrared light deep within the tissue and illuminate a specific point. The wavefront sensor would then determine how the light that returned from this guide star had warped as it passed through the tissue, so that the appropriate correction could be applied.

However, because biological tissue is so heterogeneous, the situation was more complicated. "In biology, unlike astronomy, the wavefront errors are really complex," Betzig says. "As light from the guide star returns to the sensor, the wavefront gets much bumpier in microscopy than in astronomy. If you fix the guide star at a single point, that bumpiness confuses the sensor, so you don't get a good correction." Furthermore, a correction that works at one point won't be effective at a spot elsewhere in the sample that bends light waves in a different way.

The solution to this problem, Betzig and Wang determined, is to scan the guide star over a small region of the sample, instead of parking it in one spot. For the sensor to interpret the information returned from this moving guide star, the light must be made stationary, or "descanned." This is achieved by bouncing the light off the same mirrors that tilt to project the guide star to different points in the specimen. The resulting wavefront is used to generate an average correction over the scanned region.

Betzig explains that a similar strategy is incorporated into adaptive optics that corrects images of patients' retinas, which are distorted when light passes through the eye's cornea and lens. Measuring and correcting those aberrations is complicated by movements of patients' eyes, so ophthalmic imaging uses descan to average out motion-induced errors.

"We combined the descan concept from the ophthalmologists with the laser guide stars of the astronomers, and came up with what amounts to a really good solution for aberrating but non-scattering transparent samples, like the zebrafish," Betzig says.

"We kept on pushing this technology, and it turns out it works," says Wang. "When we compare the image quality before and after correction, it's very different. The corrected image tells a lot of information that biologists want to know."

To image of a large section of tissue, a microscope might generate and compile tens of thousands of images of smaller volumes, each requiring its own adaptive optics correction. So it is essential that those corrections are determined and applied quickly, Betzig says. The new technique handles the task well, updating its corrections in just 14 milliseconds. And when the microscope is used in its two-photon mode, the adaptive optics work automatically. "You don't have to slow down or do anything different," Betzig says. "It's just happening in the background as you're running the microscope."


1.5 Application: Light-sheet Imaging of Zebrafish Brain

This section focuses on the application of LSFM in zebrafish neuroscience. It aims to illustrate how the unique performance of this new imaging method may shed a new light on brain-scale neuronal processing in the vertebrate brain.

1.5.1 Light-sheet-based Whole-brain Functional Imaging in Zebrafish Larvae

In the last two decades, the zebrafish (Danio rerio) has emerged as an important model in circuit neuroscience. Native to Asia, this small vertebrate displays important physiological and genetic homologies with mammals. Its genome is fully sequenced and a large panoply of genetic tools is now available. The zebrafish was originally used in developmental biology because its main organs develop within the first day post-fertilization and this process can be easily monitored. At this early stage, the larva is indeed transluscent—only a few pigments are present on the skin—which permits exceptional optical access to the entire specimen. The identification of a mutation controlling pigment cell formation 38 led to the design of the so-called nacre zebrafish line that lacks skin pigments, thus improving the advantages of zebrafish larvae for en vivo imágenes.

With the development of genetically encoded calcium indicators, this asset was further exploited to perform en vivo functional imaging. 39–41 The zebrafish larval brain being quasi-transparent, small and compact [the 10 5 neurons of a 6 dpf (days post-fertilization) larva are contained within a volume of 2 × 0.5 × 0.3 mm], the entire brain can be optically monitored in a minimally invasive way. 39–41 To increase the number of neurons that could be simultaneously recorded, several strategies were developed, including high-speed random-access imaging using acousto-optical deflectors 42–44 and simultaneous multi-point excitation. 45 These methods still proved to be too slow to record the entire brain volume of zebrafish larvae with sufficient dynamics. A whole-brain map of neural activity therefore required the sequential recording of the various brain areas from different individuals and then the patching together of these different regions. 14,46 Such a sequential approach was tedious and only yielded mean activity patterns: it did not allow for the probing of large-scale concerted neural activities spanning distant brain regions. This imaging limitation precluded the study of complex neural processing that involved extended neural circuits.

In 2013, the first LSFM-based functional recordings were reported on zebrafish larvae expressing the genetically encoded calcium reporter GCaMP pan-neurally, generating activity time traces of almost 80 000 neurons at 0.7 Hz or 25 000 neurons at 4 Hz. 47,48 This new technique offered the first whole-brain recording at cellular resolution in a vertebrate, using activity correlation analysis. With these new sets of data, rich structures in space and time were now accessible, which could be revealed in a straightforward way using correlation analysis (Figure 1.10). It also paved the way to the study of brain-scale processing of complex sensorimotor tasks, as illustrated in the following section.

1.5.2 Whole-brain LSFM-based Functional Imaging to Study Sensorimotor Integration in the Vertebrate Brain

Although it possesses ∼10 times fewer neurons that a human retina, a 6-day-old zebrafish larva exhibits a rich behavioral repertoire, including goal-directed navigation (spontaneous swimming along illumination or thermal gradients), optomotor response (swimming in response to a global visual flux in order to maintain a constant position) and hunting (paramecia capture). These behaviors involve the integration and processing of various sensory stimuli to trigger adequate motor responses.

LSFM allows the monitoring of the entire brain, from visual to integrative and motor centers, and thus offers a unique window into the neural substrates of such complex sensorimotor behaviors. Although the animal needs to be tethered in agarose in order to perform brain imaging, it is possible to record motor outputs either by video monitoring tail or eye motion (after partially removing the agarose around the tail or eyes) or by extracellular recording of fictive swim bouts in paralyzed preparations. These recordings can then be used to produce, using a real-time feedback loop, a sensory environment with which the animal can virtually interact. 49

These approaches have recently been used, in two independent studies, to reveal specialized hindbrain circuits that control spontaneous and phototactic (towards a light source) navigation. Dunn et al. 50 used whole-brain LSFM to identify two bilaterally distributed neural assemblies whose activity drives the (left/right) orientation of successive swim bouts, and thus orchestrates the spatiotemporal pattern of spatial exploration (see Figure 1.10). Lobo et al. 51 used two-photon LSFM to record brain activity when the zebrafish was exposed to visual stimulation. They were able to show that the same circuit is under partial control of visual stimuli, in such a way that the animal's trajectory is biased towards a light source.

One of the strong assets of LSFM is to provide a straightforward way to map the entire circuit involved in a particular task. This can be achieved by simply correlating the activity of the entire brain with the motor or sensory signals. Such functional mapping approaches do not rely on pre-existing hypotheses regarding the involved brain regions, as the entire brain can be analyzed at once.


4. Conclusión

In conclusion, to achieve en vivo high-resolution deep tissue imaging, a machine learning-based optical distortions detection method is proposed to simplify the wavefront sensing processes. Our results successfully demonstrate that the trained model has the capability to predict the distortion up to 36 Zernike modes in 1.227 ms with accuracy ∼ 97.4%. During the wavefront detection, only one spot pattern from SHWS is required to predict the coefficients. The distortion detection speed of our method is 50.04% faster than the modal-based SHWS. After compensating with the wavefront predicted by our method, the average RMS error of phase residuals could be well decreased, and the RMS error of our method is 75.64% lower than that with modal-based SHWS. The simple detection process, high detection speed and the low RMS error substantially reduces the difficulty of wavefront detection based on SHWS. Therefore, this work has a potential significance to be applied in wavefront sensor-based AO for en vivo deep tissue imaging.


Ver el vídeo: CÓMO MANEJAR EL SISTEMA ÓPTICO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO? (Agosto 2022).