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4.5: Revisión de los procedimientos de tinción - Biología

4.5: Revisión de los procedimientos de tinción - Biología



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Para ayudarle a revisar los procedimientos de tinción en los laboratorios 3 y 4, complete la siguiente tabla con información sobre estos procedimientos de tinción. Esta información debe incluir (pero no limitarse a) lo siguiente:

  • ¿Qué le dice el procedimiento de tinción sobre la estructura de las células bacterianas o los tipos de estructuras producidas por las bacterias?
  • ¿Se utiliza el procedimiento de tinción para detectar tipos específicos de células? Si es así, ¿Que son?
  • ¿Cómo se ven los resultados positivos y negativos al final del procedimiento?
  • ¿Existe alguna relevancia clínica para los resultados del procedimiento de tinción?
  • Cualquier otra información que le ayude a comprender qué detecta el procedimiento de tinción y cómo funciona.

Ejercicio ( PageIndex {1} )

Procedimiento de tinciónInformación
Gramo
Ziehl-Neelson
Schaeffer-Fulton
Nitrato de plata
Tinción negativa

Descripción general de las técnicas de inmunohistoquímica / inmunofluorescencia múltiple en la era de la inmunoterapia contra el cáncer

La inmunohistoquímica convencional (IHC) es una técnica de diagnóstico ampliamente utilizada en patología tisular. Sin embargo, esta técnica está asociada con una serie de limitaciones, incluida la alta variabilidad interobservador y la capacidad de etiquetar solo un marcador por sección de tejido. Esta revisión detalla varias técnicas altamente multiplexadas que han surgido para eludir estas limitaciones, lo que permite la detección simultánea de múltiples marcadores en una sola sección de tejido y el estudio integral de la composición celular, la función celular y las interacciones célula-célula. Entre estas técnicas, la inmunohistoquímica / inmunofluorescencia múltiple (mIHC / IF) ha resultado ser particularmente prometedora. mIHC / IF proporciona tinción multiplex de alto rendimiento y análisis cuantitativo estandarizado para estudios de tejidos altamente reproducibles, eficientes y rentables. Esta técnica tiene un potencial inmediato para la investigación traslacional y la práctica clínica, particularmente en la era de la inmunoterapia contra el cáncer.

Palabras clave: inmunofluorescencia inmunohistoquímica inmunoterapia multiplex descripción general.

© 2020 Los Autores. Cancer Communications publicado por John Wiley & Sons Australia, Ltd. en nombre del Centro Oncológico de la Universidad Sun Yat-sen.


Tinción de Gram bajo microscopio

La tinción de Gram es probablemente uno de los procedimientos de tinción más utilizados en el campo de la microbiología. Es una de las tinciones diferenciales que se utilizan para caracterizar bacterias en uno de dos grupos: bacterias gram positivas o bacterias gram negativas.

Las bacterias grampositivas suelen tener una mayor afinidad por el violeta cristal al aplicar el yodo de gram que la pared celular gramnegativa.

Al ser un mordiente, el yodo de Gram forma un complejo con el cristal violeta en la mancha que se ha adherido más firmemente a la pared celular de las bacterias gram positivas que la de las bacterias gram negativas.

Mientras que las bacterias gram positivas se tiñen de violeta como resultado de la presencia de una capa gruesa de peptidoglicano en las paredes de sus células, las bacterias gram negativas se tiñen de rojo debido a la capa más fina de peptidoglicano en su pared celular (una capa de peptidoglicano más gruesa permite la retención de la mancha, pero una capa más fina no).

Técnica

La tinción implica 3 pasos / procesos principales que incluyen:

o Tinción con violeta cristal (un tinte soluble en agua)

o Decoloración (usando etanol / acetona)

o Contratinción (usando Safranin)

Debido a las diferencias en el grosor de la capa de peptidoglicano en las paredes celulares de estas bacterias, las bacterias gram positivas retendrán la tinción cristal violeta después del proceso de decoloración con alcohol etílico / acetona.

Después de teñir la muestra con violeta cristal, se usa alcohol etílico para decolorar la muestra. Logra su propósito deshidratando la capa de peptidoglicano tensándola y encogiéndola. Al hacerlo, el cristal violeta grande no puede penetrar la capa apretada de peptidoglicano y, por lo tanto, queda atrapado en la pared celular de las bacterias gram positivas.

Por otro lado, la membrana externa de las células gram negativas no puede retener el complejo de yodo cristal violeta y, por lo tanto, se pierde el color.

La safranina es una mancha más clara en comparación con el cristal violeta y, por lo tanto, altera la coloración púrpura en las células gram positivas.

Teoría

En una solución acuosa, el violeta cristal se disocia en iones de CV + y CV-. Estos iones penetran en las paredes y membranas de las células tanto gram positivas como negativas.

CV + interactuará con los componentes cargados negativamente de las células bacterianas y tomará la coloración púrpura. Al agregar yodo, los cationes de yodo (I - o I 3 -) interactúan con CV +, lo que da como resultado la formación de complejos más grandes de CVI dentro del citoplasma y las capas externas de la célula.

Al agregar el agente decolorante (etanol), interactúa con los lípidos de la membrana tanto de los grampositivos como de los gramnegativos positivos y gramnegativos.

Esto da como resultado la pérdida de la membrana externa, que a su vez deja expuesta la capa de peptidoglicano. Para las células gramnegativas, el etanol hace que las paredes tengan fugas y, por lo tanto, no pueden contener los grandes complejos de CV-L durante la decoloración.

En algunos de los procesos de tinción que utilizan tinción de Gram, se obtiene un patrón de variables gram, que es una mezcla de rosa y violeta.

Algunos géneros, como Arthrobacter, Actinomyces y Corynebacterium, tienen una pared celular que es particularmente sensible a la rotura durante la división celular.

Esto da como resultado una tinción gramnegativa de las células gram positivas.

Por otro lado, en cultivos de Clostridium y Bacillus, el espesor reducido de peptidoglicano durante el crecimiento coincide con un mayor número de células que a su vez tiñen gramnegativas.

Preparativos

1. La tinción primaria (reactivos de violeta cristal para tinción)

o 2 gramos de violeta cristal (certificado 90 por ciento del contenido de tinte)

o 20ml de etanol (95 por ciento vol / vol)

o 0,8 gramos de oxalato de amonio,

o 80ml de agua destilada,

Mezclar A y B para obtener el reactivo de tinción violeta cristal y almacenar durante 24 horas.

2. METRO ordant (gramos de yodo)

o gramos de yoduro de potasio,

o 300ml de agua destilada,

Con un mortero, se muelen el yodo y el yoduro de potasio, mientras se agrega agua lentamente y se sigue moliendo hasta que todo el yodo se haya disuelto por completo. (Guarde esto en una botella de color ámbar)

3. Agente decolorante

o Etanol, 95 por ciento (vol / vol)

Sin embargo, acetona o acetona 1: 1 con etanol,

4. Contratinción (safranina)

o 10 ml de la solución madre (2,5 gramos de safranina O y 100 ml de etanol al 95 por ciento)

o 90ml de agua destilada

Procedimiento

Es importante tener en cuenta que el grosor del frotis de la muestra en el portaobjetos es una consideración importante durante la preparación de la muestra. La mancha no debe ser demasiado fina ni demasiado fina.

Bacterias - untar la muestra sobre el portaobjetos con una aguja de inoculación. Esto también se puede hacer introduciendo una gota de solución salina en el portaobjetos, seguida de la muestra y luego mezclando.

Luego, debe dejarse secar al aire antes de la fijación por calor pasando con cuidado el portaobjetos a través del mechero Bunsen (evite quemar la muestra).

Actinomicetos - Igual que las bacterias, pero tratando de colocar una parte de la colonia en el portaobjetos mientras aún está intacta, esto se puede lograr usando un bisturí.

Procedimiento de tinción

o Inunde el portaobjetos con reactivo de tinción violeta cristal durante aproximadamente 1 minuto,

o Lave el portaobjetos con un chorro suave e indirecto de agua del grifo durante unos 2 segundos, inunde el portaobjetos con un mordiente (yodo de Gram) y luego espere un minuto.

o Lave el portaobjetos para la espalda en un chorro suave e indirecto de agua del grifo durante unos 2 segundos,

o Inunde el portaobjetos con el agente decolorante y luego espere 15 segundos. Esto también se puede hacer agregando gota a gota al portaobjetos hasta que el agente decolorante que sale de los portaobjetos salga limpio.

o Inunde el portaobjetos con safranina de contratinción (y espere aproximadamente un minuto (30 segundos a 1 minuto)

o Lave el portaobjetos con un chorro suave e indirecto de agua del grifo hasta un punto en el que aparezca el color en el efluente y luego seque el papel absorbente.

o Agregue una gota de aceite de inmersión sobre la muestra teñida y observe bajo el microscopio

La tinción de Gram ayuda a caracterizar las bacterias como gram positivas o gram negativas, lo que permite a los entusiastas / profesionales del microscopista verificar la pared y la membrana de una célula bacteriana que, a su vez, influye en varias facetas de su patogenicidad y nivel de virulencia.


Nota: Antes de ejecutar el gel, asegúrese de que el gel, el aparato de gel y las muestras estén listos.

  1. Para ensamblar, saque los geles del marco de fundición y fíjelos en el aparato de gel (asegúrese de que la placa corta siempre mire hacia adentro y si solo tiene un gel para ejecutar, use la placa falsa que está disponible para equilibrar).
  2. Cuando las placas estén aseguradas, colóquelas en el casete y luego bloquéelo.
  3. Colóquelos en el tanque de gel para correr.
  4. Llene la cámara interior del tanque con tampón (ahora es fácil quitar el peine, ya que está lubricado).
  5. Retirar el peine CUIDADOSAMENTE (sin romper el pocillo).
    [Ahora el gel está listo para cargar las muestras]
  6. Enjuague la punta de carga varias veces con agua destilada. (Asegúrese de verter toda el agua antes de cargar las muestras).
  7. Inserte la punta de carga a unos pocos mm del fondo del pozo y entregue las muestras en el pozo. Enjuague la jeringa con agua destilada después de cargarla varias veces.
  8. Conecte la fuente de alimentación colocando la tapa (asegúrese de que la conexión esté en la forma correcta, es decir, negro - negro y rojo - rojo). Establezca el voltaje en 180 V y déjelo funcionar durante 1 hora (no permita que el frente del tinte se salga del gel).

Procedimientos generales de tinción y segmentación para imágenes y análisis de alto contenido

La microscopía de fluorescencia cuantitativa automatizada, también conocida como imagen de alto contenido (HCI), es un enfoque analítico de rápido crecimiento en biología celular. Debido a que el análisis de imágenes automatizado se basa en gran medida en una demarcación sólida de células y regiones subcelulares, los métodos confiables para etiquetar las células son un componente crítico del flujo de trabajo de HCI. El etiquetado de células para la segmentación de imágenes se realiza típicamente con sondas fluorescentes que se unen al ADN para la demarcación celular de base nuclear o con aquellas que reaccionan con proteínas para el análisis de imágenes basado en la tinción de células completas. Estos reactivos, junto con la configuración de los instrumentos y el software, juegan un papel importante en la segmentación exitosa de las células en una población para el análisis de imágenes automatizado y cuantitativo. En este capítulo, describimos los procedimientos estándar para el etiquetado y la segmentación de imágenes en muestras de células vivas y fijas. El capítulo también proporcionará pautas de resolución de problemas para algunos de los problemas comunes asociados con estos aspectos de HCI.

Palabras clave: CellMask CellTracker Imágenes de alto contenido Cribado de alto contenido Segmentación nuclear Segmentación.


Ver el vídeo: Tinción de Flagelos completa (Agosto 2022).