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¿De dónde proceden las lisinas durante la ubiquitinación?

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Sé que Ub forma un enlace isopéptido con lisina, pero ¿de dónde proviene la lisina?

¿Están siempre disponibles para que los Ub los encuentren durante el proceso de ubiquitinación? ¿Hay una lisina gratis disponible en cada uno de los Ub adicionales agregados a la cadena? Después de que se agrega la primera Ub a la proteína objetivo, ¿el complejo E2 / E3 todavía tiene que unirse cada vez que se agrega una Ub a la cadena?


El artículo de Wikipedia sobre Ubiquitina da una respuesta bastante buena a sus preguntas. Mire los artículos a los que se hace referencia si desea obtener respuestas más detalladas.

¿Están siempre disponibles para que los Ub los encuentren durante el proceso de ubiquitinación?

Sí, este proceso de [ubiquitinación] generalmente une el último aminoácido de ubiquitina (glicina 76) a un residuo de lisina en el sustrato.

¿Hay una lisina gratis disponible en cada una de las Ub adicionales agregadas a la cadena?

La ubiquitina tiene siete lisinas y cada una de ellas puede unirse a la glicina N-terminal de la siguiente ubiquitina.

Después de que se agrega la primera Ub a la proteína objetivo, ¿el complejo E2 / E3 todavía tiene que unirse cada vez que se agrega una Ub a la cadena?

Sí, pero esto es más complicado que el mecanismo general. Se puede unir una cadena de poliubiquitina como una sola ubiquitina o se pueden conjugar una ubiquitina más a un complejo ubiquitina-proteína existente. Véase, por ejemplo, Brown et al y David et al.


Mecanismos de mono y poliubiquitinación: la especificidad de ubiquitinación depende de la compatibilidad entre el núcleo catalítico de E2 y los residuos de aminoácidos próximos a la lisina.

La ubiquitinación implica la unión de ubiquitina a residuos de lisina en las proteínas del sustrato o en sí misma, lo que puede dar como resultado una monobiquitinación o poliubiquitinación de proteínas. La unión de ubiquitina a diferentes residuos de lisina puede generar diversas estructuras de sustrato-ubiquitina, dirigidas a proteínas hacia diferentes destinos. Los mecanismos de selección de lisina no se comprenden bien. La ubiquitinación por el grupo más grande de ligasas E3, la familia RING E3 s, se cataliza mediante la cooperación entre la ubiquitina-ligasa no catalítica (E3) y la enzima conjugadora de ubiquitina (E2), donde el RING E3 se une al sustrato. y el E2 cataliza la transferencia de ubiquitina. Estudios anteriores sugieren que los sitios de ubiquitinación se seleccionan mediante el posicionamiento mediado por E3 de la lisina hacia el sitio activo E2. En última instancia, a nivel catalítico, la ubiquitinación de residuos de lisina dentro del sustrato o ubiquitina se produce por ataque nucleofílico del residuo de lisina en el enlace tioéster que une la cisteína catalítica E2 con ubiquitina. Uno de los complejos RING E3 / E2 mejor estudiados es el complejo de proteínas de caja Skp1 / Cul1 / F, SCF Cdc4, y su afín E2, Cdc34, que se dirige al inhibidor de CDK Sic1 para la poliubiquitinación ligada a K48, lo que lleva a su degradación proteasomal. Nuestros estudios recientes de este sistema modelo demostraron que los residuos que rodean las lisinas Sic1 o la lisina 48 en la ubiquitina son fundamentales para la ubiquitinación. Esta dependencia de secuencia está vinculada a residuos clave conservados evolutivamente en la región catalítica de Cdc34 y puede determinar si Sic1 es mono o poliubiquitinado. Nuestros estudios indican que los determinantes de aminoácidos en la región catalítica de Cdc34 y su compatibilidad con los residuos de lisina aceptores circundantes juegan un papel importante en la selección de lisina. Esto puede representar un mecanismo general para dirigir el modo de ubiquitinación en E2 s.


Componentes clave de la reacción de APC

La ubiquitinación de proteínas por APC requiere la cooperación de cuatro componentes proteicos: el núcleo de APC, la subunidad activadora, E2 y sustrato (Figura 3). Los activadores, E2 y sustratos se unen todos reversiblemente al núcleo de APC con afinidades variables e interactúan entre sí también. Para comprender la contribución de cada uno de estos componentes a la reacción de ubiquitinación, es útil resumir primero sus características básicas.

Los cuatro componentes proteicos principales en una reacción APC. La catálisis depende de las interacciones cooperativas entre el núcleo de APC, el activador, el sustrato y E2.

Núcleo de APC

El APC es un complejo estrechamente asociado de aproximadamente 1 MDa de 11 a 13 subunidades que generalmente se conservan bien en eucariotas (Figura 4 Tabla 1). La APC es una ubiquitina-proteína ligasa de tipo cullin-RING [7], en la que las subunidades Apc2 y Apc11 contienen los dominios cullin y RING, respectivamente. Como en otras ligasas de cullina-RING, el dominio RING de Apc11 interactúa directamente con el E2, y el dominio de cullina de Apc2 se une a Apc11 y probablemente proporciona un andamio extendido que conecta estas dos subunidades con el resto de la enzima.

El núcleo de APC contiene varios subcomplejos. El núcleo de APC de levadura en ciernes es un complejo de aproximadamente 1 MDa de 13 subunidades (Tabla 1), incluidas las nueve subunidades clave que se muestran aquí. Un subcomplejo (verde oscuro) contiene la subunidad de cullina Apc2 y la proteína de dominio RING Apc11, que recluta E2. Otro subcomplejo (verde claro) contiene las tres subunidades que contienen TPR, Cdc27, Cdc23 y Cdc16, así como dos subunidades, Apc4 y Apc5, que ayudan a conectarlas con el resto del APC a través de Apc1. Las subunidades que contienen TPR proporcionan sitios de unión para el activador (Cdh1 o Cdc20), que contiene al menos dos motivos de interacción APC, el motivo Ile-Arg (IR) y la caja C, así como una secuencia de repetición WD40 grande que es probable que forme un sitio de unión similar a una hélice para el sustrato.

El análisis de APC purificado a partir de cepas de levadura que carecen de subunidades individuales ha llevado a la identificación de subcomplejos de APC (Figura 4) [8]. Uno contiene Apc2 y Apc11, así como una tercera subunidad, Doc1. Doc1 contiene una estructura de barril β conocida como dominio Doc, que en otras proteínas participa en la unión a ligandos pequeños, y esta subunidad puede contribuir a la unión del sustrato, como se analiza más adelante. El otro subcomplejo de APC contiene tres subunidades grandes (Cdc27, Cdc16 y Cdc23 en levadura) que llevan diez o más copias de un motivo de secuencia de 34 residuos llamado repetición tetratricopeptide (TPR). Estas subunidades parecen asociarse secuencialmente con el APC, de modo que la asociación de Cdc27 depende de Cdc16, y la asociación de Cdc16 depende de Cdc23 [8]. Los cálculos de estequiometría sugieren que las subunidades TPR están presentes en dos copias en el APC [9, 10]. Los TPR generalmente forman surcos de unión a proteínas y, por lo tanto, es probable que las múltiples subunidades de TPR proporcionen una gran variedad de superficies de interacción en el núcleo de APC.

Los dos subcomplejos de APC se mantienen unidos por la subunidad de APC más grande, Apc1 (Figura 4). Apc4 y Apc5 ayudan a conectar Apc1 a la base del subcomplejo TPR, Cdc23. Las subunidades no esenciales Cdc26 y Swm1 (no mostradas en la figura) ayudan a estabilizar la asociación de las subunidades TPR con el resto de las APC [11, 12]. Cdc26 promueve la integridad de APC formando un complejo con las ranuras TPR de Cdc16 [13]. Las funciones de otras subunidades de APC siguen sin estar claras.

Varios análisis de microscopía electrónica (EM) han permitido vislumbrar el tamaño y la forma de la APC [9, 10, 14-16]. A una resolución de alrededor de 30 Å, la APC de levadura parece formar una partícula triangular, y la localización de subunidades individuales mediante el marcado de anticuerpos es aproximadamente consistente con la arquitectura determinada a partir de estudios de subcomplejos [10, 16]. En la estructura EM de mayor resolución, las subunidades TPR se localizan en una estructura de "lámpara de arco", y Apc2 se encuentra en una región de "plataforma" adyacente donde es probable que los E2 se unan [16].

Activador

A pesar de su gran tamaño, el núcleo de APC tiene poca actividad en ausencia de una de sus proteínas activadoras, Cdc20 o Cdh1 (un tercer activador, Ama1, se expresa únicamente en la meiosis y no se discutirá aquí [17]). Cdc20 se asocia con APC en la mitosis temprana, lo que lleva a la destrucción de objetivos que controlan el inicio de la anafase. La unión de Cdc20 a la APC se promueve mediante la fosforilación de múltiples subunidades de APC [18-23]. Más adelante en la mitosis, Cdc20 es reemplazado por Cdh1, que mantiene la actividad a través del siguiente G1. La asociación de Cdh1 con la APC depende de la desfosforilación de Cdh1 [20, 24, 25].

Las proteínas activadoras participan en el reconocimiento del sustrato por APC. Las regiones carboxi-terminales de Cdc20 y Cdh1 contienen un dominio WD40 que se cree que forma una plataforma de unión similar a una hélice que se une a los sustratos de APC [26-29]. Es probable que las variaciones de secuencia en los dominios WD40 de Cdc20 y Cdh1 den como resultado diferentes especificidades de sustrato. Estas diferencias en la especificidad proporcionan un mecanismo para cronometrar la destrucción de diferentes dianas de APC en la mitosis: Cdc20 se dirige a una pequeña cantidad de sustratos clave para la destrucción en la metafase, mientras que Cdh1 posee una especificidad más amplia, dirigiéndose a estas proteínas y muchas más en la mitosis tardía y G1 [ 30, 31].

Los activadores también contienen al menos dos motivos de secuencia, el motivo Ile-Arg (IR) y la caja C, que son necesarios para la unión del activador al núcleo de APC. El motivo IR consta de dos residuos en el extremo carboxilo del activador, y la caja C es un motivo de ocho residuos cerca del extremo amino [29, 32, 33]. La unión del activador a la APC está mediada, al menos en parte, por las subunidades de TPR (Figura 4): Cdh1 se une directamente a Cdc27 in vitro [26, 32], y los residuos específicos en los surcos de interacción de proteínas formados por los TPR en Cdc27 y Cdc23 son necesarios para la unión de Cdh1 y Cdc20 [34]. El motivo IR del activador se une a los TPR de Cdc27, y una región activadora adicional no identificada parece unirse a los TPR de Cdc23 [34]. El sitio de unión de C-box sigue siendo desconocido, pero una posibilidad es la subunidad Apc2, ya que la eliminación de Apc2 de la APC reduce la unión del activador [8]. Juntas, estas múltiples interacciones generan una unión de muy alta afinidad del activador al núcleo de APC, y es probable que el activador permanezca unido durante múltiples eventos de unión al sustrato [34]. Análisis EM recientes sugieren que el activador se encuentra entre la lámpara de arco TPR y Apc2, en una posición ideal para presentar sustratos para atacar conjugados entrantes de E2-ubiquitina [16].

Sustrato

Mientras que tanto la E2 como la proteína diana se alteran químicamente durante la ubiquitinación, para mayor claridad usamos el término "sustrato" para referirnos a la diana ubiquitinada y no a la E2. Los dos sustratos esenciales de la APC son la securina y las ciclinas mitóticas (Figura 1) [35]. La degradación de la securina desencadena la separación de las cromátidas hermanas y se requiere la degradación de las ciclinas mitóticas para completar la mitosis. La APC, particularmente cuando se une a Cdh1, también ubiquitina muchas otras proteínas involucradas en varios aspectos de la salida mitótica [5].

Los sustratos se unen específicamente al complejo APC-activador a través de secuencias de degradación, las mejor comprendidas de las cuales son la caja D (RXXLXXXN) y la caja KEN (KEN) [36, 37]. Aunque las secuencias de caja D y KEN son necesarias para la ubiquitinación de muchos sustratos por la APC, a menudo no son suficientes, lo que sugiere que los sustratos contienen secuencias de degradación adicionales no identificadas [36, 37]. Numerosos sustratos de APC contienen secuencias de degradación no canónicas que carecen de similitudes claras en las secuencias [38-45]. Es probable que la mayoría, si no todos, los sustratos de APC contengan múltiples secuencias de degradación y, por lo tanto, podrían ser capaces de interacciones multivalentes con el complejo activador de APC.

Las secuencias de degradación y las lisinas ubiquitinadas se encuentran a menudo en regiones del sustrato que probablemente estén desordenadas. Por ejemplo, el dominio de unión a Cdk globular de las ciclinas generalmente está precedido por una región amino-terminal desordenada que contiene las secuencias críticas de la caja D y KEN, junto con numerosas lisinas. También es probable que la securina posea una región de reconocimiento de APC amino-terminal desordenada adyacente a un dominio funcional carboxi-terminal. La separación de los dominios funcionales y de degradación podría evitar que la señal de degradación interfiera con la función normal de la proteína y, por tanto, podría facilitar la evolución de la degradación reguladora. Como las secuencias desplegadas en los extremos amino o carboxilo de las proteínas son necesarias para su eficaz despliegue y translocación en el poro del proteasoma para la degradación [46, 47], estas regiones desplegadas pueden ser un sello distintivo de todos los objetivos de degradación.

Los E2 comparten un dominio central conservado de aproximadamente 150 aminoácidos, incluido el residuo de cisteína central en el que se une la ubiquitina, algunos E2 también contienen extensiones terminales amino o carboxi que dan especificidad a sus funciones. Los E2 se cargan con ubiquitina mediante la enzima activadora de ubiquitina E1 (Figura 2a). Como los E2 utilizan la misma interfaz de unión para interactuar tanto con el E1 como con el E3, los E2 deben disociarse del E3 para recargarse con ubiquitina [48]. La tasa de rotación de E2 es muy rápida: durante in vitro En experimentos de ubiquitinación, el APC puede agregar hasta diez ubiquitinas a un sustrato en segundos (MR-B y MEM, resultados no publicados).

Las ligasas de ubiquitina-proteína, como la APC, catalizan dos reacciones distintas: la unión de ubiquitinas a diferentes lisinas de sustrato (denominada monobiiquitinación múltiple) y la transferencia de ubiquitinas a lisinas específicas en ubiquitinas previamente unidas, lo que lleva a la formación de cadenas de ubiquitina (denominada poliubiquitinación). . La especificidad de la lisina está determinada principalmente por el E2. En la levadura, por ejemplo, Ubc4 promueve la adición de ubiquitinas al sustrato lisinas, mientras que Ubc1 cataliza la ubiquitinación de lisina 48 (K48) de una ubiquitina previamente unida, lo que lleva a cadenas unidas a K48 que son reconocidas por el proteasoma [49]. Las diferentes preferencias de estos E2 les permiten colaborar en vivo, de manera que Ubc4 une las ubiquitinas iniciales al sustrato lisinas y Ubc1 extiende estas ubiquitinas en cadenas unidas a K48. En los vertebrados, UbcH5, como su ortólogo de levadura Ubc4, tiende a generar enlaces inespecíficos al sustrato lisinas [50, 51], mientras que E2-25K, como la levadura Ubc1, genera cadenas unidas a K48 [49, 52]. UbcH10 permite que el APC cree cadenas unidas a K11 [51].


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Discusión

Previously, we have shown that KLHL12 interacts with the polymorphic repeats of the D4R and enhances its ubiquitination [8] but this has no influence on receptor degradation [31]. In the present study we investigated which specific residues of the D4R are ubiquitinated by the KLHL12-Cullin3 E3 ligase complex. In the whole sequence of D4R there are only four lysine residues and all of them can potentially serve as ubiquitin binding sites as they are localized in the intracellular domains of the receptor. Using a site-directed mutagenesis approach each lysine was separately mutated to arginine. Next, sequential double IP experiments demonstrated that all four mutants are ubiquitinated and overexpression of KLHL12 increases their ubiquitination level ( Fig 2 ). This suggests that ubiquitination occurs on multiple lysines or that the ubiquitination system is flexible and when the most preferred ubiquitin binding site is unavailable it can ubiquitinate another available lysine. Next, we created the quadruple mutant HA D4.2 4KRR in which all four lysines were mutated to arginines. This mutant should be unable to undergo lysine-mediated ubiquitination. Surprisingly, we could still detect basal ubiquitination of this mutated receptor and upon co-expression of KLHL12 an increase in its ubiquitination was visualized ( Fig 3 ). This finding encouraged us to search for other possible ubiquitination sites in the D4R. Ubiquitination on non-lysine residues is still a poorly studied phenomenon and until now ubiquitination on the N-terminus [11�, 40], cysteine [14�], serine and threonine [17�] residues was described, but it has only been suggested once for a GPCR unfortunately without characterizing the precise amino acid residue [32]. In our study we investigated the possibility of ubiquitin binding to cysteine, serine and threonine residues within the intracellular domains of the D4R. One of the most common approaches to verify ubiquitination on a non-lysine residue is a chemical cleavage of ubiquitin [38]. Ubiquitin attached to a lysine residue forms an isopeptide bond which is very stable, whereas a thioester bond connecting ubiquitin with cysteine can be destroyed during treatment with a highly reducing agent e.g. a high concentration of DTT [15, 16, 36]. Our results clearly indicate that upon treatment with a very high concentration of DTT the ubiquitination signal detected after the second IP is significantly reduced for both WT D4.2R and D4.2 4KRR, suggesting ubiquitination on cysteine residues ( Fig 4 ).

Next, we examined the possibility of ubiquitination on serine and/or threonine residues. When ubiquitin is attached to a serine or threonine residue an oxyester bond is formed which is susceptible for cleavage in a strong alkaline environment [36, 37]. We have performed a ubiquitination assay in which, after the first IP, the samples were treated with NaOH and after the second IP a strong decrease in ubiquitination signal was observed ( Fig 5A ). These results thus suggest that D4R ubiquitination on cysteine, serine and/or threonine residues can be promoted by KLHL12. It is, however, not possible to say which residues are the most preferred for KLHL12-induced ubiquitination as quantification of the results from multiple independent experiments indicates a comparable decrease in ubiquitination levels for both types of treatments ( Fig 5B� ). The decrease is more explicit when Etag KLHL12 is co-expressed which suggests that during KLHL12-promoted ubiquitination more non-lysine residues in the D4R are ubiquitinated compared to the basally ubiquitinated receptor. This decrease is even more striking in case of the D4.2 4KRR mutant in which no lysine residues are available. This indicates that in the WT receptor KLHL12 promotes ubiquitination on lysine and non-lysine residues and in the D4.2 4KRR mutant, in which lysines are not available, only non-lysine residues are ubiquitinated. The fact that in all experiments we detect an overall lower ubiquitination signal from D4.2 4KRR ( Fig 5F ) compared to WT D4.2R further supports the hypothesis about the involvement of lysine residues in KLHL12-mediated ubiquitination of D4R. To exclude the possibility that the alkaline treatment affects amide bonds which are normally formed between ubiquitin and lysine residues we have also checked the influence of NaOH on ubiquitination of other GPCRs for which lysines were described as ubiquitin binding sites. We have used the CXCR4 receptor for which three lysines in the C-terminal tail were shown to be critical for receptor ubiquitination [26]. As a second receptor we used the β2AR for which lysines in the third intracellular loop and in the C-terminal tail were presented to be important for ubiquitination and subsequent lysosomal degradation [28]. In this control experiment (S3 Fig), we have seen again a very strong effect of NaOH treatment on basal and KLHL12-induced ubiquitination of D4.2R and no effect on CXCR4 and β2AR ubiquitination. This result allows us to conclude that the conditions used for alkaline treatment are not affecting amide bonds which are formed during the typical lysine-linked ubiquitination process. Most papers that study ubiquitination on non-lysine residues identified several different residues as possible ubiquitination sites. Some of them are most preferred by the ubiquitination machinery but when those are not available ubiquitin can bind to other amino acids. Such situation was described for example for NS-1 nonsecreted immunoglobulin light chain (NS-1 LC) which is predominantly ubiquitinated on serine/threonine residues but when these amino acids were mutated then lysine residues could serve as ubiquitin-binding sites. Mutation of all three types of amino acids (serines, threonines and lysines) was required to efficiently reduce ubiquitination and stabilize the NS-1 LC [37]. Another example represents the T-cell antigen receptor α-chain (TCRα) for which mutation of two conserved serine residues to alanines in the cytosolic tail inhibited significantly receptor ubiquitination. However, when serine residues were replaced with lysine, cysteine or threonine residues the protein was still ubiquitinated [17]. Our findings seem to be in agreement with this previously described phenomenon showing that the ubiquitination machinery is a very flexible system and can easily change from one to another ubiquitination site if necessary.

To obtain a direct proof of ubiquitination on a non-lysine residue we decided to perform mass spectrometry (MS) analysis. Detection of ubiquitination by MS is possible due to the di-glycine remnant that remains attached to the ubiquitinated residue after tryptic digestion [41]. We have performed MS/MS analysis using a Fourier transform mass spectrometer but no ubiquitination was detected. Unfortunately, during tryptic digestion D4R is cut to single amino acid or very large fragments making it very hard to analyze. The computational prediction of cleavage of D4R with other enzymes, commonly used to prepare samples for MS analysis, did not suggest any good alternative to trypsine that could resolve this problem. According to our knowledge non-conventional ubiquitination was never proved with MS analysis probably due to the labile nature of thio-/oxy-ester bonds which are formed between ubiquitin and non-lysine residues. So far, only one study described the use of a novel peptide-based SILAC method to identify non-conventional ubiquitination of T-cell receptor α [42]. The authors could identify modified peptide which did not contain lysine in its sequence, however, they were unable to pinpoint the specific residue that undergoes ubiquitination.

Therefore, it is not very surprising that the detection of ubiquitination of D4R with MS/MS was not successful.

However, and most importantly, all the obtained data allow us to conclude that KLHL12 can promote ubiquitination of D4R on non-lysine residues and that ubiquitination on cysteine, serine and/or threonine is possible. The functional role of this non-lysine ubiquitination is hard to study because it would require the creation of a receptor with all possible ubiquitination sites mutated. Mutation of all intracellular cysteines, serines and threonines increases the chances of disrupted protein folding and it can also interfere with other posttranslational modifications. GPCRs are tightly regulated by phosphorylation which mainly occurs on serine and threonine residues and also by palmitoylation on cysteine residues (conserved cysteines located on the C-terminus of many GPCR) and also D4R shows these posttranslational modifications. Additionally, this can also inhibit binding of some interacting proteins, e.g. β-arrestins for which often phosphorylation of the receptor is required and which also play a critical role in the regulation of GPCR signaling. Therefore, mutation of all of these residues increases the possibility of creating of a mutant with completely different signaling properties compared to the wild type receptor. In most of the examples of non-lysine ubiquitination, which were described up to now, this modification seems to serve as a signal for protein degradation [14, 17�, 21]. Only in the case of Pex5p receptor (cytosolic receptor for peroxisome matrix proteins) ubiquitination of conserved cysteine 11 was shown to be involved in regulation of the recycling of the receptor form the peroxisomes to cytosol [15]. To the best of our knowledge, ubiquitination of the non-lysine residue was suggested only once for a GPCR. The group of Shenoy has shown that β2AR is probably ubiquitinated on a non-lysine residue in response to the treatment with an antagonist, carvedilol, as they could still detect ubiquitination of the β2AR in which lysines were mutated. Interestingly, the same mutant was not ubiquitinated upon agonist, isoproterenol, treatment. Carvedilol-promoted ubiquitination is mediated by a completely different E3 ubiquitin ligase which is not involved in the, already well defined, lysine-mediated ubiquitination of β2AR. However, both types of ubiquitination lead to endocytosis and lysosomal sorting of the receptor [32].

In the second part of our study we investigated the ubiquitination status of the three most common D4R polymorphic variants. First, the interaction of KLHL12 with these variants was examined. After IP of HA-tagged receptors co-precipitation of Etag KLHL12 with D4.2R, D4.4R and D4.7R was detected ( Fig 6 ). As a negative control we used D4.0R which is an artificial receptor variant lacking the polymorphic repeats. Next, a double sequential IP was performed to investigate the ubiquitination status of the different polymorphic variants. Ubiquitination of D4.2R and D4.4R was clearly increased when Etag KLHL12 was co-expressed, but surprisingly we hardly observed increased D4.7R ubiquitination ( Fig 7A and 7B ), although this receptor variant is still able to form a complex with KLHL12 and Cullin3 ( Fig 8 ). The differential ubiquitination pattern of the D4.7R, compared to the other D4R variants, is highly interesting as until now there is hardly evidence for pharmacological differences between this variant and the other receptor variants [43�], although behavioral research showed that the D4.7R is linked with a predisposition to develop ADHD [6], and also its association with increased sexual behavior, alcohol and cigarette craving was suggested. The functional role of differential KLHL12-mediated ubiquitination of the D4R is still under investigation. This finding opens a lot of new questions for future research on the possible role of ubiquitination in receptor signaling and suggests that ubiquitination can regulate GPCRs in a much more complicated way than previously expected.


Abstracto

Ubiquitin (Ub)-conjugating enzymes (E2s) and ubiquitin ligases (E3s) catalyze the attachment of Ub to lysine residues in substrates and Ub during monoubiquitination and polyubiquitination. Lysine selection is important for the generation of diverse substrate-Ub structures, which provides versatility to this pathway in the targeting of proteins to different fates. The mechanisms of lysine selection remain poorly understood, with previous studies suggesting that the ubiquitination site(s) is selected by the E2/E3-mediated positioning of a lysine(s) toward the E2/E3 active site. By studying the polyubiquitination of Sic1 by the E2 protein Cdc34 and the RING E3 Skp1/Cul1/F-box (SCF) protein, we now demonstrate that in addition to E2/E3-mediated positioning, proximal amino acids surrounding the lysine residues in Sic1 and Ub are critical for ubiquitination. This mechanism is linked to key residues composing the catalytic core of Cdc34 and independent of SCF. Changes to these core residues altered the lysine preference of Cdc34 and specified whether this enzyme monoubiquitinated or polyubiquitinated Sic1. These new findings indicate that compatibility between amino acids surrounding acceptor lysine residues and key amino acids in the catalytic core of ubiquitin-conjugating enzymes is an important mechanism for lysine selection during ubiquitination.

Protein ubiquitination plays a fundamental role in most cellular processes and involves three classes of enzymes (22). First, the 8-kDa protein ubiquitin (Ub) forms a thioester bond with the E1 Ub-activating enzyme. Ub is then transferred from E1 to the active-site cysteine of E2. Finally, E2s in conjunction with an E3 transfer Ub to a substrate lysine to form an isopeptide bond. E3 ligases are important for substrate recognition, and two major families exist. The RING (really interesting new gene) finger E3s, which lack catalytic activity, recruit the substrate and E2 into one complex to facilitate ubiquitination (19). Catalytic HECT (homologous to E6-AP carboxyl terminus) E3s accept Ub from E2 via a catalytic cysteine and then transfer Ub to a substrate lysine (22). The versatility of Ub in regulating different processes derives from its ability to be conjugated as a monomer (monoubiquitination) or polymer (polyubiquitination) to substrate lysines. Since Ub contains seven lysines, polyubiquitination can generate chains with different topologies (18). Monoubiquitination can regulate DNA repair, viral budding, trafficking, and gene expression (17). Polyubiquitination through Ub K11, K29, or K48 results in proteasomal degradation, while K63-linked Ub chains function in kinase activation, DNA damage tolerance, signal transduction, and endocytosis (17). In RING E3s the mode of ubiquitination (mono- or polymeric) and Ub linkage specificity are determined by E2, while HECT E3s specify the mode of ubiquitination with this family (11, 12).

The mechanisms that control mono- or polyubiquitination, chain topology, and lysine selection are poorly understood. Insights into this area have come from studies of the RING E3 ligase Skp1-Cdc53/cullin F-box (SCF) protein and its cognate E2, Cdc34, (19). One critical substrate of the budding yeast SCF Cdc4 /Cdc34 complex (superscript indicates the F-box protein) is Sic1. Sic1 is an inhibitor of the cyclin-dependent kinase (CDK) Cdc28 (29), containing a CDK-inhibitory domain within its C-terminal 70 amino acids (9). En Saccharomyces cerevisiae, G1-S-phase cell cycle progression depends on the SCF Cdc4 /Cdc34-mediated polyubiquitination of Sic1 on at least one of the six N-terminal lysine residues (K32, K36, K50, K53, K84, and K88) via K48-linked Ub chains, leading to its proteasomal degradation (9, 20). A Sic1 mutant missing these six lysines is still ubiquitinated on the remaining 14 lysines in vitro but is not degraded and is stable en vivo, leading to cell cycle arrest (20).

While a Ub chain on any one of six Sic1 N-terminal lysines sustains proteolysis, the turnover rates vary by 5-fold between the K36 and K84 sites, indicating that the context of the Ub chain is important (20). How SCF Cdc4 /Cdc34 ubiquitinates different Sic1 lysines and whether a lysine preference exists are poorly understood, but a “positioning model” has been proposed, where E3 positions substrate lysines favorably for the attack of the E2∼Ub thioester bond (19, 37). Previous studies suggested that the number of substrate ubiquitination sites correlates with the number of its F-box protein binding sites (8, 33, 37). For example, the ubiquitination of β-catenin and I㮫α is directed by a single high-affinity F-box protein binding site, and changes to the distance between the binding site and the lysine affect catalysis by 𢏂-fold (37). The phosphorylation of Sic1 on multiple CDK sites at the N terminus generates several low-affinity Cdc4 binding sites that dynamically bind Sic1 to the single site of Cdc4 in various geometries, leading to ubiquitination on numerous lysines. The directed binding of Sic1 to Cdc4 through a single artificial high-affinity binding site at the extreme N terminus confines efficient ubiquitination to lysines K84 and K88 (33). Sic1 lysine selection flexibility may also be achieved by the dimerization of the RING E3/E2 complex (8, 33). In addition, the neddylation of the cullin subunit induces conformational variation to the E2, enhances the recruitment of E2 to SCF, and brings substrate lysines toward the Cdc34∼Ub thioester to accommodate the ubiquitination of different lysines (6, 25). Lysine selection flexibility may also be achieved by the release of the ubiquitin-charged Cdc34∼Ub from SCF to transfer Ub to different substrate lysines, as proposed by the “hit-and-run” hypothesis (5). Apart from higher-order structures contributing to lysine selection flexibility, studies with the human anaphase-promoting complex (APC/C) RING E3 and its E2, UbcH10, have identified a sequence motif adjacent to acceptor lysines, termed the TEK box, which is important for lysine selection (11).

Similar to the E3-mediated positioning of substrate lysines, structural aspects of E2s position Ub lysines to generate Ub chains of different topologies by RING E3/E2 complexes (11, 12). Structural studies of Mms2/Ubc13-Ub demonstrate that this complex assembles so that K63 of Ub is positioned proximal to the Ubc13-Ub thioester bond during Ub chain formation (35). Similarly, Cdc34 dimerization, a noncovalent Ub binding domain (UBD), and structural constraints such as an acidic loop region were suggested previously to position K48 of Ub for the attack of the Cdc34∼Ub thioester bond (21, 36). However, E2s such as human UbcH5 utilize all Ub lysines but display a preference for K11, K48, and K63, indicating less structural constraint and that other mechanisms contribute to Ub lysine preference (12).

To further elucidate the mechanisms of lysine specificity, we assessed the SCF Cdc4 /Cdc34-mediated ubiquitination of Sic1's N-terminal lysines and K48 in Ub. SCF Cdc4 /Cdc34 displayed a strong preference for Sic1 K53. Changes to proximal amino acids regulated the rate of ubiquitination in Sic1 and K48 of Ub. This was linked to key residues composing the catalytic core of Cdc34. The mutation of these core sites differentially affected Cdc34 preference toward lysines on Sic1 or Ub K48. Our studies demonstrate that in addition to the importance of the SCF/Cdc34-mediated positioning of lysines, efficient catalysis is dependent on residues surrounding ubiquitinated lysines and their compatibility with the Cdc34 catalytic core residues. We propose that this compatibility is an important mechanism for lysine selectivity during ubiquitination.


Ubiquitin Specific Peptidase 16

Normal Function and Disease Involvement

Histone ubiquitination occurs primarily on histone H2A and H2B with ubiquitination levels between 5–15% and 0.1–1% for histone H2A and H2B respectively [29,30] . Histone H2A is ubiquitinated by Polycomb Repressive Complex 1 catalytic subunit Ring1b [31–33] . H2A ubiquitination is strongly associated with gene repression. Usp16 opposes the activity of Ring1b by removing ubiquitin from H2A lysine 119 [10] . Histone H2A deubiquitination has been shown to play pivotal roles in cell cycle progression, gene expression and DNA damage response [5,10,11] .

Early work demonstrated a requirement for Usp16 deubiquitinase activity during mitosis. A catalytically inactive Usp16 mutant was found to coat mitotic chromosomes and block cell cycle progression [5] . Subsequently, it was discovered that Usp16 H2A deubiquitination is required for the Aurora B catalyzed Ser-10 phosphorylation of H3 [10] . The phosphorylation status of Usp16 changes sequentially during cell cycle progression, possibly through the activity of cdc-2/cyclin B [5] . Although changes in phosphorylation state have not been associated with altered deubiquitinase activity in vitro, the phosphorylation state of Usp16 may control its cellular localization, oligomerization state, or may serve as a docking site for associating proteins.

Characterizations of the H2A ubiquitin ligase Ring1b established the importance of H2A ubiquitination for Hox gene repression and X chromosome inactivation [31–33] . Usp16 mediated H2A deubiquitination is required for Hox gene expression [10] . Developmental studies in X. laevis demonstrate that Usp16 catalyzed H2A deubiquitination of Hox genes is required for proper Hox gene expression and posterior body patterning [10] .

Recapitulating its role in gene expression, Usp16 also reverses the ubiquitin H2A stimulated transcriptional repression that occurs during DNA damage response [11] . Following DNA damage, H2A is rapidly ubiquitinated for several hundred kilobases from the site of damage. The ubiquitination of H2A following DNA damage is associated with transcriptional silencing and is required for the recruitment of DNA damage repair proteins [34,35] . Usp16 participates in the restoration of normal gene expression following damage repair by deubiquitinating H2A [11] .

Recent characterization of the genome and epigenome of human breast tumors and leukemias has revealed that Usp16 is consistently downregulated in cancer cells. In addition to the genetic changes which initiate cancer, general epigenetic misregulation is common in tumors, including epigenetic silencing of tumor suppressors and activation of oncogenes. It is theorized that Usp16 downregulation could be associated with stable gene silencing following DNA damage [11] . Alternatively, Usp16 downregulation may influence global gene expression levels. Additionally, genetic inversions involving Usp16 and RUNX1 (a key regulator of hematopoiesis) have been observed in chronic myelomonocytic leukemias. The inversion results in the partial deletion of Usp16 and Runx1 and the creation of a new Usp16-Runx1 fusion protein [36] . The pathogenic potential of Usp16 downregulation and deletions has not been thoroughly explored.


Abstracto

Endocytosis and targeting of growth factor receptors for lysosomal degradation have been associated with ubiquitination of the intracellular part of the receptors. To elucidate the role of receptor ubiquitination in internalization and sorting of fibroblast growth factor receptor (FGFR), we constructed several mutants of FGFR1 in which lysines, potential ubiquitination sites, were substituted for arginines. Substitution of all lysine residues in the intracellular part of FGFR1 resulted in inactivation of the tyrosine kinase domain of the receptor. However, several multilysine FGFR1 mutants, where up to 26 of 29 lysines in the intracellular part of the receptor were mutated, retained tyrosine kinase activity. The active multilysine mutants were poorly ubiquitinated, but internalized normally, indicating that ubiquitination of the receptor is not required for endocytosis. In contrast, degradation of the multilysine mutants was dramatically reduced as the mutants were inefficiently transported to lysosomes but rather sorted to recycling endosomes. The altered sorting resulted in sustained signaling. The duration of FGFR1 signaling seems to be tightly regulated by receptor ubiquitination and subsequent sorting to the lysosomes for degradation.


Additional Information

Códigos de adhesión: Coordinates and structure factors have been deposited in the RCSB protein data bank (PDB) under accession codes: 5KTY (hMiro1-BC_Ca 2+ ), 5KU1 (hMiro1-BC_GDP), 5KSZ (hMiro1-BC_GMPPCP), 5KSP (hMiro1-C C2221), 5KSY (hMiro1-C P41212), 5KSO (hMiro1-C P3121), 5KUT (hMiro2-C).

How to cite this article: Klosowiak, J. L. et al. Structural insights into Parkin substrate lysine targeting from minimal Miro substrates. Sci. Reps. 6, 33019 doi: 10.1038/srep33019 (2016).


Ver el vídeo: Proteólisis: Vía lisosómica (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Nikok

    Entrecerro los ojos con picardía, comparando los hechos...*

  2. Ari

    Lo siento, pero en mi opinión, estás equivocado.

  3. Jusho

    monigote de nieve

  4. Stockley

    la muy buena frase



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