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¿Se puede inactivar un gen usando CRISPR si no está en el espacio intermedio de repeticiones palindrómicas cortas?

¿Se puede inactivar un gen usando CRISPR si no está en el espacio intermedio de repeticiones palindrómicas cortas?



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Recientemente he estudiado cómo funciona CRISPR pero hay algo que no entiendo en absoluto. He oído a mucha gente afirmar que con este método es posible modificar cualquier genoma inactivando, activando, eliminando o añadiendo genes. Sin embargo, por lo que he entendido, las regiones de ADN solo se pueden modificar si están en los espacios intermedios de repeticiones palindrómicas cortas. Entonces, mi pregunta es si un gen que no está en el espacio intermedio de repeticiones palindrómicas cortas puede modificarse o eliminarse. Y si es posible hacerlo, ¿cómo?


Cuando la gente habla de la edición del genoma con CRISPR, realmente está hablando de usar nucleasas asociadas a CRISPR como Cas9 y Cpf1. Estas nucleasas son útiles ya que su especificidad de secuencia está determinada por un ARN guía y, por lo tanto, pueden usarse para cortar en sitios específicos del genoma. En realidad, esto no tiene nada que ver con las repeticiones en sí.

Consulte esta respuesta para obtener una breve descripción general de cómo funciona la edición del genoma con Cas9.


Tecnología CRISPR que busca inactivar genes mutados en el cáncer de pulmón

Los investigadores académicos esperan que sus esfuerzos en la tecnología de edición de genes de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) conduzcan a la capacidad de desactivar genes mutados en pacientes con una variedad de neoplasias malignas, incluido el cáncer de pulmón.

La tecnología CRISPR permite editar o alterar el genoma de una célula e inactivar o reparar genes según sea necesario cambiando las secuencias de ADN.

En el laboratorio, los investigadores están explorando actualmente la diversidad de varios genotipos tumorales en modelos de ratón para aprender más sobre la biología del cáncer y exactamente cómo los genes mutados impactan en la progresión del cáncer de pulmón, según Monte Winslow, PhD, profesor asistente, Departamento de Genética y Departamento de Patología. en Stanford Medicine. Además, agrega, están explorando genes mutados para determinar cuáles están asociados con la sensibilidad a los fármacos.

OncLive: ¿Qué destacó sobre la tecnología CRISPR en su presentación?

En una entrevista con Winslow durante el 2017 OncLive ® Estado de la Cumbre Científica sobre Cáncer de Pulmón Avanzado de Células No Pequeñas, compartió el trabajo sobre CRISPR que se está desarrollando en su laboratorio y cómo esta tecnología podría ayudar a avanzar en el tratamiento de la población de NSCLC no conductora.Winslow: Lo principal que estamos interesados ​​en hacer es desarrollar sistemas modelo donde podamos generar muchos tipos diferentes de tumores en modelos de ratón. Estos son genes del cáncer muy importantes. ¿Podemos crear modelos de ratón de cáncer humano? Tenemos una diversidad de genes diferentes mutados. Estamos analizando la diversidad de diferentes genotipos de tumores en ratones individuales para que podamos aprender primero sobre la biología de cómo estos genes mutados afectan el desarrollo del cáncer, o la progresión del cáncer, en el pulmón.

¿Cuál es la historia de CRISPR?

En segundo lugar, queremos usar estos modelos para comprender si hay ciertos genes, cuando mutan, en la enfermedad humana que podrían conducir a la sensibilidad a diferentes terapias. Estas pueden ser terapias que ya están aprobadas por la FDA para otros tipos de cáncer, pero no sabemos si hay algunos genotipos raros de tumores que responderán excepcionalmente a este tipo de medicamentos. Ayuda que estas plataformas que estamos desarrollando puedan ayudar a priorizar para llegar a pacientes con los genotipos correctos de tumores. Es una historia muy interesante de CRISPR, es originalmente de varios sistemas de órganos modelo donde lo descubrieron. Entonces, se aplica ahora a esta ingeniería del genoma, donde es bastante fácil diseñar estos componentes para crear rupturas en el ADN. Esas roturas pueden repararse de una manera en la que el gen ahora esté inactivo.

Entonces, en lo que respecta al modelo de cáncer, en lo que hemos estado involucrados es en tratar de aprovechar este sistema CRISPR para poder inactivar genes en este tipo de modelos de cáncer. Otras personas también han contribuido a este campo, por lo que ha sido un avance real. Antes de poder hacer estas cosas, realmente tomaría años o más observar una función de cualquier gen individual en un modelo de cáncer. Ahora, podemos observar decenas de genes en la misma cantidad de tiempo, y eso realmente ha sido un gran avance. Nuestra esperanza ahora es hacer más de eso, formas más eficientes y cuantitativas y luego comenzar a aplicar esta pregunta de buscar diferentes sensibilidades a las drogas, que es una pregunta muy abierta. Mucha gente está interesada en él.

En algún momento, ¿imagina que esto pueda funcionar más en modelos humanos?

¿Se puede aplicar algo de esto a la práctica clínica de los oncólogos comunitarios?

Para nosotros, con este tipo de sistemas, queremos abordar esto en tumores que crecen in vivo, no en líneas celulares que crecen en placas de Petri en el laboratorio, sino en un animal o tipo de huésped. Aquí es donde reconoceremos que lo que estamos viendo es cómo crecen en estos sistemas de modelos de ratón, pero está bastante cerca de las personas. Por lo tanto, esperamos poder conocer mejor este tipo de terapia. Ciertamente, las personas están usando CRISPR para inactivar genes de interés en líneas de células cancerosas o diferentes tipos de modelos. Habrá algún beneficio al hacer estos sistemas de ratón porque este es el único sistema en el que puede iniciar tumores a partir de una sola célula, en este caso, el pulmón del ratón, y se desarrollará hasta convertirse en un adenocarcinoma de pulmón metastásico. Con muchos de estos otros sistemas, cada sistema tiene sus propias ventajas y desventajas, por lo que creemos que es una gran ventaja aquí: que todo eso sucede de forma natural in vivo. Considerando que, todos los sistemas humanos se trasplantarán a ratones o crecerán in vitro. Tienen la ventaja de ser humanos, pero hay algunas desventajas relacionadas con eso. No creo que haya mucho de nuestro trabajo que se vaya a aplicar rápidamente a la práctica clínica, a menos que se den cuenta de la cantidad de esfuerzo académico que implica comprender esta enfermedad y pensar en nuevas terapias. No todo proviene de las compañías farmacéuticas, realmente hay un gran interés académico en eso.

No hay muchas mutaciones que conduzcan a la sensibilidad a los fármacos y, si bien se han realizado esfuerzos asombrosos, hay muchos pacientes que no tienen mutaciones procesables en la actualidad. Pero, ¿cómo los haces procesables? ¿Cómo hace las cosas para ayudar a esos pacientes? Estamos trabajando arduamente para mejorarlos y obtener terapias basadas en el conocimiento. Veremos cómo funciona.

Hay mucho que decir al respecto, especialmente porque los pacientes sin mutaciones conductoras constituyen la mayoría de la población con cáncer de pulmón.

Realmente no sabemos qué nos depara el futuro. ¿Vamos a encontrar que hay una fracción de tamaño razonable de la población pulmonar que puede ser dirigida con estos medicamentos que tal vez ya estén aprobados por la FDA para otros tipos de cáncer? Estó sí podría ser. Siento que llegué un poco tarde a esta idea de terapia personalizada, pero eso es en lo que nos estamos metiendo ahora.

¿Hay algo más en lo que esté trabajando en su laboratorio que le gustaría compartir?

¿Podemos al menos categorizar a las personas? Por ejemplo, ¿quizás el 1% de los pacientes se ve así? Y ahora, tal vez descubra cómo tratar a ese 1% de pacientes. Hace años, hubiéramos pensado que era tan complicado, como un problema. Ahora, siento que, en el aspecto académico, esa complejidad es manejable y no debemos tener miedo de que sea complicado. Podemos lidiar con eso. Si es el 1% de los pacientes los que están respondiendo a las terapias, nos parece bien. Esa es la dirección en la que vamos. La mayor parte de mi laboratorio está interesado en comprender los mecanismos que impulsan la metástasis. No el crecimiento del tumor y su tamaño, sino si adquieren estas características que les permiten dejar el tumor primario, diseminarse y formar metástasis en órganos distantes. Lo que estamos haciendo allí es ciencia bastante básica. ¿Cómo cambiaron las células para poder hacer eso? ¿Cuáles son los requisitos para que crezca en sitios distantes? Es algo que nos parece interesante si eso se convierte en objetivo es otra cuestión.

Si puede bloquear la metástasis con una molécula pequeña, ¿hay poblaciones de pacientes que se beneficiarán de esto? Esto es lo que estamos llevando a nuestros colegas clínicos de Stanford Medicine porque creemos que es realmente interesante. Una vez más, podría ser una pequeña fracción de pacientes, pero la metástasis es una parte realmente terrible de la enfermedad, así que ese es nuestro otro interés principal.


CRISPR / Cas9: el regalo de la naturaleza y # x02019s

CRISPR es principalmente un regalo de la Madre Naturaleza, donde los científicos lo descubrieron como sistema inmunológico procariota en bacterias y arqueas. El trabajo en CRISPR comienza a fines de la década de 1980 con varios hitos en este largo viaje (Tabla & # x000a0 1), sin embargo, las publicaciones fundamentales llegaron en 2012 para demostrar que un sistema CRISPR en Streptococcus pyogenes podría usarse para la edición del genoma, abriendo una nueva puerta para la ingeniería del genoma. En estas bacterias, Cas9 es responsable de escindir el ADN invasor & # x02019. Guiado por crRNA (CRISPR RNA) y tracrRNA (crRNA trans-activador que se combinará con fines de edición in vitro para producir gRNA), Cas9 puede apuntar a un sitio específico en el genoma y luego produce roturas de doble hebra (DSB) [32, 33 ]. El complejo compuesto por Cas9 y gRNA ataca la secuencia de ADN específica justo aguas arriba de la secuencia del motivo adyacente al protoespaciador (PAM), NGG (N representa cualquier nucleótido) [34, 35]. Casi el 60 y el 40% de las arqueas y las bacterias, respectivamente, utilizaron CRISPR de la misma manera, con pequeñas diferencias [36]. La ubicación CRISPR, en este sentido, sirve como una deposición de memoria donde las bacterias pueden almacenar ataques virales o plásmidos previos, y luego usaron esta información para defenderse de estos invasores en los próximos ataques.

Tabla 1

La cronología de los logros innovadores de la edición del genoma

AñoContribuyenteContribución
1987Yoshizumi Ishino y col.Descubrí algunas repeticiones en el IAP gen en Escherichia coli. No pudieron identificar la función principal de estas repeticiones [11].
1993Francisco Mojica y col.Caracterizó lo que ahora se llama un locus CRISPR como una memoria genética molecular y # x02019 de MGE (elemento genético móvil) que anteriormente atacaba la célula bacteriana. También descubrieron repeticiones en tándem (TREP) en Haloarchaea [12].
1996Yang-Gyun Kim y col.Diseñó genéticamente las primeras enzimas de modificación de restricción con la capacidad de cortar en secuencias diana específicas. Esta enzima era susceptible de ser utilizada en la edición de genomas [13].
2000Jeff Smith y col.Se llevaron a cabo varios experimentos para demostrar que las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) pueden generar roturas de ADN de doble hebra y, por lo tanto, podrían usarse como una herramienta de edición del genoma [14].
2002Marina Bibikova y col.Usó dedos de zinc por primera vez para alterar genes en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster [15].
2002Ruud Jansen y col.Se acuñó el término CRISPR que significa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas [16].
2004Alan Lloyd y col.Anunció el primer genoma vegetal modificado con Zinc Finger Nuclease, que es la herramienta que podría usarse en la edición de genomas. Esta herramienta también podría utilizarse para crear modelos de enfermedades genéticas humanas [17].
2005Alexander Bolotin y col.Descubrió un nuevo locus CRISPR en estreptococo thermophilus. También señaló que los espaciadores, que tienen homología con genes virales, comparten una secuencia común en un extremo. Esta secuencia se conocería más tarde como motivo adyacente protoespaciador (PAM) [18].
2006Eugene Koonin y col.Se sugirió que CRISPR es un sistema inmunológico que funciona interfiriendo con el ARN en las bacterias. También clasificó alrededor de 25 familias Cas distintas y predijo sus nuevas funciones [19].
2008John van der Oost y col.Demostró que las secuencias espaciadoras se transcriben en ARN CRISPR (ARNcr), que guían a la nucleasa Cas hacia el ADN diana del invasor [20].
2010Sylvain Moineau y col.Indicó que CRISPR / Cas9 genera DSB 3 nucleótidos corriente arriba de la secuencia PAM en el ADN diana [21].
2011Emmanuelle Charpentier y col.Descubrió otro tipo de ARN que se encuentra en los componentes del sistema CRISPR y # x02019s llamado ARN trans-activador (tracrRNA). Ella indicó que tracrRNA trabaja simultáneamente con crRNA en la dirección de la proteína Cas9 para cortar la secuencia objetivo [22].
2012Virginijus Siksnys y col.Indicó que Cas9 consta de dos dominios, que son RuvC y HNH, y que el primer dominio corta en la hebra de ADN distante, mientras que el segundo corta en la hebra donde se produce la integración entre el crRNA y el ADN [23].
2012Jennifer Doudna y Emmanuelle CharpentierDiseñó el dual-tracrRNA: crRNA como una quimera de ARN única llamada gRNA [24].
2013Feng Zhang y col.Anunció el uso de CRISPR / Cas9 en la edición de genes humanos, asunto que abrió la puerta al uso de CRISPR en el campo médico [25].
2015Feng Zhang y col.Introdujo Cpf1 como una nueva nucleasa que funciona de manera más eficiente que Cas9 [26].
2015Junjiu Huang y col.Informó la primera aplicación de CRISPR a embriones humanos no viables [27].
2016Kamel Khalili y col.Se utilizó CRISPR / Cas9 para editar el VIH a partir del ADN de una célula inmunitaria humana y, por lo tanto, también prevenir la reinfección de células no editadas [28].
2016Kevin Esvelt y col.Desarrolló la unidad genética CRISPR / Cas9 [29].
2017Jennifer Doudna y col.Desarrollaron un CRISPR-Gold, que es una nueva versión de la edición de genes CRISPR / Cas9, en esta nueva tecnología, utilizaron nanopartículas de oro para entregar el sistema de edición de genes CRISPR / Cas9 en las células [30].
2018Norbert Reich y col.Se introdujo un enfoque de edición del genoma activado por luz utilizando nanoesferas de oro huecas. Este enfoque es de 100 a 1000 veces más eficaz que los métodos actuales de edición del genoma [31].

Modelado de tumores basado en CRISPR / Cas9

El método clásico para transformar una célula normal en maligna requiere un proceso de varios pasos que implica una serie de mutaciones para adquirir dichas células, las características que caracterizan el fenotipo maligno [37 & # x0201339]. Aprovechando el poder de CRISPR / Cas9, muchos grupos de investigación pudieron crear tales modelos de cáncer (Tabla & # x000a0 2). Truncar APC El gen supresor de tumores en las células intestinales fue un representante exitoso de un evento temprano bien desarrollado en el desarrollo del cáncer colorrectal. los Wnt Los activadores de señalización se han eliminado del medio de cultivo para seleccionar APC-carece de células madre intestinales humanas, lo que provoca & # x003b2-estabilización de catenina y regulación al alza de Wnt vía [48] y [49]. Otros enfoques implican la creación de células con activados KRAS oncogén junto con mutación de pérdida de función. Es más, P53 también se desactivó con CRISPR / Cas9 [50, 51]. Usando estos enfoques, también podría generarse una combinación de mutaciones y luego probarse inoculando estas células editadas en ratones inmunodeficientes. Este modelo de cáncer responde a una inmensa pregunta, si la mutación que causa el cáncer ocurre al azar o en un orden de tiempo preciso.

Tabla 2

Modelos de ratón con cáncer basados ​​en CRISPR / Cas9 (revisados ​​en [40])

Tipo de cáncerCepa de ratónVectorGen o genes dianaReferencia
Adenocarcinoma de pulmónKras lsl-G12D / + LentivirusNKX, PTEN, APC[41]
Adenocarcinoma de pulmónCD1AdenovirusEML4[42]
Linfoma de BurkittArf / & # x02212 E & # x003bcMycRetrovirusp53[43]
GlioblastomaCrl: ratones CD1TransfecciónTRP53, PTEN, NF1[10]
Leucemia mieloide agudaRatones C57Bl / 6LentivirusDNMT3A, EZH2, RUNX1[1]
Linfoma de BurkittE & # x003bc - ratones MycLentivirusp53[44]
Adenocarcinoma de páncreasKrasLSL-G12D / +LentivirusLKB1[45]
Metástasis pulmonaresKras G12D / + p53 & # x02212 / & # x02212 LentiviralMúltiples aciertos[46]
Regresión tumoralFoxn1 nu ratonesTransfecciónPKC y # x003b2 A509T[47]

Se han utilizado estrategias similares para transducir una línea celular de cáncer de pulmón de ratón no metastásico con CRISPR / Cas9 que se dirige a varios genes que codifican proteínas junto con precursores de miARN. Chen, Peng [52] registró un crecimiento masivo de metástasis tumorales y pulmonares al inocular las células modificadas en ratones inmunodeficientes. Mediante una secuenciación profunda, el equipo descubrió varios genes novedosos cuya activación fue crucial para el crecimiento del tumor y la metástasis. Este enfoque permite recapitular el proceso de evolución y metástasis del tumor, lo que a su vez podría ayudar a diseñar terapias específicas dirigidas a los genes defectuosos [53].

Reprogramación de transcriptomas basada en CRISPR / Cas9

Los programas de transcripción controlan casi todos los aspectos de la vida del organismo desde las primeras etapas del desarrollo hasta la muerte [54]. El cáncer, como estado anormal de las células, tiene su propio programa de transcripción específico, que ha sido validado por CRISPR en varios tipos de cáncer, incluidos los carcinomas de ovario y de mama, donde se encontró que las células cancerosas muestran un patrón de regulación de la transcripción específico de la célula, con efectos epigenéticos. siendo las modulaciones los principales factores que afectan [55, 56]. Este programa podría interrumpirse inhibiendo CDK7, que representa una opción terapéutica potencial para el cáncer de mama, especialmente el tipo endocrino-resistente mediado por mutaciones del receptor de estrógeno (ER). La característica más impresionante es que CDK7 la inhibición no sólo perjudica el crecimiento celular del cáncer de mama, sino también la resistencia de las células de cáncer de mama MCF7 que responden a los estrógenos [57].

Se utilizaron CRISPR, ZFN (nucleasas con dedos de zinc) y TALEN (nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción) para activar y suprimir genes como estrategia para la terapia del cáncer. En la (Tabla & # x200B (Tabla3). 3) se destaca una breve comparación entre las tres principales herramientas de edición del genoma. La estructura de ambas herramientas las hizo adecuadas para sujetar activadores y supresores [58, 59]. Por el momento, estos activadores y supresores se fusionan fácilmente con dCas9, una mutación de Cas9 sin actividad endonucleasa. Recientemente, se pusieron a disposición más activadores / supresores de la transcripción basados ​​en dCas9 [60]. Se han utilizado aptámeros para reprogramar el epigenoma con el objetivo de reactivar los genes supresores de tumores hipermetilados (TSG) para recuperar la actividad supresora del crecimiento ejercida por estos TSG [61, 62]. Esta estrategia funciona en cánceres de hígado, colon, mama y pulmón. Este enfoque es una alternativa a las pequeñas moléculas / fármacos modificados epigenéticamente, que pueden tener efectos secundarios indeseables. Además, dCas9 se utilizó de manera eficiente para la desmetilación dirigida de BRCA1 promotor utilizando el dominio de desmetilación de TET1& # x02014la enzima que convierte 5-mC (5-metilcitosina) en 5-hmC (5-hidroximetilcitosina) & # x02014 en células de cáncer de cuello uterino y de mama. La edición de epigenomas basada en CRISPR / Cas9 también se utilizó para reprimir los receptores de interleucina (IL1R1) y factor de necrosis tumoral & # x003b1 receptorTNFR1) en células madre derivadas de tejido adiposo humano. Esto puede abrir la puerta para controlar varios tipos de inflamaciones que aceleran el crecimiento de diferentes tipos de cánceres [63 & # x0201365].

Tabla 3

Comparación entre las tres principales herramientas de edición del genoma

ZFNTALENCRISPR
NaturalezaProteína diseñada para apuntar a secuencias de ADN específicasProteína diseñada para apuntar a secuencias de ADN específicasSecuencia corta de ARN que puede apuntar a secuencias de ADN específicas.
Objetivo / sensibilidadInteracción proteína & # x02013DNA, menos sensibleInteracción proteína & # x02013DNA, menos sensibleInteracciones ARN & # x02013DNA, altamente sensibles
Tamaño del objetivo reconocido18 & # x0201336 & # x02009nt30 & # x0201340 & # x02009nt22 & # x02009nt
Fuera de orientaciónElevadoModerarBajo
EficienciaModerarModerarElevado
Nucleasa & # x02013 D / MDímero FokI & # x02013Dímero FokI & # x02013Monómero Cas9 & # x02013
Modo de acciónPara que ZFN funcione, se requieren dos conjuntos para hibridar cada uno con cada hebra de ADN alrededor de la secuencia objetivo.Para que TALEN funcione, se requieren dos conjuntos para hibridar cada uno con cada hebra de ADN alrededor de la secuencia objetivo.En presencia de ARNg, Cas9 puede alcanzar la secuencia de ADN diana y generar roturas de doble hebra.
CitotoxicidadModerarBajoBajo
Múltiples objetivosDifícilDifícilRealizable
Costo / beneficiosAlto costo y tiempoAlto costo y tiempoBajo costo y menos tiempo necesario

Sin embargo, se introduce una serie de modificadores de epigenética basados ​​en dCas9 para modificar las marcas de epigenética como una nueva forma de tratar varias enfermedades, incluido el cáncer.

Edición de ADN para la terapia del cáncer

Aunque la tecnología CRISPR se utilizó en el modelado y la detección del cáncer, también ofrece una forma sencilla de abordar la terapia contra el cáncer específica. Se han realizado muchos ensayos utilizando CRISPR para combatir esta enfermedad potencialmente mortal. E6 y E7 en el VPH han sido desafiados con CRISPR / Cas9 para inducir la maquinaria apoptótica e inhibir el crecimiento en la línea celular de cáncer de cuello uterino in vitro [66]. Mientras tanto, la deleción mediada por CRISPR / Cas9 del sitio de unión de miARN ubicado en la UTR (región no traducida) de F1H1& # x02014el gen que regula la angiogénesis en las células de NSCLC & # x02014 resultó en la recuperación de las anomalías vasculares que caracterizan al cáncer de pulmón [67].

El oncogén HER2 Los exones también son un objetivo para la intervención CRISPR, donde una mutación en el exón12 de HER2 resultó en un fenotipo mutante negativo dominante [68]. El mutante HER2 se encontró que inhibe la MAPK/ERK eje de HER2 vía de señalización necesaria para la proliferación de células de cáncer de mama. Controlar el cáncer de mama mediante la edición mediada por CRISPR de HER2 se mejora en presencia de PARP inhibidores que intervienen en la reparación del ADN y la muerte celular [69]. Este enfoque combinado representa una opción terapéutica potencial para el cáncer de mama.

Se realizaron cribados CRISPR letales sintéticos en todo el genoma para determinar la novedad como una opción terapéutica para el tratamiento del cáncer de mama endocrino resistente. Los cribados CRISPR identificaron un gen que está asociado con la respuesta a la terapia endocrina en numerosos estudios clínicos [70].

Con este fin, intentaron combinar dos componentes terapéuticos de la terapia endocrina ordinaria y un inhibidor del gen identificado por las pantallas CRISPR para reducir la resistencia endocrina en modelos de línea celular o xenoinjertos derivados del paciente.

Degradación de proteínas en el cáncer de mama

Una de las formas importantes de mejorar la proliferación de células tumorales es el aumento de la actividad de degradación de proteínas. De estas enzimas que degradan proteínas, viene el proteasoma 26S, una enzima multicatalítica que es responsable de la degradación de las proteínas, incluida la regulación del ciclo celular y las proteínas relacionadas con la apoptosis [71, 72]. En modelos de cáncer, se ha indicado que los inhibidores del proteasoma tienen propiedades anticancerígenas y potenciadoras de la apoptosis. Además, sensibiliza a las células tumorales a las señales proapoptóticas extrínsecas e intrínsecas. Por tanto, el proteasoma se ha convertido en un objetivo de los tratamientos antitumorales. Se ha indicado que la proliferación del cáncer de mama se controla mediante un proceso de fosforilación del proteasoma específico del sitio [24], y la interferencia y la interrupción de este proceso podrían ser valiosas para controlar la enfermedad.

Usando CRISPR / Cas9, se estableció la eliminación de quinasa 2 regulada por tirosina (DYRK2) de especificidad dual (las enzimas que fosforilan los componentes del proteasoma) para interrumpir la tumorigénesis de las células de carcinoma de mama humano adictas al proteasoma en ratones [73].

El cáncer de mama ER positivo podría tratarse mediante la inhibición de la síntesis de estrógenos mediante inhibidores de la aromatasa (IA) o mediante tamoxifeno y fulvestrant que compiten con el estrógeno en el ER& # x003b1. Mutaciones en ER& # x003b1 como ER& # x003b1Y537S y ER& # x003b1D538G hace que el cáncer de mama metastásico avanzado sea insensible a la IA y al tamoxifeno [74]. Para validar el efecto de estas mutaciones, ER positivo para cáncer de mama& # x003b1 El modelo se creó utilizando CRISPR / Cas9 en el que la versión de tipo salvaje de ER& # x003b1 fue reemplazado por ER& # x003b1Y537S o ER& # x003b1D538G. Estas células mutantes son parcialmente resistentes al antiestrógeno, es decir, se manifiesta independientemente del estrógeno. Se encontró que la resistencia a los antiestrógenos de las células mutantes está asociada con la regulación positiva de la respuesta de la proteína que reduce el RE& # x003b1 degradación [75].

Potenciador de la migración y la invasión (MIEN1) están implicados en la progresión del cáncer y la metástasis del cáncer de mama. Se ha encontrado que una mayor expresión de MIEN1 podría mejorar la migración tumoral y la metástasis. Usando CRISPR / Cas9, una deleción dirigida en este gen llevó efectivamente a derogar su expresión y, por lo tanto, a controlar la propagación de la enfermedad. Este enfoque nos permite comprender profundamente el rol MIEN1 juega en la carcinogénesis y la progresión tumoral, que podría transformarse en el futuro como una opción terapéutica del cáncer de mama [76].

Mutaciones en PTEN (homólogo de fosfatasa y tensina), son paso fundamental en el proceso de carcinogénesis. PTEN es un gen supresor de tumores que participa en la regulación del ciclo celular y en el control de la tasa de proliferación. Con CRISPR / Cas9, se apuntó a las células que inician el carcinoma de mama lobulillar invasivo (ILC) para interrumpir PTEN en ratones, pérdida de E-cadherina específica de la glándula mamaria. Este enfoque se puede utilizar para pruebas rápidas in vivo de genes supresores de tumores putativos subyacentes a la CLI [77].

Inmunoterapia mediada por CRISPR

Los subtipos moleculares de cáncer de mama tienen diferentes características según las cuales las células cancerosas responden a los estímulos intrínsecos (sistema inmunológico) o extrínsecos (ambientales) (Fig. & # X000a0 3). Un enfoque único para combatir las células del cáncer de mama es el uso de macrófagos editados con CRISPR / Cas9 en los que la proteína reguladora de señales alfa (SIRP-& # x003b1) está eliminado. Los macrófagos editados no podrán recibir la señal & # x0201c no me comas & # x0201d de CD47-SIRP& # x003b1 de las células cancerosas que conducen a destruirlo. Por otro lado, las células T podrían diseñarse para expresar un receptor de células T (TCR) específico del cáncer. Teniendo en cuenta que los TCR endógenos podrían competir con uno modificado, el TCR endógeno& # x003b2 fue eliminado en las células receptoras a través de CRISPR / Cas9. Las células T editadas con CRISPR resultantes eran 1000 veces más sensibles al antígeno del cáncer que las células T transducidas con TCR normales [78]. Mientras tanto, las células CAR T fueron editadas por CRISPR / Cas9 para generar células CAR T universales resistentes a la inhibición [79].


Historia y origen

Los seres humanos han estado diseñando la vida durante miles de años. Desde la antigüedad, la humanidad ha cambiado el curso de la evolución a través de una selección artificial cultivando las cicatrices de plantas y animales obtenidas a través de mutaciones aleatorias que son de lo más útiles y significativas. A través de la cría selectiva, fortalecimos los rasgos útiles en plantas y animales. Sin embargo, este proceso lleva mucho tiempo. Nos volvemos muy buenos en esto, pero nunca entendimos completamente cómo funcionaba hasta que descubrimos el ADN. En el siglo XX, se descubrió la estructura del ADN y se descubrieron muchas oportunidades de exploración. En la década de 1970, se intentó acelerar estas mutaciones tratando cultivos de plantas con diversos factores mutagénicos como radiación o productos químicos y seleccionando los útiles. En la década de 1970, los científicos insertaron fragmentos de ADN en bacterias, plantas y animales para modificarlos con fines de investigación, medicina, agricultura e incluso por diversión. Esto marca el comienzo de la ingeniería genética. Hoy en día producimos muchas sustancias mediante ingeniería genética como factores de coagulación que salvan vidas, hormonas como la insulina y la hormona del crecimiento, factores de crecimiento y otros. Todas las cosas que teníamos que extraer de los órganos de los animales antes de eso.

Durante su evolución, las bacterias han desarrollado un conjunto de barreras para protegerse contra invasores como los ácidos nucleicos de fagos y plásmidos. Existen diferentes sistemas de defensa procariotas y al menos dos de ellos se dirigen directamente al ADN entrante: los sistemas de restricción-modificación (RM) y CRISPR-Cas. Ambos sistemas son compatibles y actúan juntos para aumentar la resistencia bacteriana a los fagos escindiendo sus respectivos sitios diana y para disminuir la contaminación por fagos.

Se identificó una secuencia específica de genes recurrentes en E. Coli, que muestra cinco secuencias altamente homólogas de 29 nucleótidos, dispuestas como repeticiones directas con 32 nucleótidos como espaciamiento [1].

Haloferax Mediterranei es un organismo arquebacteriano con tolerancia extrema a la sal y la alta concentración de sal afecta la forma en que las enzimas de restricción cortan el genoma de los microbios y rsquos. En los fragmentos de ADN examinados, se encontraron múltiples copias de una secuencia repetida casi perfecta, aproximadamente palindrómica, de 30 bases, separadas por espaciadores de aproximadamente 36 bases que no se parecían a ninguna familia de repeticiones conocidas en microbios [2].

El nombre CRISPR - Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas fue propuesto por Jansen, et al. [3]. En 2005 se encontró que las repeticiones en la secuencia eran genomas de bacteriófagos u otro origen extracromosómico [4]. En 2007 se informó que CRISPR proporciona resistencia contra virus en procariotas [5, 6].

El sistema CRISPR-Cas es un "sistema inmunológico" bacteriano contra los bacteriófagos. Es una secuencia del genoma bacteriano que consta de regiones cortas repetibles de ADN palindrómico de 30-40 pares de nucleótidos de longitud. Están separados por secciones de ADN llamadas & quotspacers & quot. Estas regiones son diferentes y se ha encontrado que encajan perfectamente con el ADN del bacteriófago que la bacteria ya ha encontrado. Asociadas con la secuencia CRISPR hay regiones de los genes DNA-Cas (secuencias asociadas a CRISPR) que codifican la información de la proteína CAS. Son principalmente helicasas y nucleasas. Debido a esto, CRISPR se denomina & ldquosistema inmunológico de bacterias & rdquo [7,8]. En 2009 Hale, et al. publicaron pruebas de que el sistema CRISPR-Cas protege a los procariotas de los virus y otros posibles invasores del genoma a través de un sistema de silenciamiento de ARN único que funciona mediante la escisión dependiente de homología de los ARN invasores [9]. En 2010, Maraffini y Sontheimer definieron el mecanismo de auto / no auto-reconocimiento CRISPR a través de pequeños ARN CRISPR (ARNcr) que contienen un espaciador completo flanqueado por secuencias de repetición parcial [10-12].

El CRISPR / Cas & ldquoinmune system & rdquo está notablemente adaptado para escindir rápidamente el ADN invasor y tiene el potencial de generar cepas microbianas más seguras [13].


¿Cómo se usa CRISPR-Cas9 en la investigación del cáncer?

Desde sus inicios, la técnica CRISPR-Cas9 de edición del genoma se ha utilizado en una miríada de estudios de investigación básica sobre el cáncer. Al eliminar, inactivar o modificar genes específicos en células cultivadas o en modelos animales, los investigadores han podido estudiar el papel de estos genes en el desarrollo y la progresión del cáncer, proporcionando información sobre cómo prevenir o tratar ciertos cánceres.

En algunos casos, CRISPR-Cas9 se ha utilizado para estudiar el papel de un gen específico de interés, como en un estudio publicado el mes pasado en la revista AACR. Cáncer Investigar. En este estudio, los investigadores utilizaron la técnica para comprender cómo la inactivación del gen BRG1, que comúnmente está mutado en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, contribuye a la progresión del cáncer. Utilizaron la edición CRISPR-Cas9 para eliminar BRG1 en líneas celulares de cáncer de pulmón y encontraron que las células deficientes en BRG1 tenían un mayor estrés de replicación y eran sensibles a la inhibición farmacológica de la proteína del punto de control ATR, revelando un mecanismo de progresión del cáncer y una potencial oportunidad terapéutica para la tratamiento del cáncer de pulmón.

Una aplicación adicional de CRISPR-Cas9 se encuentra en las pantallas genéticas, donde cientos de genes se eliminan individualmente para identificar proteínas reguladoras clave, posibles dianas de fármacos y / o para probar las respuestas a fármacos experimentales de una manera relativamente rápida. Este enfoque fue ejemplificado por otro estudio publicado el mes pasado en Investigación sobre el cáncer, que utilizó un cribado genético CRISPR-Cas9 para identificar posibles dianas terapéuticas para el cáncer de pulmón. Al eliminar individualmente más de 500 genes diferentes que interactúan con la cromatina o la modifican, los investigadores determinaron que la eliminación de la histona chaperona nucleofosmina 1 redujo significativamente la progresión del tumor in vitro e in vivo, identificando así un objetivo farmacológico potencial.


Aplicaciones biomédicas

Considere la fibrosis quística, por ejemplo. Cystic fibrosis is characterized by an excessive accumulation of mucus, notably in the respiratory tract. The problem ultimately stems from a genetic error. The CFTR gene, which encodes a protein used to transport ions across the cell membrane, is faulty. As such, chloride ions are not successfully transported, which leads to the formation of thick heavy mucus, chronic respiratory disability, and reduced life expectancy. CRISPR could potentially be used to correct this genetic mistake.

Scientists could create a CRISPR-Cas9 complex to target and cut the CFTR gene. This alone would not solve the problem, as the gene was already not functioning correctly. But if a piece of donor DNA containing the correct version of the CFTR gene were also provided, then this new correct version would be edited into the chromosome via HDR. In 2013, Hans Clevers used this exact approach to correct the cystic fibrosis mutation in human cells cultured in the laboratory (Schwank et al., 2013).

Although Clevers's experiment was groundbreaking, there is one obvious problem. Every cell in an adult cystic fibrosis patient possesses the faulty CFTR gene. As such, researchers would have to find a way to introduce the CRISPR repair mechanism into every adult cell, or at least into those of the respiratory tract. This would be extremely difficult to do. The ideal scenario would be to introduce CRISPR-Cas9 into the fertilized egg or early embryonic stage of someone with cystic fibrosis so that all future body cells of the adult organism would contain the corrected gene.

Many scientists, however, have expressed concern with performing such an experiment. It is one thing to treat the existing cells of an adult. It is quite another to genetically alter a human embryo, as this opens up additional ethical concerns. Indeed, CRISPR was opening a veritable Pandora's box of bioethical questions. In January 2015, Jennifer Doudna organized an international meeting of scientists and policymakers to discuss the pros and cons of the potential uses of CRISPR, including the editing of human embryos. The attendees agreed that editing human embryos crossed a bioethical line and began authoring a self-imposed ban on such a procedure. Little did they know that Chinese scientist Junjiu Huang had already crossed that line.

Huang had injected 86 embryos with CRISPR-Cas9 (Liang et al., 2015). His goal was to correct a gene associated with a blood disorder called beta thalassemia. Only four embryos were edited successfully, and many were found to have unintended (off-target) mutations. The experiment was so controversial and arguably unsuccessful that Huang's paper was rejected by both Ciencias y Naturaleza, the world's premier scientific journals.

In 2016, Chinese scientist Lu You reported the first use of CRISPR to treat an adulto patient (Cyranoski, 2016). The patient had a form of lung cancer and, unfortunately, the patient's T-cells were unable to recognize and destroy the tumor. Lu removed the patient's T-cells and then used CRISPR to disable the PD-1 gene. This alteration would allow the T-cells to attack the cancer cells. The T-cells were then injected back into the patient with the hope that they would fight off the tumor. Lu has treated additional patients with the CRISPR-based therapy and the results appear promising. Similar trials are now under way in the United States.

The potential biomedical applications of CRISPR are far-reaching. Thousands of individuals die each year in need of an organ transplant (heart, lung, liver, kidney, etc.). Patients must wait until an appropriate donor is available, often the result of a tragic accident. Even then, the donated organ must be a very close genetic match to ensure that the organ is not rejected. Jun Wu, a research scientist now at the University of Texas Southwestern Medical Center, is pioneering a solution.

Wu's goal is to develop interspecies organ donation. As part of his research, he and colleagues at the Salk Institute used CRISPR to grow rat organs inside the body of a mouse (Wu et al., 2017). First, they used CRISPR to turn off the organ-producing genes inside a mouse blastocyst. This step alone demonstrates the power of CRISPR technology, as it required the simultaneous modification of multiple genes, a nearly impossible task with existing methods of gene editing. They then inserted rat stem cells into the mouse blastocyst in hopes that the rat cells would generate the missing organs. The experiment worked, resulting in a hybrid organism called a chimera (Figure 7A). Wu and his colleagues managed to produce a mouse with rat organs (heart, eyes, pancreas, etc.). These organs could theoretically be harvested from the chimeric mouse and donated to a normal rat without risk of rejection.

Creation of a chimera using CRISPR-edited blastocyst and stem cells (Wu et al., 2017). (A) CRISPR was used on a mouse blastocyst to knock-out the genes associated with organ development. The blastocyst was then injected with rat stem cells capable of producing organs. The procedure resulted in the formation of a mouse/rat chimera. (B) A procedure similar to that described in A was used to create a pig/human chimera.

Creation of a chimera using CRISPR-edited blastocyst and stem cells (Wu et al., 2017). (A) CRISPR was used on a mouse blastocyst to knock-out the genes associated with organ development. The blastocyst was then injected with rat stem cells capable of producing organs. The procedure resulted in the formation of a mouse/rat chimera. (B) A procedure similar to that described in A was used to create a pig/human chimera.

Wu would like to use this technology to produce human organs inside another species of animal. Obviously rats and mice are too small, but it turns out that pig organs are remarkably similar in size and structure to human organs. Using the same approach, Wu inserted human stem cells into a pig blastocyst and the experiment worked. Figure 7B is a picture of the first pig/human embryo – a chimera. The embryo was removed for study after 28 days (first trimester of pig pregnancy), which allowed enough time for sufficient cell growth without raising ethical concerns.

The potential applications of CRISPR are limitless. Table 1 provides a partial list of CRISPR applications along with a reference to jump-start a student's interest in the topic.

Various applications of CRISPR technology.

Application . Reference to Explore .
Biomedical
Diabetes https://www.healthline.com/diabetesmine/could-gene-editing-be-used-cure-diabetes#1
Cáncer https://www.statnews.com/2019/05/02/crispr-targeting-cancer-seeking-go-ahead/
VIH https://www.sciencemag.org/news/2019/03/curing-hiv-just-got-more-complicated-can-crispr-help
Food biotechnology
Mushrooms https://www.foodsafetynews.com/2018/12/the-little-mushroom-that-could-with-a-little-help-from-its-friends/
Soybean oil https://www.the-scientist.com/news-opinion/gene-edited-soybean-oil-makes-restaurant-debut-65590
Vacas https://www.wired.com/story/crispr-gene-editing-humane-livestock/
Basic research
Gene drives https://www.synthego.com/blog/gene-drive-crispr
Cellular barcoding https://www.nature.com/articles/d41586-018-05934-z
Gene targeting with deactivated Cas9 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4922510/
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Basic research
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Learning lessons from anti-CRISPR architecture

Anti-CRISPRs are a recent discovery utilized by phages to fight against CRISPR-Cas-acquired resistance in prokaryotes. A striking feature of anti-CRISPRs is that these proteins are diverse and lack sequence similarity. To probe the origin and evolution of these anti-CRISPRs, a comprehensive and careful analysis of anti-CRISPR proteins has been performed. Here we have reviewed the structural and functional similarities and differences between anti-CRISPRs. Especially, we propose that scientists should not be spectators of this bacteria–phage arms race. The human species lives through wars and suffers from diseases, the invasion of pathogenic bacteria and viruses, and natural disasters. We should make more effort to study this microbial evolutionary war and draw a lot of lessons from it. For example, through investigating the phage–bacteria interaction, we can better understand the molecular mechanism of the arms race between viruses and their hosts. To date, by utilizing the CRISPR-Cas adaptive immune system from bacteria, scientists have made great progress in developing effective gene editing tools, with CRISPR-Cas9 technologies now being the most commonly used and powerful genome engineering tools [71,72,73,74,75,76,77]. However, side effects resulting from alternative cleavage still occur [78,79,80,81,82]. The discovery of anti-CRISPRs provides a lamp, highlighting the way to regulate the genome editing activities of CRISPR-Cas9. By utilizing the anti-CRISPRs from phages, we hope to develop a braking system for gene editing, to make sure that therapies based on gene editing can be fully controlled.


CRISPR/Cas9 resources

Hundreds of online methods are available for CRISPR/Cas9 gene editing, construct designing with double stranded breaks, single stranded breaks, functional knockouts, plasmid with active gene expression, repress gene expression, tagging protein, finding target sequences and many others. A large number of resources have been developed which are being used for application in genome engineering, for identification of CRISPR target site and for selection of gRNA. Multiple online resources are available forcommercially available kits/ plasmids and CRISPR/Cas9 construction, as few are mentioned in Table 2.

Numerous vectors are used for Cas9 according to the desired gene modification to be performed. The desired modifications include single strand break (SSB), double strand break (DSB), activation of gene expression, repression of gene expression and tagging of proteins knockout genes, these tools working so that any user can design construct with selectable marker, and different gene to be inserted according to their own demands. Many of them are freely accesible, but some are paid as well, depicted in Table 3.

In addition, miscellaneous online resources are available for the designing of sgRNAs which provide information about OTs without limiting the PAM or number of mismatch bases, for finding potential off targets in any genome, identification and ranking all sgRNA targets sites according to off target quality, help in inquiry of guide sequences [32], and few of them are described in Table 4 with pros and corns.


CRISPR’s Potential and Dangers: Is CRISPR Worth the Risk?

The gene editing technology CRISPR has prompted both breathless predictions of medical breakthroughs and warnings of apocalypse. Yale Insights asked Dr. Greg Licholai, a biotech entrepreneur and a lecturer at Yale SOM, to explain CRISPR’s potential and dangers.

Recently, HBO’s John Oliver opened a Last Week Tonight segment with a series of video clips about gene editing—some of them news reports promising amazing breakthroughs, others movie scenes depicting genetic engineering gone terribly wrong.

“It seems gene editing is going to eliminate all disease,” he concluded. “Or kill every last one of us.”

For decades, advances in generic engineering have prompted both breathless predictions of a wondrous future and warnings of apocalypse. Both have gotten louder in the five years since the development of CRISPR, which allows for much more precise editing of genes than previously existing tools.

In 2017, for the first time, scientists used CRISPR to repair a genetic mutation—one that could cause a heart defect—in an embryo. Reporting the breakthrough, the New York Times said that “it raises the prospect that gene editing may one day protect babies from a variety of hereditary conditions.” But in the article’s third paragraph, the newspaper added that the successful experiment “is sure to renew ethical concerns that some might try to design babies with certain traits, like greater intelligence or athleticism.”

In the last few months, more immediate concerns have arisen about CRISPR. A series of studies have suggested that CRISPR may cause cells to lose their cancer-fighting ability, and that it may do more damage to genes than previously understood. “It is important that anyone thinking of using this technology for gene therapy proceeds with caution, and looks very carefully to check for possible harmful effects,” said researcher Allan Bradley in a release from the Wellcome Sanger Institute.

Do CRISPR’s benefits outweigh the risks? Yale Insights asked Dr. Gregory Licholai, a biotech entrepreneur who serves as a lecturer at Yale SOM and chief medical and information officer at PRA Health Sciences, to explain the technology’s potential and dangers.

What is CRISPR and how is it different from the methods that have been used to manipulate genetics before?

CRISPR is this fascinating, powerful technology. It’s got a very clunky name. It’s called Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats. Now what does that mean? The name actually refers to the way it interacts with DNA. It’s a way to manipulate DNA, to edit DNA, in a way that is much more powerful than previous methods, much simpler, much cheaper. And the important part is it’s exceptionally precise.

So as you probably know, our book of life is made of DNA. DNA itself is many millions of base-pairs, which is like a language. And within that language, there are certain regions which code for genes, and those genes are incredibly important because those genes go on to make up everything about us. There’s 40,000 proteins that become outputs of those genes and they are involved in our health, our wellbeing, and any defect in those genes becomes problematic and causes disease.

What was previously attempted with gene editing was to manipulate genetic information in blocks, basically in big pieces. It’s kind of like trying to edit a book by only being able to rip out a page at a time and transfer a page at a time, without really being able to control the actual words. The power of this technology: it literally comes down to the individual letters. So the precision is far better than anything that has happened before. The excitement in the scientific community is being able to go in and very precisely make changes in DNA of actual genes that you can actually turn off bad genes or you can potentially repair genes that have got mutations in them where the code is written incorrectly.

There had been previous gene-editing technologies, such as viral gene editing, gene replacement, and those have developed over several decades. One of the most fascinating things about CRISPR is how quickly everything is developed, so in less than 10 years since the initial descriptions and initial papers were written, this technology has just exploded. It’s been less than five years since the initial patents were written, and since then at least a half-dozen companies have been formed, all of them are racing forward to try to get a leg up on each other to try to proceed with using CRISPR for various applications.

What are some of the applications, in the somewhat reasonable, predictable future?

There are three main applications for CRISPR. One is in manipulating genes to turn them on or off within people. Another is to create medications that can be infused, or in some cases, self-therapy—taking blood and certain cells out of a body, manipulating them with CRISPR, and then putting them back in. The third, which sometimes is overlooked, is actually in farming. Both farming with animals as well as farming with crops. And in fact, the application of CRISPR to foods has already been done. There are companies that have already been using CRISPR to create enhanced foods to resist bacteria or viruses. To create even better-tasting foods. And that’s already being done.

Similarly, the application of CRISPR to animals has already been done. They actually call them CRISPR mice, and they are already being used in the research community. The ability to apply it to larger animals such as food animals is in the very near future.

In terms of human health, we can divide that into two different categories. One is taking cells out of the body, manipulating them in the laboratory—either removing a defective gene or adding and enhancing an ability to do something by turning on a gene or fixing a gene—and then putting those cells back in the body. That’s one category. The other category would be actually injecting something into the body which can edit people’s genes so that within their own tissues those genes can either be turned on or off. And all of these have got some pretty profound complications and risks.

Can you give an example of a disease that could be treated?

There are over 7,000 monogenetic diseases that we can trace back to a single gene that has a defect. Often those genes have multiple mutations. But at least a single gene has been identified. The most promising application of CRISPR would be to modify those monogenetic diseases. And those monogenetic diseases, they broadly fall into two categories, curiously named toxic gain of function and toxic loss of function.

Toxic loss of function is kind of intuitive. That means the gene has got a defect in it the person loses the function of that protein and that causes the disease. So a well-known, well-studied example would be sickle-cell anemia. A single base-pair mutation actually causes a change in the structure of hemoglobin that then creates this unique sickle-cell shape for red blood cells.

An example of toxic gain of function is disease called transthyretin in which a mutation causes a clumping up of different proteins. And that leads to a disease called amyloidosis, where these proteins, which normally don’t stick together, because of this kink in them due to the mutation, they become very sticky. They form aggregates and those aggregates can build up in various cells in the body. Sometimes the brain, sometimes the heart.

CRISPR could potentially be useful in either one of those, and in fact there are companies that are looking at those diseases, as well as a number of others. Other monogenetic diseases would be cystic fibrosis, beta thalassemia, glycogen storage disease, Behçet’s disease, Fabry disease. Some of these are quite rare, like Fabry disease, but some are more common, like cystic fibrosis, which is the most common genetic disease in Caucasians.

So genetic diseases is one category. Another category is oncology. It’s been well known now for some years that our own immune system has the ability to fight cancer cells and essentially dissolve micro-tumors. But cancer is a clever entity—it evades the body’s internal immune system. So what that means is that the cancer becomes invisible to our immune cells, and that invisibility is due to certain proteins that are created as checkpoints to interfere with the immune system attacking ourselves. Cancers, essentially, mimic our own cells by taking advantage of these checkpoints.

So one of the applications of CRISPR would be to remove immune cells from the body, apply the CRISPR technology, and then turn off these checkpoints and put those immune cells back in the body with the hope that then those immune cells would clear the tumor away.

What are the risks of this? Are the risks to the patient? Or to all of us?

One of the biggest risks of CRISPR is what’s called gene drive, or genetic drive. What that means is that because you’re actually manipulating genes and those genes get incorporated into the genome, into the encyclopedia, basically, that sits within cells, potentially those genes can then be transferred on to other organisms. And once they’re transferred on to other organisms, once they become part of the cycle, then those genes are in the environment.

That’s probably the biggest fear of CRISPR. Humans manipulating the genetic code, and those manipulations get passed on generation to generation to generation. We think we know what we’re doing, we think we’re measuring exactly what changes we’re doing to the genes, but there’s always the possibility that either we miss something or our technology can’t pick up on other changes that have been made that haven’t been directed by us. And the fear then is that those changes lead to antibiotic resistance or other mutations that go out into the population and would be very difficult to control. Basically creating incurable diseases or other potential mutations that we wouldn’t really have control over.

Is there consensus on how to proceed?

There’s been discussion in the scientific community in the United States and globally about how to proceed with CRISPR. And particularly some very high-placed scientists, in the United States, for example, the former director of the National Institute of Health, have called for a self-imposed ethical moratorium on CRISPR until more is known. Not on all types of CRISPR research, but for certain types of CRISPR research. Particularly on these germline mutations that could potentially be passed on through generations. Some of the inventors of the patent-holders of CRISPR technologies who are now the inventors of the various companies in biotechnology, they’ve also imposed their own moratoria on working in germ lines until more is understood. So there are parts of the scientific community that are very concerned and are trying to be very thoughtful about how to proceed and how to proceed safely.

In the United States, there have been some regulations against moving forward in areas that aren’t safely understood. That doesn’t exist in other parts of the world, in particular in China. So there’s been several examples now of where China has leaped ahead of what’s going on in Europe or the United States but, the concern is, without the kind of regulatory and ethical safeguards that are in place in other countries.

You mentioned that there’s, in the U.S. at least, there’s a moratorium on germline mutations. Do the kinds of treatments that you’ve talked about before, do those require the germline modification, or can they be done within the stricture of that moratorium?

No, the treatment of most of those diseases, monogenetic diseases—things like cystic fibrosis, sickle-cell, beta thalassemia—those are not germline mutations. So theoretically, it would be safe to be able to treat those patients without the theoretical concern of affecting germ lines and affecting gene drive. The same thing with oncology. Theoretically you’re just taking cells out. You’re only treating immune cells and they’re not going replicate. On the other hand, as soon as people start talking about stem cells and then manipulating stem cells and then reusing those, then those stem cells can potentially affect other cells that replicate. The risk is low, but there’s definitely a risk there.

One of the other places that this is being actively worked on is, again, in animals. The idea would be to introduce mutations into, say, malaria-bearing mosquitoes, and let them in the wild and eradicate mosquitoes. Or eradicate certain types of invasive plants by introducing some kind of genetic manipulation that gets passed on and, again, you take out that one particular species. Again, it raises concerns. We think we know what we’re affecting if we manipulate one gene for that particular species. We think we know what we’re affecting if we just affect one particular species in an ecosystem. The truth is we probably don’t, and there’s always some surprises.

You mentioned that Chinese researchers are operating in different structure. Can you expand on that, on what regulations they have and what that means in terms of their competition with companies in the U.S.?

One of the dramatic examples happened in 2016. There had been a self-imposed moratorium in the United States and Europe to work on germ cells, germ lines. And that would include human embryos. Now, at the same time, reports came out of China that researchers had begun working on human embryos. Initially in 2015 and ’16, the reports were that the experiments were negative, and at least the Chinese researchers had claimed that they were working with nonviable human embryos anyway. In the short time since then, in the year and a half since then, those experiments have been repeated, apparently with scientific success, whatever that means. But without the kind of self-imposed regulation or even organizationally imposed regulation that we would have by the NIH or the scientific community in the United States and Europe.

Another example is that researchers in China have actually proceeded to human clinical trials using CRISPR much faster than has been possible in the United States. Normally, the clinical trial process to test any new therapy requires several very well studied stages. The first stage is to test in animals to make sure that there’s complete safety. Then it goes into very limited testing in human beings, just for safety, and then proceeds from there. Apparently in China, they took the animal data and they went right into therapeutic trials in human beings. And the most recent reports that are that somewhere between 80 and 100 people are already being tried, or already being tested using CRISPR.

We know that in China, they’re using CRISPR for cancer therapy. That’s the example where cells are taken out of the body, their immune cells are manipulated with CRISPR and then they’re re-infused. It’s too early to tell if it’s successful or not. But there is a lot of concern that the regulatory authorities in China have been extremely permissive with allowing these technologies to move forward. And that has a lot of profound implications.

How fast is this technology changing? Given that it’s moved as far as it has in 10 years, where do you expect it to move in another 5 or 10 years?

It’s changing pretty fast. Just in the last few months, there’s new developments in the field in CRISPR. Some is around competition, with new companies being formed. In fact, one of the original developers of CRISPR science that comes out of the Broad Institute at Harvard/MIT just set up a new company. Another scientific development is that there’s now scientific evidence that perhaps in some people, they have naturally occurring immunity, if you will, to CRISPR. They have naturally occurring substances that actually will turn off any kind of CRISPR that’s put into them.

All of these things are brand new, and they’re all being sorted out by scientific community, by these biotech companies. So it is changing very quickly. And the other thing that’s changing is the effect of this international competition. I don’t think anybody could have predicted that other countries, and China in particular, would be so quick to embrace this technology and really leap forward ahead of everybody else.

Are there any other safety concerns with CRISPR?

As with any new technology, there could be scientific bumps in the road. The safety concern is that in this field is moving so quickly and some researchers want to get into human clinical trials right away, even before the CRISPR technology paradigm has been fully validated. There are some recent reports in the scientific literature that this approach is not as precise as advertised. In other words, we think we are editing one letter of the book of life, but it actually entire pages might be getting altered in unintended areas. The long-term danger is unintended changes to the genome of an organism that go on and get carried through to the next generation. The safety risk is unknown changes in genes that get transferred to the population that could have no consequence or could be harmful.

How can we ensure that the field progresses in a safe way?

The drug development process is tightly regulated across the world. In the United States the FDA closely monitors safety of any investigational drug, and all CRISPR drugs intended to go into people would have to meet the same rigorous testing standards. The same situation exists for Europe and the rest of the world where regulatory authorities largely work in harmony. However, there are exceptions, as with some of the human embryo testing that has been reported in China. We should make sure that the level of international scientific regulation and cooperation continues so the scientific developments can continue but also ensure safety.


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