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¿Cuál es la latencia entre respuestas neuronales emparejadas en el cerebro?

¿Cuál es la latencia entre respuestas neuronales emparejadas en el cerebro?



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¿Existe algún dato sobre el tiempo que tardan las señales en propagarse de una neurona a sus vecinas en redes complejas, como el cerebro (en particular, el neocórtex)?

Si no es así, ¿hay alguna forma razonable de estimar al menos el orden de magnitud (por ejemplo, considerando el retardo sináptico, que es del orden de 0,5 ms y el retardo de disparo)?


Respuesta corta
Una indicación aproximada del retraso en las neuronas corticales conectadas monosinápticamente es de 6 a 14 ms.

Fondo
Como afirma correctamente @Jonathan, hay muchas variables involucradas en los retrasos neuronales. Sin embargo, debido a que solicita un estimación del orden de magnitud del retraso neuronal entre dos neuronas acopladas en el neocórtex, bastará con proporcionar las latencias informadas de un estudio que parece satisfacer muy bien sus demandas. En este estudio se reportaron los datos de latencia en neuronas conectadas horizontalmente en la corteza prefrontal del mono en la capa III González-Burgos et al (2000).

Los autores insertaron electrodos estimulantes para evocar potenciales de acción y utilizaron electrodos de registro distantes para medir las respuestas en células ubicadas distalmente del sitio de estimulación (Fig. 1).


Configuración de grabación utilizada en González-Burgos et al (2000).

Informan que los retrasos entre las conexiones monosinápticas oscilan entre 6 - 14 ms. La figura 1 muestra que estas estimaciones de latencia dependen de la posición de los electrodos de estimulación y registro, es decir, qué parte de la célula presináptica se estimula y qué parte de la célula postsináptica se registra. Más notablemente en la configuración de grabación utilizada, las colaterales de axón más largas habrán resultado en latencias más largas. Los autores concluyen que la velocidad de conducción de los axones colaterales horizontales fue 0.14 ± 0.04 Sra y el retraso sináptico se estimó en 2.29 ± 0.49 Sra.

Referencia
- González-Burgos et al., Corteza cerebral (2000); 10(1): 82-92


La velocidad de conducción puede variar en órdenes de magnitud en función de muchos factores, por lo que se necesitaría más información para obtener una respuesta útil. Las velocidades de conducción de axones no mielinizados oscilan entre aproximadamente 0,5 y 10 m / s, mientras que las velocidades de conducción de axones mielinizados pueden alcanzar hasta 150 m / s1.

Tampoco estoy seguro de a qué te refieres con "red densa". El cerebro no es una red densa y parece que estás incluyendo redes que no son cerebros.

[1]: Neurociencia (Purves D, Augustine GJ, Fitzpatrick D, et al., Editores. Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2001. 2ª edición).


Moriah L. Szpara

Moriah Szpara es profesor asociado en el Departamento de Biología y el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y los Institutos Huck para las Ciencias de la Vida, en la Universidad Estatal de Pensilvania (PSU). El Dr. Szpara es miembro del Centro de Dinámica de Enfermedades Infecciosas (CIDD) en Penn State y organiza la red Virology @ PSU. La formación inicial de la Dra. Szpara comenzó con su B.S. en Biología en PSU, con tesis de honor en Biología y Antropología. Luego, el Dr. Szpara recibió un doctorado. en Biología Molecular y Celular de la Universidad de California Berkeley, por sus estudios sobre los programas transcripcionales subyacentes al desarrollo neuronal. Como becaria postdoctoral en la Universidad de Princeton, la Dra. Szpara se capacitó con la Dra. Lynn Enquist en el área de los virus del herpes neurotrópicos e inició su investigación sobre genómica comparativa viral en el Instituto Lewis-Sigler de Genómica Integrativa.

El laboratorio de Szpara en Penn State se centra en la disección de las contribuciones genéticas virales a la virulencia, las contribuciones de la diversidad viral en entornos clínicos y de campo, y las interacciones moleculares del virus del herpes simple (VHS) con las neuronas del huésped. El laboratorio szpara utiliza enfoques que van desde análisis genómicos y bioinformáticos de la variación genética viral hasta respuestas humanas de las células neuronales a la infección. El laboratorio de Szpara también ha producido paquetes de software de código abierto para facilitar el ensamblaje y la comparación del genoma del virus del herpes, incluidos VirAmp y VirGA.

  • Conferenciante Spear Colloquium, en honor a la miembro de la Academia Nacional de Ciencias, Dra. Patricia Spear, Northwestern University, Chicago, IL (2018)
  • Priscilla Schaffer Memorial Award & amp Lectureship, premio anual a un joven investigador en el área de investigación del virus del herpes, International Herpes Virus Workshop (IHW, 2017)
  • Premio a la enseñanza en memoria de Daniel R. Tershak, por excelencia en la enseñanza, la Universidad Estatal de Pensilvania (2017)
  • Premio al desarrollo académico de investigación de los Institutos Nacionales de Salud, Premio de transición de carrera (K22 2013)

Resumen de la investigación

Diversos virus infectan el sistema nervioso humano, a menudo con graves consecuencias. Si bien las vacunas han derrotado en gran medida la parálisis causada por la poliomielitis, otros virus como la rabia, el virus del Nilo Occidental y el virus del herpes simple (VHS) continúan causando infecciones neurológicas que requieren intervención clínica. Más del 70% de los adultos en los Estados Unidos son portadores del VHS, lo sepan o no. El VHS causa lesiones genitales y orales recurrentes (por ejemplo, herpes labial) y, en casos raros, puede progresar hasta causar infecciones cerebrales potencialmente mortales. Aunque no todos los infectados experimentan síntomas notables, los huéspedes humanos tienen una relación permanente con este virus. El VHS tiene una capacidad única para establecer una latencia de por vida en las neuronas. Las consecuencias de la latencia del VHS para las neuronas que albergan este patógeno no se comprenden bien. Nuestro laboratorio tiene como objetivo abordar esta pregunta y buscar terapias mejoradas utilizando una combinación de virología, neurobiología, tecnologías de secuenciación de próxima generación y bioinformática.

Variación viral y neurovirulencia

El laboratorio de Szpara estudia la variación genética y la adaptabilidad en el VHS, una de las principales causas de enfermedades humanas. Utilizamos la secuenciación de alto rendimiento para revelar la variación viral en todo el genoma y para evaluar la diversidad de la población viral dentro de cualquier stock viral o muestra clínica. Hemos desarrollado varias líneas de bioinformática para acelerar el ensamblaje de genomas virales y la comparación de secuencias entre grupos de aislamientos virales. Para comprender los vínculos entre la variación genética viral y los fenotipos asociados con estas diferencias, utilizamos una variedad de in vitro modelos de cultivo celular (por ejemplo, infecciones de células epiteliales y neuronales) y en vivo modelos de ratón (por ejemplo, desarrollo de neuropatología en ratones infectados experimentalmente). Usamos estos sistemas modelo para caracterizar las diferencias fenotípicas causadas por variaciones genéticas virales. Para abordar el aspecto clínico humano de la infección viral, hemos establecido colaboraciones con médicos cuya experiencia incluye las consecuencias de la infección por HSV-1 tanto en adultos como en recién nacidos. Anticipamos que las diferencias en los genes de virulencia viral contribuyen a los diferentes síntomas y la gravedad de la enfermedad por HSV en los seres humanos. Si estos datos se pueden vincular a los impactos humanos en el futuro, la capacidad de medir el nivel de virulencia probable en función del genotipo viral proporcionaría una herramienta poderosa para el diagnóstico futuro o la predicción de resultados clínicos. Estos datos también pueden permitir el desarrollo de estrategias terapéuticas o antivirales específicas para cada cepa.

Consecuencias neuronales de la infección

Nos gustaría comprender mejor cómo afecta la latencia del VHS a la neurona huésped y sus células vecinas. En experimentos de laboratorio, la infección de neuronas por HSV se ha asociado con cambios en la liberación de neuropéptidos, tasas de activación neuronal, remodelación de axones y producción de interferón. Se ha demostrado que la infección por HSV-1 afecta a los principales marcadores moleculares de la neuropatología de la enfermedad de Alzheimer (EA): las placas extracelulares formadas por beta amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares intracelulares formados por tau fosforilada. Si bien las neuronas no están especializadas para el control o ataque inmunológico, sí contienen defensas celulares intrínsecas. ¿Cómo se activan estas defensas celulares y respuestas inmunitarias por las neuronas durante la infección por VHS? ¿Qué es el contraataque viral? ¿Se activan las defensas neuronales durante la reactivación viral o solo durante la ronda inicial de infección? Las características exclusivas de las neuronas pueden presentar nuevos objetivos para bloquear la progresión de la infección o para mitigar el daño inducido por la infección que desempeña un papel en los resultados a largo plazo, como la enfermedad de Alzheimer. Abordamos la neurobiología de la infección mediante una combinación de cultivos neuronales,en vivo modelos de infección y mediciones de alto rendimiento de la respuesta del huésped.


Cambios de latencia de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) en modelos animales de varios tipos de pérdidas auditivas conductivas y neurosensoriales

Los estudios clínicos de ABR en pacientes con pérdida auditiva periférica han dado lugar a resultados contradictorios, algunos informaron aumentos en el tiempo de transmisión del tronco encefálico (BTT), algunos disminuyeron y otros no cambiaron. Para estudiar esto de una manera cuidadosamente controlada, se indujeron varios tipos de pérdidas auditivas periféricas en animales de experimentación: pérdida auditiva conductiva al ocluir el meato auditivo (ratas) (CHL), pérdida auditiva neurosensorial temporal inducida por ruido (ratas) (NI -SNHL), atenuación de la intensidad del estímulo (ratas), (Atten.) E hipoxemia controlada inducida por hipoacusia neurosensorial temporal (gatos) (HI-SNHL). Las latencias y los umbrales de ABR se determinaron en cada animal antes (control) y durante los estados de pérdida auditiva inducida (experimental). Los datos de cada grupo en cada estado se analizaron mediante el cálculo de los valores promedio del grupo para la latencia de las ondas 1 y 4, su latencia entre picos (BTT), pruebas t pareadas para los cambios entre los estados de control y experimental y análisis de regresión lineal de los cambios de latencia en cambio de umbral. En cada grupo, hubo pequeñas disminuciones en BTT en el estado experimental (no significativo en el grupo CHL solamente). Esto fue causado por la prolongación de la latencia de la onda 1 en mayor medida que la de la onda 4. Estos cambios fueron menores que la desviación estándar del BTT en el estado de control. Por lo tanto, al intentar aplicar estos resultados a la situación clínica humana, estas pequeñas disminuciones en BTT no se considerarían anormales. Se consideran los posibles mecanismos de estos cambios de BTT.


Introducción

La toma de decisiones sensorial eficiente en un entorno en constante cambio requiere que los circuitos neuronales sean plásticos y modifiquen rápidamente su actividad. El procesamiento cortical y subcortical está influenciado sustancialmente por la retroalimentación y las aferencias neuromoduladoras que provocan la modulación inducida por la experiencia de la excitabilidad neuronal que dura desde milisegundos hasta horas (Hasselmo y Giocomo, 2006 Citri y Malenka, 2008 Picciotto et al., 2012 Sara y Bouret, 2012 Avery y Krichmar , 2017). Se ha sugerido que se requiere la neuromodulación simultánea de los circuitos neuronales que procesan la información sensorial, cognitiva y motora para mantener la dinámica neuronal para una toma de decisiones adecuada (Grossberg et al., 2015). Por lo tanto, la región o regiones del cerebro que actúan como moduladores deberían inervar la mayoría, si no todas, las regiones de procesamiento sensorial. Además, la región del cerebro debe exhibir la capacidad de modular la excitabilidad neuronal de forma dinámica, lo que permite cambios rápidos dependientes del contexto en el procesamiento de la información para obtener resultados conductuales adecuados. El prosencéfalo basal (BF) surge como un buen candidato para participar como fuente integradora y neuromoduladora de la conducta, ya que es uno de los circuitos neuromoduladores más importantes y de mayor proyección en el cerebro de los mamíferos (Gritti et al., 2006) alcanzando toda la corteza cortical. manto, hipocampo y el sistema olfativo, entre otros (Luskin y Price, 1982 Zaborszky et al., 1986 Zaborszky, 2012). Funcionalmente, se ha relacionado con la atención (Klinkenberg et al., 2011), la excitación (Buzsaki et al., 1988) y el aprendizaje y la memoria (Everitt y Robbins, 1997 Klinkenberg et al., 2011). Específicamente, se ha propuesto que sus subnúcleos desempeñan papeles importantes en componentes de conductas dirigidas a objetivos como la relevancia motivacional (Lin y Nicolelis, 2008), la discriminación sensorial (Lin y Nicolelis, 2008 Devore y Linster, 2012 Nunez-Parra et al., 2013 Pinto et al., 2013 Devore et al., 2016) y control cortical (Picciotto et al., 2012).

La amplia gama de funciones neurofisiológicas y cognitivas en las que participa el BF se correlaciona con la complejidad neuronal que se encuentra en la región. Entre la variedad de tipos neuronales que se encuentran en el BF (Zaborszky y Duque, 2000), las neuronas colinérgicas de proyección corticopetal se han estudiado ampliamente debido al importante y denso papel de coordinación superior e inferior que desempeña la acetilcolina en funciones cognitivas como la atención. Esta idea surgió a partir de estudios en los que el bloqueo farmacológico o las lesiones selectivas de las neuronas colinérgicas (NC) en la LM produjeron alteraciones en la atención, la memoria y el acondicionamiento operante (Turchi y Sarter, 1997 Curzon et al., 1999 McGaughy et al., 2000 Klinkenberg et al. al., 2011 Devore y Linster, 2012 Picciotto et al., 2012 Luchicchi et al., 2014 Dannenberg et al., 2015 Rangel et al., 2016). Además, en las tareas que exigen atención, la liberación colinérgica mejora la detección de señales y la discriminación sensorial (Sarter et al., 2005).

Aquí, nos preguntamos si las neuronas BF están involucradas en el proceso de toma de decisiones en una tarea autoiniciada sin claves olfativas. Abordamos esta pregunta registrando la actividad neuronal del BF mientras los animales se dedicaban libremente a una tarea go / no & # x2013go con inicio de prueba voluntario. Además, utilizando el etiquetado optogenético, identificamos CN entre las unidades registradas fuera de línea.


Agradecimientos

Agradecemos a M. Seagar, O. El Far, J.M. Goaillard, Y. Frégnac y G. Alcaraz por estimular las discusiones y a F. Dubruc por su ayuda con las grabaciones de video. Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, el Centre National de la Recherche Scientifique, la Agence Nationale de la Recherche (Neuroscience, Neurologie and Psychiatrie, 06-Neuro-014-01 to DD), el Fondation pour la Recherche Médicale (a EC), Fondation Française pour la Recherche sur l'Epilepsie (a OC), Ministerio de Investigación (beca de doctorado a SB & amp EC y ACI Jeunes Chercheurs a DD), AFM (a RC) y la Comunidad Europea (LSHM-CT-2004-511995, proteínas de andamiaje sináptico que orquestan la organización de la sinapsis cortical durante el desarrollo a DD).


Conclusiones

Hemos examinado las relaciones entre la preparación de la repetición conductual, la supresión de la repetición neuronal y la conectividad cerebral en relación con los modelos de Sincronía, Codificación Predictiva, Afilado y Facilitación. Se descubrió que la supresión de la repetición y la conectividad son en gran medida independientes entre sí en sus contribuciones a la preparación de la repetición. Si bien los cambios de conectividad son más compatibles con el modelo Synchrony, todos los modelos actuales no logran explicar las correlaciones entre el cebado y la supresión de repetición que no están mediadas por la conectividad.


La estrategia cerebral inesperada vincula dos eventos separados por el tiempo

Alejandra Manjarrez
13 de mayo de 2020

El cerebro es un maestro en la formación de patrones, incluso cuando se trata de eventos que ocurren en diferentes momentos. Tomemos el fenómeno del condicionamiento del miedo a las huellas: los científicos pueden hacer que un animal note la relación entre un estímulo neutral y un estímulo aversivo separados por un abismo temporal (la huella) de unos pocos o incluso decenas de segundos. Si bien es un protocolo bien establecido en los laboratorios de neurociencia y psicología, el mecanismo de cómo el cerebro cierra la brecha de tiempo entre dos estímulos relacionados para asociarlos es "una de las preguntas más enigmáticas y altamente investigadas", dice Attila, neurocientífico de la Universidad de Columbia. Losonczy.

Si se termina el primer estímulo, la información sobre su presencia e identidad "debería mantenerse de alguna manera a través de algún mecanismo neuronal", explica, para que pueda asociarse con el segundo estímulo que viene después.

Losonczy y sus colegas han investigado recientemente cómo podría ocurrir esto en un estudio publicado el 8 de mayo en Neurona. Midieron la actividad neuronal en la región CA1 del hipocampo del cerebro, que se sabe que es crucial para la formación de recuerdos, de ratones expuestos a trazas de condicionamiento del miedo. El equipo descubrió que asociar los dos eventos separados por tiempo implicaba la activación de un subconjunto de neuronas que se disparaban escasamente cada vez que los ratones recibían el primer estímulo y durante el intervalo de tiempo que siguió. El patrón surgió solo después de que los ratones aprendieron a asociar ambos estímulos.

El estudio destaca "la cuestión importante de cómo vinculamos los recuerdos a lo largo del tiempo", dice Denise Cai, neurocientífica de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai que no participó en el trabajo. Estudiar los mecanismos básicos de la asociación temporal es fundamental para comprender cómo va mal en trastornos como el trastorno de estrés postraumático (TEPT) o la enfermedad de Alzheimer, dice.

Consulte "Cómo la manipulación de los recuerdos de los roedores puede dilucidar la función neurológica"

Una de las hipótesis predominantes para explicar cómo el cerebro conecta dos eventos separados en el tiempo ha sido la existencia de neuronas específicas que se activan durante el tono y continúan disparando después de que cesa durante el período de seguimiento. Esta estrategia se ha observado durante la memoria de trabajo, por ejemplo, en tareas en las que necesita memorizar temporalmente una imagen o recordar un número de teléfono.

Otra hipótesis influyente ha sido que, durante el período de traza que separa los dos estímulos, las poblaciones neuronales se disparan de manera secuencial, y a través de esta cadena, la información se lleva desde el momento en que se escucha el tono hasta que ocurre la experiencia aversiva. Las neuronas involucradas en este fenómeno secuencial, que comúnmente se observa en huecos que duran unos segundos, también se conocen como células del tiempo.

Consulte "Cómo se codifica el tiempo en los recuerdos"

Losonczy y sus colegas probaron ambas hipótesis al estudiar la actividad neural del hipocampo de seis ratones durante la formación de la asociación temporal entre un tono de 20 segundos de duración y una molesta bocanada de aire dirigida a sus hocicos 15 segundos después. A los ratones se les privó de agua, se les fijó la cabeza y se les inmovilizó junto a un puerto de agua, desde donde fueron entrenados para lamer para obtener pequeñas recompensas. Solo dejarían de lamer cuando escucharan el tono, una vez que supieran que la bocanada de aire llegaría pronto, probablemente debido a una respuesta general de congelación al miedo. Los ratones también fueron expuestos a un segundo tipo de tono no seguido por la bocanada de aire. El equipo utilizó microscopía de dos fotones e imágenes de calcio, un indicador de la actividad neuronal, para identificar y visualizar entre 158 y 500 neuronas por ratón y registrar los cambios en su comportamiento a lo largo del tiempo.

La información de esta actividad neuronal se alimentaba luego a un decodificador para que pudiera aprender a asociar patrones de actividad neuronal al estado de una variable, por ejemplo, la identidad del tono, si correspondía al seguido por el estímulo aversivo, o al otro tono. Después de ser entrenado, se le pidió al algoritmo que hiciera predicciones, como la identidad del tono a partir de los datos de las pruebas experimentales que no se usaron para entrenar al decodificador.

El análisis de decodificación no mostró ninguna evidencia de neuronas específicas disparando continuamente o secuencias de células de tiempo durante el rastreo. “Definitivamente fue sorprendente”, dice Losonczy, que ninguna de las hipótesis fue apoyada por sus datos.

Takashi Kitamura, un neurobiólogo del Centro Médico de la Universidad de Texas Southwestern que no participó en el estudio, dice que especula que es posible que no se hayan encontrado células en el momento en que solo sean relevantes cuando el cerebro necesita recordar el tiempo. Da como ejemplo la tarea de puentear el tiempo del condicionamiento del parpadeo de seguimiento, en la que los ratones aprenden a asociar un estímulo condicionado con una bocanada de aire aversiva dirigida al ojo, por lo que deben parpadear en un momento específico para evitarlo. Aquí, es importante recordar el tiempo transcurrido entre ambos eventos. “Pero si solo vinculo dos eventos con una brecha temporal, probablemente no sea necesario tener celdas de tiempo”, dice.

Entonces, el equipo probó una tercera hipótesis. Le pidieron al decodificador que prediga la identidad del tono en función de la tasa de actividad promedio durante los 35 segundos que abarcan el tono más el período de seguimiento. El decodificador finalmente tuvo éxito en la predicción, y el equipo descubrió que esto se basaba en parte en la información de un subconjunto particular de neuronas que se disparaban escasa y estocásticamente cada vez que se escuchaba el tono. Losonczy dice que esta podría ser una forma de optimizar la eficacia y el consumo de energía, en contraste con la actividad neuronal continua o secuencial, que puede ser bastante costosa, particularmente para períodos prolongados.

Kitamura dice que le gusta esta hipótesis alternativa, donde un subconjunto de neuronas sintoniza sus tasas de activación dependiendo de la identidad del tono. Esto podría estar relacionado con lo que se conoce como la hipótesis del engrama, en la que un grupo de neuronas almacena información de la memoria. Nadie había "aplicado esta hipótesis de engrama a la memoria de asociación temporal", dice Kitamura. Sin embargo, agrega, esta idea debe examinarse más a fondo, por ejemplo, inhibiendo esta población neuronal y probando si esto da como resultado un déficit durante la memoria de asociación temporal.

Ver "Cómo los ratones olvidan tener miedo"

Incluso si la actividad de esta población de neuronas está uniendo dos estímulos a lo largo del tiempo, el mecanismo preciso para la formación de la memoria aún no está claro. "Creemos que la plasticidad sináptica está involucrada", dice el coautor Stefano Fusi de la Universidad de Columbia. "Si es sináptico, sería genial probarlo directamente, pero es extremadamente difícil estudiar las sinapsis in vivo, especialmente las sinapsis individuales".


Resultados

En este estudio, 123 neuronas (N = 123) se registraron intracelularmente a partir de la IC de H. pratti en condiciones de estímulo de tono puro antes y durante la CAES. Los rangos de profundidad de grabación, BF, MT y latencia media de estas neuronas IC fueron 2047,88 ± 710,66 μm, 45,04 ± 10,69 kHz, 54,09 ± 16,81 dB SPL y 13,46 ± 5,44 ms, respectivamente. Según el efecto de ACES sobre la latencia de las neuronas IC, las neuronas IC (n = 123) obtenidas en el presente estudio podrían clasificarse en tres tipos: facilitación (acortamiento de la latencia) (n = 20), inhibición (prolongación de la latencia) (n = 23) y no afectado (n = 80). Además, existen tres métodos (es decir, cambiar el pre-pico DD, pre-pico HD y SOT) en las modulaciones de latencia facilitadoras e inhibitorias activadas por ACES.

Cambio de latencia de las neuronas del CI inducido por la modulación facilitadora activada por la estimulación eléctrica focal de la CA

Tres métodos (es decir, cambio de pre-pico DD, pre-pico HD y SOT) en la modulación facilitadora fueron activados por ACES para la latencia de las neuronas IC. El primer método de modulación facilitadora fue acortar la latencia de las neuronas de CI al acortar el DD previo al pico durante la CAES. Las latencias de las neuronas IC (n = 9/120) se acortaron con un acortamiento de DD previo al pico durante la ACES. Una neurona IC facilitada representativa por ACES se muestra en la Fig. 2. Las trazas de respuesta original obtenidas por 12 estimulaciones repetitivas de tono puro con DD previos al pico fueron más cortas durante ACES (Fig 2Ab) que antes ACES (Figura 2Aa). Además, los gráficos de dispersión de latencia en la Fig.2A muestran que esta neurona IC tenía una latencia más corta durante ACES que antes ACES (Figura 2B). Calculamos los DD previos al pico y tres latencias representativas (mínima, media y máxima) seleccionadas de la Figura 2A antes (Figura 2Ca-1–2Ca-3) y durante (Figura 2Cb-1–2Cb-3) ACES, y cada latencia durante ACES era más corta que la latencia antes de ACES. El análisis estadístico mostró que las neuronas IC tenían una DD y una latencia previas al pico significativamente más cortas durante la AC.ES que antes ACES (Fig. 2D y 2E) (pre-pico DD: 3,58 ± 1,39 ms (antes de ACES) frente a 2,71 ± 1,08 ms (durante ACES), pag & lt 0,001, n = 9, emparejado t-prueba de latencia: 15,66 ± 4,25 ms (antes de CAES) frente a 14,63 ± 4,10 ms (duranteES), pag & lt 0,001, n = 9, emparejado t-prueba).

(A) Rastros de respuesta original obtenidos por 12 condiciones repetitivas de estimulación de tono puro antes (Aa) y durante (Ab) ACES. (B) Distribución de los valores de latencia calculados según Aa y Ab antes (círculo sin relleno) y durante (triángulo sin relleno) ACES. (C) Tres latencias representativas (es decir, mínima (a-1, b-1), media (a-2, b-2) y máxima (c-1, c-2)) (L) seleccionadas de Aa y Ab antes (Ca-1 – a-3) y durante (Cb-1 – b-3) ACES. (D) Comparación de la media de los DD previos al pico para este tipo de neuronas de CI antes y durante la CAES, mostrando una diferencia estadísticamente significativa (***, pag & lt 0,001) entre dos valores medios. El círculo sin relleno y el triángulo sin relleno muestran la distribución de los valores de DD previos al pico para este tipo de neuronas de CI antes y durante la CAES, respectivamente. El círculo relleno y el triángulo relleno muestran el valor de DD previo al pico para la neurona IC facilitada representativa antes y durante la CAES, respectivamente. (E) Comparación de latencias medias para este tipo de neuronas IC antes y durante la ACES, mostrando una diferencia estadísticamente significativa (***, pag & lt 0,001) entre dos valores medios. El círculo sin relleno y el triángulo sin relleno muestran la distribución de los valores medios de latencia para este tipo de neuronas IC antes y durante la CAES, respectivamente. El círculo relleno y el triángulo relleno muestran los valores de latencia de las neuronas IC facilitadas representativas antes y durante la CAES, respectivamente. La línea discontinua horizontal en cada línea de base en A y C muestra el RP. La línea punteada en los diagramas de caja de D y E muestra los valores medios de DD y latencia antes del pico, respectivamente. El número junto a los potenciales de acción (AP) que se disparan en Aa y Ab representa el número total de AP provocados por 12 intentos repetitivos. Las líneas continuas en los picos izquierdos anteriores muestran el DD previo al pico y la latencia en C. La barra negra sólida debajo del lado izquierdo de los paneles A y C representa el estímulo de tono puro. Los ángulos rectos sobre las esquinas derechas de Ab y Cb-3 muestran las escalas de tiempo y amplitud. La barra vertical en la parte superior de cada columna en D y E muestra la SD. La profundidad de grabación, BF, MT y latencia media de la neurona IC representativa (A – C) son 2501 μm, 45 kHz, 38 dB SPL y 12,68 ms, respectivamente.

El segundo método de modulación facilitadora implicó el acortamiento de la latencia de las neuronas del CI mediante el acortamiento de la HD previa al pico durante la CAES. En este método, las latencias de seis neuronas IC facilitadas (n = 6/120) se acortaron con un acortamiento de HD previo al pico inducido por ACES. En la figura 3 se muestra una neurona IC representativa. Además, las trazas de respuesta original obtenidas mediante 12 estimulaciones repetitivas de tono puro con HD previas al pico fueron más cortas durante la ACES (Fig 3Ab) que antes ACES (Figura 3Aa). Además, los gráficos de dispersión de latencia en la Fig 3A muestran que esta neurona IC tenía una latencia más corta durante ACES que antes ACES (Figura 3B). Además, calculamos las HD previas al pico y tres latencias representativas (mínima, media y máxima) seleccionadas de la figura 3A antes (figura 3Ca-1–3Ca-3) y durante (figura 3Cb-1–3Cb-3) ACES cada valor fue más corto durante ACES que antes ACES. El análisis estadístico mostró que las neuronas IC tenían una HD y una latencia previas al pico significativamente más cortas durante la AC.ES que antes ACES (Fig 3D y 3E) (pre-pico HD: 4,63 ± 1,81 ms (antes de ACES) frente a 2,69 ± 1,83 ms (duranteES), pag & lt 0.05, n = 6, emparejado t-prueba de latencia: 14,86 ± 3,21 ms (antes de ACES) frente a 13,78 ± 3,40 ms (duranteES), pag & lt 0.05, n = 6, emparejado t-prueba).

Rastros de respuesta original obtenidos por 12 condiciones repetitivas de estimulación de tono puro antes (Aa) y durante (Ab) ACES. (B) Distribución de los valores de latencia calculados según Aa y Ab antes (círculo sin relleno) y durante (triángulo sin relleno) ACES. (C) Tres latencias representativas (es decir, mínima (a-1, b-1), media (a-2, b-2) y máxima (c-1, c-2)) seleccionadas de Aa y Ab antes de ( Ca-1 – a-3) y durante (Cb-1 – b-3) ACES. (D) Comparación de la media de HD antes del pico para este tipo de neuronas de CI antes y durante la CAES, mostrando una diferencia estadísticamente significativa (*, pag & lt 0.05) entre dos valores medios. El círculo sin relleno y el triángulo sin relleno muestran la distribución de los valores de HD antes del pico para este tipo de neuronas de CI antes y durante la CAES, respectivamente. El círculo relleno y el triángulo relleno muestran el valor de HD previo al pico para la neurona IC facilitada representativa antes y durante la CAES, respectivamente. (E) Comparación de latencias medias para este tipo de neuronas IC antes y durante la CAES, mostrando una diferencia estadísticamente significativa (*, pag & lt 0.05) entre dos valores medios. El círculo sin relleno y el triángulo sin relleno muestran la distribución de los valores de latencia para este tipo de neuronas IC antes y durante la CAES, respectivamente. El círculo relleno y el triángulo relleno muestran el valor de latencia de la neurona IC facilitada representativa antes y durante la CAES, respectivamente. La línea discontinua horizontal en cada línea de base en A y C muestra el RP. La línea punteada en los diagramas de caja de D y E muestra los valores medios de HD y latencia previos al pico, respectivamente. El número junto a los AP que se disparan en Aa y Ab representa el número total de AP provocados por 12 intentos repetitivos. Las líneas continuas en los picos izquierdos anteriores muestran el HD previo al pico y la latencia en C. La barra negra sólida debajo del lado izquierdo de los paneles A y C representa el estímulo de tono puro. Los ángulos rectos sobre las esquinas derechas de Ab y Cb-3 muestran las escalas de tiempo y amplitud. La barra vertical en la parte superior de cada columna en D y E muestra la SD. La profundidad de grabación, BF, MT y latencia media de la neurona IC representativa (A – C) son 2689 μm, 53 kHz, 58,8 dB SPL y 11,19 ms, respectivamente.

El tercer método de modulación facilitadora involucró el acortamiento de la latencia de las neuronas IC a través del desplazamiento hacia adelante de su SOT durante ACES. En este método, las latencias de cinco neuronas facilitadas (n = 5/120) se acortaron con el desplazamiento hacia adelante de sus SOT. En la Fig. 4 se muestra una neurona IC representativa. Las trazas de respuesta original obtenidas de 12 condiciones repetitivas de estimulación de tono puro de la neurona IC antes (Fig 4Aa) y durante ACES (Fig. 4Ab) no exhibió prácticamente ninguna despolarización previa al pico ni hiperpolarización previa al pico. Los SOT y latencias obtenidos (Fig.4A y 4B) se desplazaron hacia adelante durante ACES. Además, los gráficos de dispersión de latencia de la Fig 4A muestran que la neurona IC tenía una latencia más corta durante ACES que antes ACES (Figura 4B). Calculamos los SOT y tres latencias representativas (mínima, media y máxima) seleccionadas de la Fig 4A antes y durante la CAES se muestran en la Fig. 4C. Además, se observaron SOT más tempranos y latencias más cortas de las neuronas IC durante ACES (Fig 4Cb-1–4Cb-3) que antes de ACES (Figura 4Ca-1–4Ca-3). Cálculo de los SOT y latencias de estas neuronas IC antes y durante la CAES mostró que estas neuronas IC tenían SOT significativamente más temprano y latencias más cortas durante ACES que antes ACES (Fig.4D y 4E) (SOT: 10,64 ± 1,87 ms (antes de ACES) frente a 10,08 ± 1,98 ms (durante ACES), pag & lt 0.05, n = 5, emparejado t-prueba de latencia: 11,00 ± 1,87 ms (antes de ACES) frente a 10,39 ± 1,87 ms (duranteES), pag & lt 0.05, n = 5, emparejado t-prueba).

Rastros de respuesta original obtenidos por 12 condiciones repetitivas de estimulación de tono puro antes (Aa) y durante (Ab) ACES. (B) Distribución de los valores de latencia calculados según Aa y Ab antes (círculo sin relleno) y durante (triángulo sin relleno) ACES. (C) Tres latencias representativas (es decir, mínima (a-1, b-1), media (a-2, b-2) y máxima (c-1, c-2)) seleccionadas de Aa y Ab antes de ( Ca-1 – a-3) y durante (Cb-1 – b-3) ACES. (D) Comparación de los SOT medios para este tipo de neuronas IC antes y durante la ACES, showing a statistically significant difference (*, pag < 0.05) between two mean values. The unfilled circle and unfilled triangle show the distribution of SOT values for this type of IC neurons before and during ACES, respectivamente. The filled circle and filled triangle show the SOT value of the representative facilitated IC neuron before and during ACES, respectivamente. (E) Comparison of mean latencies for this type of IC neurons before and during ACES, showing a statistically significant difference (*, pag < 0.05) between two mean values. The unfilled circle and unfilled triangle show the distribution of latency values for this type of IC neurons before and during ACES, respectivamente. The filled circle and filled triangle show the latency value for the representative facilitated IC neuron before and during ACES, respectivamente. Horizontal dashed line on each baseline in A and C shows the RP. The dashed line in the box plots of D and E shows the mean values of SOT and latency, respectively. The number beside the APs firing in Aa and Ab represents the total number of APs elicited per 12 repetitive trials. Solid lines on the above left spikes show the latency in C. Solid black bar under the left side of panels A and C represents the pure tone stimulus. Right angles above the right corners of Aa and Cb-3 show the time and amplitude scales. Vertical bar on top of each column in D and E shows the SD. The recording depth, BF, MT, and mean latency of the representative IC neuron (A–C) are 1493 μm, 35 kHz, 34.8 dB SPL, and 13.28 ms, respectively.

Latency change of IC neurons induced by inhibitory modulation activated by focal electric stimulation of the AC

Three methods (i.e., changing pre-spike DD, pre-spike HD, and SOT) for the inhibitory latency modulation were activated by ACES. The first inhibitory modulation method was prolonging the pre-spike DD of IC neurons in response to pure tone stimulation for prolonging the latency during ACES. Nine (n = 9/120) IC neurons were inhibited by ACES through this method. A representative inhibited IC neuron is shown in Fig 5. The original response traces obtained by 12 repetitive pure tone stimulations with pre-spike DDs were obviously longer during ACES (Fig 5Ab) than before ACES (Fig 5Aa). The scatter plots of latency obtained from Fig 5A show that the IC neurons had longer latencies during ACES than before ACES (Fig 5B). Furthermore, we calculated the pre-spike DDs and three representative (minimum, middle, and maximum) latencies selected from Fig 5A before (Fig 5Ca-1–5Ca-3) and during (Fig 5Cb-1–5Cb-3) ACES, and each value during ACES was longer than before ACES. Statistical analysis showed that the IC neurons had significantly longer pre-spike DD and latency during ACES than before ACES (Fig 5D and 5E) (pre-spike DD: 2.18 ± 1.18 ms (before ACES) vs. 2.72 ± 1.19 ms (during ACES), pag < 0.01, n = 9, paired t-test latency: 10.67 ± 2.52 ms (before ACES) vs. 11.24 ± 2.52 ms (during ACES), pag < 0.001, n = 9, paired t-prueba).

(A) Original response traces obtained by 12 repetitive pure tone stimulation conditions before (Aa) and during (Ab) ACES. (B) Distribution of latency values calculated according to Aa and Ab before (unfilled circle) and during (unfilled triangle) ACES. (C) Three representative (i.e., minimum (a-1, b-1), middle (a-2, b-2), and maximum (c-1, c-2)) latencies selected from Aa and Ab before (Ca-1–a-3) and during (Cb-1–b-3) ACES. (D) Comparison of mean pre-spike DDs for this type of IC neurons before and during ACES, showing a statistically significant difference (**, pag < 0.01) between two mean values. The unfilled circle and unfilled triangle show the distribution of pre-spike DD values for this type of IC neurons before and during ACES, respectivamente. The filled circle and filled triangle show the pre-spike DD value for the representative facilitated IC neuron before and during ACES, respectivamente. (E) Comparison of mean latencies for this type of IC neurons before and during ACES, showing a statistically significant difference (***, pag < 0.001) between two mean values. The unfilled circle and unfilled triangle show the distribution of latency values for this type of IC neurons before and during ACES, respectivamente. The filled circle and filled triangle show the latency value of the representative facilitated IC neuron before and during ACES, respectivamente. Horizontal dashed line on each baseline in A and C shows the RP. The dashed line in the box plots of D and E shows the mean values of pre-spike DD and latency, respectively. The number beside the APs firing in Aa and Ab represents the total number of APs elicited per 12 repetitive trials. Solid lines on the above left spikes show the pre-spike DD and latency in C. Solid black bar under the left side of panels A and C represents the pure tone stimulus. Right angles above the right corners of Ab and C b-3 show the time and amplitude scales. Vertical bar on top of each column in D and E shows the SD. The recording depth, BF, MT, and mean latency of the representative IC neuron (A–C) are 2574 μm, 59 kHz, 28 dB SPL, and 8.42 ms, respectively.

The second inhibitory modulation method of latency was prolonging the pre-spike HD of IC neurons in response to pure tone stimulation for increasing the latency during ACES. In this method, the latencies of eight inhibited IC neurons (n = 8/120) by ACES were extended after their pre-spike HDs were prolonged. A representative inhibited IC neuron through this method is displayed in Fig 6. The original response traces obtained under 12 repetitive pure tone stimulations before and during ACES showed that pre-spike HDs were longer during ACES (Fig 6A) than before ACES. Meanwhile, the scatter plots of latency from Fig 6A show that the IC neurons had longer latencies during ACES than before ACES (Fig 6B). Moreover, we calculated the pre-spike HDs and three representative (minimum, middle, and maximum) latencies selected from Fig 6A showed the longer pre-spike HDs during ACES (Fig 5Cb-1–5Cb-3) than before ACES (Fig 6Ca-1–6Ca-3). We calculated the pre-spike HDs and latencies of these IC neurons obtained before and during ACES. Statistical analysis showed that the IC neurons had significantly longer pre-spike HD and latency during ACES than before ACES (Fig 6D and 6E) (pre-spike HD: 2.21 ± 1.29 ms (before ACES) vs. 3.30 ± 1.29 ms (during ACES), pag < 0.05, n = 8, paired t-test L: 14.60 ± 4.38 ms (before ACES) vs. 15.27 ± 4.44 ms (during ACES), pag < 0.05, n = 8, paired t-prueba).

Original response traces obtained by 12 repetitive pure tone stimulation conditions before (Aa) and during (Ab) ACES. (B) Distribution of latency values calculated according to Aa and Ab before (unfilled circle) and during (unfilled triangle) ACES. (C) Three representative (i.e., minimum (a-1, b-1), middle (a-2, b-2), and maximum (c-1, c-2)) latencies selected from Aa and Ab before (Ca-1–a-3) and during (Cb-1–b-3) ACES. (D) Comparison of mean pre-spike HDs for this type of IC neurons before and during ACES, showing a statistically significant difference (*, pag < 0.05) between two mean values. The unfilled circle and unfilled triangle show the distribution of latency values for this type of IC neurons before and during ACES, respectivamente. The filled circle and filled triangle show the latency value of the representative facilitated IC neuron before and during ACES, respectivamente. (E) Comparison of mean latencies for this type of IC neurons before and during ACES, showing a statistically significant difference (*, pag < 0.05) between two mean values. The unfilled circle and unfilled triangle show the distribution of latency values for this type of IC neurons before and during ACES, respectivamente. The filled circle and filled triangle show the latency value of the representative facilitated IC neuron before and during ACES, respectivamente. Horizontal dashed line on each baseline in A and C shows the RP. The dashed line in the box plots of D and E shows the mean values of pre-spike HD and latency, respectively. The number beside the APs firing in Aa and Ab represents the total number of APs elicited per 12 repetitive trials. Solid lines on the above left spikes show the pre-spike HD and latency in C. Solid black bar under the left side of panels A and C represents the pure tone stimulus. Right angles above the right corners of Ab and C a-1 show the time and amplitude scales. Vertical bar on top of each column in D and E shows the SD. The recording depth, BF, MT, and mean latency of the representative IC neuron (A–C) are 2086 μm, 49.1 kHz, 24.8 dB SPL, and 17.04 ms, respectively.

The third inhibitory modulation method for prolonging the latency of IC neurons was to induce a backward shift of SOTs during ACES. The latencies of six IC neurons (n = 6/120) were extended through a backward shift of their SOTs during ACES. A representative IC neuron is displayed in Fig 7. The original response traces obtained from the IC neuron by 12 repetitive pure tone stimulations before (Fig 7Aa) and during ACES (Fig 7Ab) exhibited practically no pre-spike depolarization and pre-spike hyperpolarization. Comparison analysis showed that the SOTs and latencies (Fig 6A and 6B) of this IC neuron were backward shifted during ACES. Meanwhile, the scatter plots of latency from Fig 7A show that the IC neuron had longer latencies during ACES than before ACES (Fig 7B). We calculated the SOTs and three representative (minimum, middle, and maximum) latencies selected from Fig 7A before and during ACES, as shown in Fig 7C. The later SOTs and longer latencies of the IC neuron during ACES (Fig 7Cb-1–7Cb-3) than before ACES (Fig 7Ca-1–7Ca-3) were evident. We calculated the SOTs and latencies of IC neurons before and during ACES. The IC neurons had significantly later SOT and longer latency during ACES than before ACES (Fig 7D and 7E) (SOT: 12.87 ± 1.96 ms (before ACES) vs. 13.70 ± 1.68 ms (during ACES), pag < 0.05, n = 6, paired t-test latency: 13.23 ± 2.03 ms (before ACES) vs. 14.06 ± 1.74 ms (during ACES), pag < 0.05, n = 6, paired t-prueba).

(A) Original response traces obtained by 12 repetitive pure tone stimulation conditions before (Aa) and during (Ab) ACES. (B) Distribution of latency values calculated according to Aa and Ab before (unfilled circle) and during (unfilled triangle) ACES. (C) Three representative (i.e., minimum (a-1, b-1), middle (a-2, b-2), and maximum (c-1, c-2)) latencies selected from Aa and Ab before (Ca-1–a-3) and during (Cb-1–b-3) ACES. (D) Comparison of mean SOTs for this type of IC neurons before and during ACES, showing a statistically significant difference (*, pag < 0.05) between two mean values. The unfilled circle and unfilled triangle show the distribution of SOT values for this type of IC neurons before and during ACES, respectivamente. The filled circle and filled triangle show the SOT value of the representative facilitated IC neuron before and during ACES, respectivamente. (E) Comparison of mean latencies for this type of IC neurons before and during ACES, showing a statistically significant difference (*, pag < 0.05) between two mean values. The unfilled circle and unfilled triangle show the distribution of latency values for this type of IC neurons before and during ACES, respectivamente. The filled circle and filled triangle show the latency value of the representative facilitated IC neuron before and during ACES, respectivamente. Horizontal dashed line on each baseline in A and C shows the RP. The dashed line in the box plots of D and E shows the mean value of SOT and latency, respectively. The number beside the APs firing in Aa and Ab represents the total number of APs elicited per 12 repetitive trials. Solid lines on the above left spikes show the latency in C. Solid black bar under the left side of panels A and C represents the pure tone stimulus. Right angles above the right corners of Ab and Cb-3 show the time and amplitude scales. Vertical bar on top of each column in D and E shows the SD. The recording depth, BF, MT, and mean latency of the representative IC neuron (A–C) are 3491 μm, 52.6 kHz, 28.5 dB SPL, and 13.07 ms, respectively.

Relationship between the latency change induced by electric stimulation of the AC and pre-spike DD, pre-spike HD, and SOT of IC neurons

Scatter plots for the facilitated and inhibited latencies of IC neurons in relation to the changes in pre-spike DD, pre-spike HD, and SOT were prepared to determine if the latency change induced by ACES is correlated with the changes in pre-spike DD, pre-spike HD, and SOT (Fig 8). Linear regression analyses showed that the latency changes of IC neurons significantly correlated with the changes in their pre-spike DD (Fig 8A), pre-spike HD (Fig 8B), and SOT (Fig 8C) (Fig 8A, r = 0.9312, n = 18, pag < 0.0001 8B, r = 0.9100, n = 14, pag < 0.0001 8C, r = 0.9963, n = 11, pag & lt 0,0001).

(A) Latency decreasing and increasing with pre-spike DD shortening and lengthening induced by descending facilitation (unfilled circle) and inhibition (filled circle) activated by ACES, respectively (r = 0.9312, pag & lt 0,0001). (B) Latency decreasing and increasing with pre-spike HD shortening and lengthening induced by descending facilitation (unfilled circle) and inhibition (filled circle) activated by ACES, respectively (r = 0.9100, pag & lt 0,0001). (C) Latency decreasing with SOT forward shift induced by descending facilitation (unfilled circle) activated by ACES and vice versa (filled circle) (r = 0.9963, pag & lt 0,0001). The solid lines in A, B, and C are regression lines.

Relationship between the latency change induced by electric AC stimulation and the BF difference between the cortical and collicular neurons

The analysis of 43 IC neurons confirmed that the changes in response latencies evoked by ACES were related to the BF difference between the cortical and collicular neurons (abbreviated as BFIC-AC difference). The scatter plots show the latency change that resulted from ACES against the BFIC-AC difference of the corticofugally facilitated and inhibited IC neurons (Fig 9A). We also compared the BFIC-AC difference for the corticofugally facilitated and inhibited IC neurons. The BF difference for corticofugally facilitated IC neurons was smaller than that for corticofugally inhibited IC neurons (Fig 9B, BFIC-AC difference: 2.87 ± 1.33 kHz (corticofugally facilitated IC neurons, n = 21) vs. 5.92 ± 3.99 kHz (corticofugally inhibited IC neurons, n = 23), pag < 0.05, paired t-prueba).

(A) Scatter plots showing the change in latencies of facilitated (unfilled circle) and inhibited (filled circle) IC neurons against the BFIC-AC diferencia. (B) Comparison of BFIC-AC difference for corticofugally facilitated (unfilled column) and inhibited (filled column) IC neurons, showing a statistically significant difference (**, pag < 0.01) between two mean values.


Neural responses to overlapping FM sounds in the inferior colliculus of echolocating bats

The big brown bat, Eptesicus fuscus, navigates and hunts prey with echolocation, a modality that uses the temporal and spectral differences between vocalizations and echoes from objects to build spatial images. Closely spaced surfaces ("glints") return overlapping echoes if two echoes return within the integration time of the cochlea ( approximately 300-400 micros). The overlap results in spectral interference that provides information about target structure or texture. Previous studies have shown that two acoustic events separated in time by less than approximately 500 micros evoke only a single response from neural elements in the auditory brain stem. How does the auditory system encode multiple echoes in time when only a single response is available? We presented paired FM stimuli with delay separations from 0 to 24 micros to big brown bats and recorded local field potentials (LFPs) and single-unit responses from the inferior colliculus (IC). These stimuli have one or two interference notches positioned in their spectrum as a function of two-glint separation. For the majority of single units, response counts decreased for two-glint separations when the resulting FM signal had a spectral notch positioned at the cell's best frequency (BF). The smallest two-glint separation that reliably evoked a decrease in spike count was 6 micros. In addition, first-spike latency increased for two-glint stimuli with notches positioned nearby BF. The N(4) potential of averaged LFPs showed a decrease in amplitude for two-glint separations that had a spectral notch near the BF of the recording site. Derived LFPs were computed by subtracting a common-mode signal from each LFP evoked by the two-glint FM stimuli. The derived LFP records show clear changes in both the amplitude and latency as a function of two-glint separation. These observations in relation with the single-unit data suggest that both response amplitude and latency can carry information about two-glint separation in the auditory system of E. fuscus.


Métodos

Whole-cell recordings were performed in coronal brain slices from Sprague–Dawley rats (postnatal days 15–18) at 34°C, using the same extra- and intracellular solutions as described in ref. 11, except when CsGlu intracellular solution was used [105 mM Cs-gluconate, 30 mM CsCl, 10 mM Hepes, 10 mM phosphocreatine, 4 mM ATP-Mg, 0.3 mM GTP-Na, and 0.3 mM EGTA (adjusted to pH 7.35 with CsOH)]. All experiments were done in accordance with European Union guidelines (directive 86/609/EEC). Liquid junction potentials were estimated as 13.6 mV and 14.2 mV for KGlu and CsGlu intracellular solutions, respectively. Signals were amplified by using an EPC10–2 amplifier (HEKA Elektronik), and analyzed by using IgorPro (Wavemetrics). All results are expressed as mean ± standard error of mean, and statistical significance was assessed by using the student t test or the nonparametric Mann–Whitney test. Effects of antagonists were measured after a 5-min bath application after 5–15 min of recording in control conditions. Detailed experimental and analysis methods are available in SI Methods .


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