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2.5: Replicación del ADN - Biología

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El alcance del problema

En este módulo discutimos la replicación del ADN, uno de los requisitos clave para que un sistema vivo se regenere y cree la próxima generación. Consideremos primero brevemente el alcance del problema por medio de una analogía literaria.

El genoma humano consta de aproximadamente 6.500 millones de pares de bases de ADN si se considera el genoma diploide completo (es decir, si se cuenta el ADN heredado de ambos padres). Seis coma cinco mil millones se ve así: 6.500.000.000. Eso es un gran número. Para tener una mejor idea de lo que significa ese número, imagine que nuestro ADN es un conjunto de instrucciones escritas para construir uno de nosotros. Por analogía, podemos compararlo con otro documento escrito. Para este ejemplo, comenzamos considerando "Guerra y paz" de Tolstoi, una novela con la que mucha gente está familiarizada por su voluminosa naturaleza. Los datos de Wikipedia estiman que "Guerra y paz" contiene unas 560.000 palabras. Un segundo trabajo escrito con el que muchos están familiarizados son los siete volúmenes de J.K. "Harry Potter" de Rowling. Este trabajo se registra en ~ 1,080,000 palabras (Estadísticas de referencia en Wikipedia). Si asumimos que la longitud promedio de una palabra en inglés es de 5 letras, las dos obras literarias tienen 2,8 millones y 5,4 millones de letras, respectivamente. Por lo tanto, incluso los siete volúmenes de "Harry Potter" tienen más de 1000 veces menos letras que nuestros propios genomas. Sin embargo, el número de letras de estas 7 novelas se acerca mucho más al número de nucleótidos de un genoma bacteriano típico.

Ahora imagínese copiando estos textos. ¿Qué tan rápido podrías hacerlo? ¿Cuántos errores es probable que cometa? ¿Espera que haya una compensación entre la velocidad a la que puede copiar y la precisión? ¿Qué tipo de recursos necesita este proceso? ¿Cuánta energía se requiere? ¡Ahora imagina copiar algo 1000 veces más grande!

Teniendo esto en cuenta, vale la pena señalar que una célula humana puede tardar unas 24 horas en dividirse (por lo tanto, la replicación del ADN debe ser un poco más rápida). Una saludable E. coli La célula puede tardar solo 20 minutos en dividirse (incluida la replicación de su genoma de ~ 4,5 millones de pares de bases). Tanto el ser humano como la bacteria hacen esto mientras que, por lo general, cometen pocos errores suficientes para que la siguiente generación siga siendo viable y reconocible. ¡Eso es bastante asombroso!

Desafío de diseño

Si la célula va a replicarse, su objetivo final, debe crearse una copia del ADN. Por tanto, un problema, una afirmación o una pregunta claros es "¿cómo puede la célula copiar su ADN de forma eficaz?" Dada la analogía anterior, algunas subpreguntas relevantes de relevancia podrían ser: ¿Cuáles son las propiedades químicas y físicas que habilitar ¿El ADN que se va a copiar (no solo estamos construyendo más ADN, estamos construyendo una copia exacta de su secuencia)? ¿Con qué fidelidad se debe copiar el ADN? ¿A qué velocidad se debe copiar? ¿De dónde proviene la energía para esta tarea y cuánta es necesaria? ¿De dónde proceden las "materias primas"? ¿Cómo combinan las máquinas moleculares involucradas en este proceso el ensamblaje de materias primas y la energía requerida para construir una nueva molécula de ADN? La lista, por supuesto, podría continuar.

En lo que sigue y en la conferencia, analizaremos cómo se logra la replicación del ADN, teniendo en cuenta algunas de estas preguntas fundamentales. A medida que lea los materiales de lectura y conferencias, trate de estar constantemente al tanto de estas y otras preguntas asociadas con este proceso. Utilice estas preguntas como guías para organizar sus pensamientos e intente encontrar coincidencias entre los "hechos" que cree que se espera que sepa y las preguntas motivadoras.

La doble hélice del ADN

Para construir un contexto adicional, también necesitamos un poco de conocimiento determinado empíricamente. Quizás una de las características más conocidas y populares de la forma hereditaria de la molécula de ADN es que tiene una estructura terciaria de doble hélice. La apreciación de esto se remonta a la década de 1950. La historia de este descubrimiento se ha contado ampliamente y los detalles están más allá del alcance de este texto. Brevemente, a Francis Crick y James Watson se les atribuye la determinación de la estructura del ADN. A Rosalind Franklin ahora también se le atribuye ampliamente la generación de datos críticos de difracción de rayos X que permitieron a Watson y Crick armar el rompecabezas de la molécula de ADN.

Los modelos de la estructura del ADN revelaron que la molécula está formada por dos hebras de nucleótidos unidos covalentemente que se retuercen entre sí para formar una hélice a la derecha. En cada hebra, los nucleótidos se unen covalentemente a otros dos nucleótidos (excepto en los extremos de una hebra lineal) a través de enlaces fosfodiéster que unen los azúcares a través de los grupos hidroxilo 5 'y 3' (consulte el panel b en la figura siguiente) - recuerde que las etiquetas 5 'y 3' se refieren a los carbonos de la molécula de azúcar. Estas cadenas de azúcar y fosfato forman un conjunto contiguo de enlaces covalentes que a menudo se denominan "columna vertebral" de la estructura. En una molécula lineal, cada hebra tiene dos extremos libres. Uno se denomina extremo 5 'porque el grupo funcional no enlazado que normalmente participa en la unión de nucleótidos es el fosfato enlazado al carbono 5'. El otro extremo de la hebra se denomina extremo 3 'porque el grupo funcional no enlazado que participa en la unión de nucleótidos es el grupo hidroxilo enlazado al carbono 3' del azúcar. Dado que los dos extremos de la hebra no son simétricos, esto facilita la designación o descripción de una dirección en la hebra; por ejemplo, se puede decir que están leyendo desde el extremo 5 'hasta el extremo 3' para indicar que están "caminando" a lo largo de la hebra comenzando en el extremo 5 'y avanzando hacia el extremo 3'. Esta dirección (5 'a 3') es, por cierto, la convención utilizada por los biólogos para escribir secuencias. Se encuentra que las dos hebras de nucleótidos unidos covalentemente son antiparalelo el uno al otro en la doble hélice; es decir, la orientación / dirección de una hebra es opuesta a la de la otra hebra (consulte el panel b en la figura siguiente). La columna vertebral de azúcar-fosfato está en el exterior de la doble hélice, creando una banda de cargas negativas en la superficie. Por el contrario, las bases nitrogenadas de cada una de las hebras antiparalelas se apilan en el interior de la estructura y se oponen entre sí de una manera que permite que se formen enlaces de hidrógeno entre pares únicos de purina / pirimidina (A emparejamiento con T y G emparejamiento con C). "Apilamiento" se refiere al hecho de que los planos planos de las bases en la misma hebra de ADN se apilan, como una pila de panqueques. Estos emparejamientos específicos (A con T, C con G) se dice que son complementario a sobre otro y, por lo tanto, las hebras opuestas de una doble hélice a menudo se refieren entre sí como hebras complementarias.

Los hilos complementarios llevan información redundante. Debido al estricto emparejamiento químico, si conoce la secuencia de una hebra, también conoce la hebra de su complemento. Tomemos, por ejemplo, la secuencia 5′- C A T A T G G G A T G - 3 ′. Observe cómo la secuencia está anotada con la orientación (indicada por etiquetas de 5 'y 3'). El complemento de esta secuencia, escrito de acuerdo con la convención 5 'a 3', es: 5′- C A T C C C A T A T G - 3 ′. Si no está convencido, escriba estas dos secuencias una frente a la otra, asegurándose de escribirlas como hebras antiparalelas. Tenga en cuenta que la torsión de las dos hebras complementarias entre sí da como resultado la formación de características estructurales llamadas surcos mayor y menor que se volverán más importantes cuando consideramos la unión de proteínas al ADN (consulte el panel c en la figura siguiente).

La mayoría de los instructores de Bis2a esperarán que reconozca las características estructurales clave que se muestran en la figura siguiente y que podrá crear una figura básica de la estructura del ADN usted mismo.

El ADN tiene (a) una estructura de doble hélice y (b) enlaces fosfodiéster. Los (c) surcos mayor y menor son sitios de unión para proteínas de unión de ADN específicas de secuencia durante procesos como la transcripción (la creación de ARN a partir de una plantilla de ADN), la regulación de la transcripción y la identificación de los orígenes de la replicación por proteínas específicas ( ¡tenga en cuenta que la ADN polimerasa no se encuentra entre estos!). El enrollamiento del ADN alrededor de los nucleosomas, por el contrario, no es específico de secuencia y simplemente implica interacciones electrostáticas entre la columna vertebral cargada negativamente y la superficie externa cargada positivamente del nucleosoma. De manera similar, la ADN polimerasa copiará cualquier secuencia y se unirá al extremo 3 'de cualquier cebador legítimamente emparejado.

La estructura del ADN sugirió inmediatamente cómo podría replicarse el ADN. En teoría, las dos cadenas podrían separarse, los nuevos nucleótidos podrían alinearse en un orden específico que sea complementario a la cadena molde, y estos nuevos nucleótidos podrían unirse. Se sugirieron tres modelos en competencia para la replicación: el modelo conservador, el modelo semiconservador y el modelo dispersivo.

  1. Conservador: El modelo conservador de replicación postuló que cada molécula de doble hebra completa podría actuar como plantilla para la síntesis de una molécula de doble hebra completamente nueva. Es decir, si se pusiera una etiqueta química en la molécula de ADN de la plantilla después de la replicación, no se encontraría ninguna de esa etiqueta en la nueva copia. Este modelo parece un poco tonto, ya que las hebras tendrían que separarse, duplicarse y luego separarse nuevamente para encontrar y volver a unirse a su pareja original. O una nueva hebra tendría que formarse lado a lado con una doble hélice intacta, siguiendo algún tipo de plantilla que no implique el emparejamiento de bases Watson-Crick.
  2. Semiconservador: Esta hipótesis estipulaba que cada hebra individual de una molécula de ADN podría servir como plantilla para una nueva hebra, a la que ahora estaría unida por hidrógeno. En este caso, si se colocara una etiqueta química en la molécula de ADN de plantilla de doble hebra, una hebra en cada una de las copias retendría la etiqueta.
  3. Dispersivo: Este modelo propuso que una doble hélice copiada sería una combinación por partes de segmentos continuos de hebras "antiguas" y "nuevas". Si se colocara una etiqueta química en una molécula de ADN que se copiara utilizando un mecanismo dispersivo, se encontrarían segmentos discretos de la copia resultante que se etiquetaron en ambas cadenas separados por partes completamente no etiquetadas. Este modelo, de nuevo, parece innecesariamente complicado, ya que requiere que la hebra de la plantilla se rompa repetidamente y se vuelva a unir a moléculas más nuevas.

Meselson y Stahl resolvieron el problema en 1958 cuando informaron los resultados de un experimento ahora famoso que mostró que la replicación del ADN es semi-conservadora (ver figura a continuación), y que cada hebra se utiliza como plantilla para la creación de la nueva hebra. sin duda esperaban. Para obtener más información sobre este experimento, vea The Meselson-Stahl Experiment.

El ADN tiene una estructura de doble hélice antiparalela, las bases de nucleótidos están unidas por hidrógeno y cada hebra complementa a la otra. El ADN se replica de una manera semiconservativa, cada hebra se utiliza como molde para la hebra recién creada.

Replicación de ADN

Habiendo establecido algunas características estructurales básicas y la necesidad de un mecanismo semiconservador, es importante comprender lo que se sabe sobre el proceso y pensar en las preguntas que uno podría querer responder.

Dado que la replicación del ADN es un proceso, podemos invocar la "historia de la energía" para pensar en ello. Recuerde que una historia de energía está ahí para ayudarnos a pensar sistemáticamente sobre los procesos (cómo van las cosas de A a B). En este caso, el proceso consiste en comenzar con una molécula de ADN de doble hebra y terminar con dos moléculas de ADN de doble hebra. Entonces, preguntaremos cosas como: ¿Cómo se ve el sistema al comienzo (materia y energía) de la replicación? ¿Cómo se transfieren la materia y la energía en el sistema y qué cataliza las transferencias? ¿Cómo se ve el sistema al final del proceso? También podemos hacer preguntas sobre eventos específicos que DEBEN suceder durante el proceso. Por ejemplo, dado que el ADN es una molécula larga y, a veces, es circular, podemos hacer preguntas básicas como, dónde ¿Comienza el proceso de replicación? ¿Dónde termina? También podemos hacer preguntas prácticas sobre el proceso como, ¿qué sucede cuando se desenrolla una estructura de doble hebra?

Consideramos algunas de estas preguntas clave en este texto y en clase, y lo alentamos a que haga lo mismo.

Requisitos para la replicación del ADN

Comencemos por enumerar algunos requisitos funcionales básicos para la replicación del ADN que podemos inferir con solo pensar en el proceso que debe ocurrir y / o ser requerido para que ocurra la replicación. ¿Entonces, qué necesitamos?

• Sabemos que el ADN está compuesto por nucleótidos. Si vamos a crear una nueva hebra, necesitaremos una fuente de nucleótidos.
• Podemos inferir que la construcción de una nueva hebra de ADN requerirá una fuente de energía; deberíamos intentar encontrarla.
• Podemos inferir que debe haber un proceso para encontrar un lugar para iniciar la replicación.
• Podemos inferir que habrá una o más enzimas que ayudarán a catalizar el proceso de replicación.
• También podemos inferir que, dada la enorme cantidad de bases a copiar, se cometerán algunos errores.

Descubriremos que una vez que comprendamos los conceptos básicos de cómo se produce la replicación, surgirán preguntas / problemas adicionales.

Estructura de nucleótidos

Los componentes básicos del ADN son los nucleótidos. Los nucleótidos están compuestos por una base nitrogenada, desoxirribosa (un azúcar de 5 carbonos) y un grupo fosfato. El nucleótido se nombra según su base nitrogenada, purinas como la adenina (A) y guanina (G), o pirimidinas como la citosina (C) y la timina (T). Recuerde las estructuras a continuación. Tenga en cuenta que el nucleótido trifosfato de adenosina (ATP) es un precursor del desoxirribonucleótido (dATP) que se incorpora al ADN. Los otros nucleótidos que se emplean durante la síntesis de ADN son también nucleósidos trifosfatos. Es de esperar que este hecho proporcione algunas pistas sobre el origen de la energía para la síntesis de ADN.

Cada nucleótido está compuesto por un azúcar (ribosa o desoxirribosa dependiendo de si construye ARN o ADN, respectivamente), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Las purinas tienen una estructura de doble anillo con un anillo de seis miembros fusionado a un anillo de cinco miembros. Las pirimidinas son de menor tamaño; tienen una única estructura de anillo de seis miembros. Los átomos de carbono del azúcar de cinco carbonos se numeran 1 ', 2', 3 ', 4' y 5 '(1' se lee como “un primo”). El residuo de fosfato está unido al grupo hidroxilo del carbono 5 'de un azúcar de un nucleótido y al grupo hidroxilo del carbono 3' del azúcar del siguiente nucleótido, formando así un enlace fosfodiéster 5'-3 '.

Inicio de la replicación

Con millones, si no miles de millones, de nucleótidos para copiar, ¿cómo sabe la ADN polimerasa por dónde empezar? ¿Quizás podría comenzar en cualquier lugar o, más razonablemente, comenzar en un extremo de un cromosoma y continuar en el extremo opuesto? Ninguna de estas hipótesis es correcta. La evidencia indica que existen secuencias de nucleótidos específicas llamadas orígenes de la replicación a lo largo del ADN en el que comienza la replicación. La circular E. coli el cromosoma tiene solo uno de estos sitios; los cromosomas eucariotas lineales, por el contrario, tienen múltiples sitios en cada cromosoma. Sin embargo, una vez que se identifica este sitio, hay un problema. La doble hélice del ADN se mantiene unida por enlaces de hidrógeno. Si cada hebra debe leerse y copiarse individualmente, debe haber algún mecanismo responsable de disociar las dos hebras. Romper estos enlaces de hidrógeno es un proceso endergónico. ¿De dónde proviene la energía y cómo se cataliza esta reacción? El razonamiento básico debería, en este punto, conducir a la hipótesis de que está involucrado un catalizador de proteína y que esta enzima acopla la separación endergónica de hebras a algún proceso exergónico.

Resulta que los detalles de este proceso y las proteínas involucradas difieren según el organismo específico en cuestión y muchos de los detalles a nivel molecular aún no se han entendido por completo. Sin embargo, existen algunas características comunes en el establecimiento de los orígenes de replicación en eucariotas, bacterias y arqueas. Primero, las proteínas generalmente llamadas "iniciadores" tienen la capacidad de unirse al ADN en o muy cerca de las secuencias de ADN que marcan los orígenes de la replicación. La interacción de las proteínas iniciadoras con el ADN ayuda a desestabilizar la doble hélice y también a reclutar otras proteínas, incluida una enzima llamadahelicasa. En este caso, la energía necesaria para desestabilizar la doble hélice del ADN parece provenir de la formación de nuevas asociaciones entre el ADN y las proteínas iniciadoras. Por el contrario, la ADN helicasa, una vez cargada en el origen, acopla la hidrólisis exergónica del ATP al desenrollado de la doble hélice del ADN. Deben reclutarse proteínas adicionales para el complejo de iniciación parcialmente desenrollado. Estos incluyen, pero no se limitan a, enzimas llamadas primasey ADN polimerasa. Si bien los iniciadores se pierden poco después del inicio de la replicación, el resto de las proteínas trabajan en conjunto para ejecutar el proceso de replicación del ADN. Este complejo de enzimas funciona en estructuras en forma de Y en el ADN llamadas horquillas de replicación (ver figura a continuación). Para cualquier evento de replicación, se pueden formar dos bifurcaciones de replicación en cada origen de replicación, extendiéndose en ambas direcciones.

Discusión sugerida

¿Por qué diferentes organismos tienen diferentes números de orígenes de replicación? ¿Cuál podría ser el beneficio de tener más de uno? ¿Existe algún inconveniente en tener más de uno?

Discusión sugerida

Dado lo que debe suceder en los orígenes de la replicación, ¿puede utilizar la lógica para inferir y proponer para la discusión algunas características potenciales que distinguen los orígenes de la replicación de otros segmentos de ADN?

En el origen de la replicación, se forma una burbuja de replicación. La burbuja de replicación se compone de dos horquillas de replicación, cada una de las cuales viaja en direcciones opuestas a lo largo del ADN. Las bifurcaciones de replicación incluyen todas las enzimas necesarias para que se produzca la replicación; simplemente no se dibujan explícitamente en la figura para proporcionar espacio para ilustrar las relaciones entre la plantilla y las nuevas hebras de ADN. ¿Qué enzimas se necesitan y dónde se ubicarían en este dibujo?
Atribución: Imagen original del equipo Bis2A

Alargamiento de la replicación

La fusión de la doble hélice del ADN y el ensamblaje del complejo de replicación del ADN es solo el primer paso en el proceso de replicación. Ahora es necesario comenzar el proceso de creación de una nueva hebra. Aquí se encuentran desafíos adicionales. El primer problema obvio es determinar cuál de las dos hebras debe copiarse en cualquier bifurcación de replicación (es decir, ¿qué hebra servirá como plantilla para la síntesis semiconservadora)? ¿Son ambas opciones alternativas igualmente viables? También existe el problema de iniciar realmente el proceso de síntesis de nuevas cadenas.¿Puede la ADN polimerasa iniciar una nueva hebra por sí sola? Se ha determinado experimentalmente que la ADN polimerasa NO puede iniciar la síntesis de cadenas. Por el contrario, la ADN polimerasa requiere un tramo corto de ácidos nucleicos bicatenarios seguido de un molde monocatenario. La ADN polimerasa solo puede agregar una base al extremo 3 'preexistente emparejado correctamente. Esto plantea un pequeño problema para el inicio de la síntesis de ADN, ¿no es así?

Afortunadamente, la ADN polimerasa pueden agregar un dNTP a una molécula de ARN hibridada con una plantilla de ADN y ARN polimerasas

no

requieren un extremo 3 'preexistente con pares de bases para iniciar la síntesis. Por lo tanto, cada molécula de síntesis de ADN se inicia realmente a partir de un ARN corto (en E. coli, menos de una docena de bases). cebador (Estos se representan como líneas verdes cortas en las figuras de arriba y abajo). La creación de un cebador corto es realizada por la enzima. primase. La primasa es una polimerasa muy lenta (bueno, relativamente lenta, que requiere un segundo para hacer un cebador) y propensa a errores. La naturaleza propensa a errores de su actividad no es un problema, porque la célula eliminará todos los cebadores más adelante en el proceso de síntesis de ADN, y lo revisaremos más adelante en esta lectura.

Durante el proceso de elongación de la hebra, ADN polimerasa polimeriza una nueva cadena de nucleótidos de ADN unida covalentemente (en E. coli, esta polimerasa replicativa se llama ADN polimerasa III; en eucariotas, la nomenclatura de la polimerasa es más compleja y las funciones de las diversas polimerasas replicativas no se comprenden completamente). La ADN polimerasa viajará a lo largo del

plantilla

hebra en la dirección 3 'a 5' de esa hebra, sintetizando una nueva hebra añadiendo bases al extremo 3 'de la hebra naciente (recién nacida). (Le sugiero que haga su propio diagrama para aclarar esta direccionalidad; recuerde que las dos hebras son antiparalelas: la dirección de 3 'a 5' en la plantilla es la dirección de 5 'a 3' en la nueva hebra. Si esto suena confuso, entonces obtenga trabajar en ese diagrama lo antes posible).

Consideremos brevemente la reacción que implica la adición de un solo nucleótido. El cebador proporciona un importante hidroxilo 3 'en el que comenzar la síntesis. El siguiente desoxirribonucleótido trifosfato entra en el sitio de unión de la ADN polimerasa y es orientado por la polimerasa de modo que puede ocurrir una hidrólisis del trifosfato 5 'entrante, liberando pirofosfato y acoplando esta reacción exergónica a la síntesis endergónica de un enlace fosfodiéster entre los 5' fosfato del nucleótido entrante y el grupo hidroxilo 3 'del cebador. La degradación del pirofosfato agregará una patada enérgica adicional a esta reacción. Luego se repetirá este proceso. No existe un "sitio de terminación" real para la síntesis de ADN, la síntesis por cualquier polimerasa individual continuará hasta que el complejo de replicación se disocie del ADN; el complejo podría "caerse" del extremo de una hebra de plantilla rota, podría salir del extremo de un cromosoma lineal o podría chocar con el extremo 5 'de un cebador sintetizado previamente (más sobre esto más adelante). Esto suena mucho más complicado en texto de lo que realmente es: vea el diagrama de "Síntesis de hebras iniciales y finales" a continuación (y definitivamente dibuje su propia versión).

El apareamiento correcto de bases, o la selección del nucleótido correcto para agregar en cada paso, se logra mediante las limitaciones estructurales que siente la ADN polimerasa y los enlaces de hidrógeno energéticamente favorables que se forman entre los nucleótidos complementarios. El proceso es impulsado energéticamente por la hidrólisis del trifosfato 5 'entrante y las interacciones energéticamente favorables formadas por las interacciones entre nucleótidos en la doble hélice en crecimiento (apilamiento de bases y enlaces de hidrógeno de emparejamiento de bases complementarios).

Una vez que se completa el alargamiento de cualquier molécula nueva en particular, entra una ADN polimerasa diferente (en las bacterias, esto generalmente se llama ADN polimerasa I) para eliminar el cebador de ARN y sintetizar el fragmento restante de ADN faltante. Utilizará el extremo 3 'recientemente de la nueva hebra creada recientemente por la ADN polimerasa III como su cebador.

El movimiento de la horquilla de replicación y la separación de las hebras por la helicasa de ADN induce un enrollamiento excesivo del ADN en ambos por delante de la horquilla (imagina tomar dos hebras enrolladas una alrededor de la otra y tratar de separarlas, terminarías con un enredo en la parte no separada). Otra enzima que consume ATP llamada, en E. coli, girasa, ayuda a aliviar este estrés. Esta enzima se encuentra justo por delante de la horquilla de replicación y, repetidamente, corta y vuelve a unir el ADN, lo que permite que las superenrollamientos se relajen.

La ADN polimerasa cataliza la adición del grupo fosfato 5 'de un nucleótido entrante al grupo hidroxilo 3' del nucleótido anterior. Este proceso crea un enlace fosfodiéster entre los nucleótidos mientras hidroliza el enlace fosfoanhídrido en el nucleótido.
Fuente: http://bio1151.nicerweb.com/Locked/m...h16/elong.html

Discusión sugerida

Cree una historia de energía para la adición de un nucleótido a un polímero como se muestra en la figura anterior. Este será un objetivo de aprendizaje explícito de algunos de sus instructores Bis2A.

Hebra principal y rezagada

La discusión anterior sobre la elongación de la hebra describe el proceso de síntesis de una nueva hebra si esa hebra se sintetiza en la misma dirección que la bifurcación de replicación se mueve o parece estar moviéndose a lo largo del ADN. Esta hebra se puede sintetizar continuamente y se llama filamento principal (y se mueve a lo largo de la "plantilla de hebra principal"). Sin embargo, se deben copiar ambas hebras de la doble hélice de ADN original y, para minimizar la acumulación de ADN monocatenario (que es tanto susceptible de dañarse como difícil de reparar), ambas hebras se replican simultáneamente. Dado que la ADN polimerasa solo puede sintetizar ADN en una dirección de 5 'a 3', la polimerización de la hebra opuesta a la hebra principal debe ocurrir en la dirección opuesta a la que viaja la horquilla de replicación (este sería un buen momento para intentar dibujar todo esto, para orientarte). Esta hebra se llama hebra rezagada y debido a restricciones geométricas, debe sintetizarse a través de una serie repetida de eventos de síntesis de ADN y cebado de ARN, creando segmentos cortos de ADN nuevo llamados Fragmentos de Okazaki. Como se señaló, el inicio de la síntesis de cada fragmento de Okazaki requiere primasa para sintetizar un cebador de ARN y cada uno de estos cebadores de ARN debe eliminarse finalmente y reemplazarse con nucleótidos de ADN por una ADN polimerasa diferente. La ADN polimerasa I realiza este trabajo; se une al extremo 3 'de un fragmento de Okazaki existente, utilizando este (ADN) 3' para iniciar la replicación. La ADN polimerasa posee una actividad exonucleasa de 5 'a 3' y destruye los nucleótidos de ARN (antiguos cebadores) frente a ella, reemplazándolos con dNTP. Esto elimina el ARN de las nuevas hebras. Esto es bueno por muchas razones: dado que el ARN es relativamente inestable, la primasa es muy propensa a errores y la ADN polimerasa no podría usar el ARN como plantilla para la siguiente ronda de replicación). Por lo tanto, los enlaces covalentes entre cada uno de los fragmentos de Okazaki deben estar formados por otra enzima llamada ADNligasa, que utiliza un ATP para ligar el extremo 3 'del fragmento al extremo 5' del fragmento Okazaki (ahora libre de ARN) frente a él.

Pregunta rápida- ¿Por qué se necesita un ATP para que la ADN ligasa una dos fragmentos de Okazaki? Los ATP no son necesarios para que la ADN polimerasa agregue un nucleótido ...

La geometría de la síntesis de hebras rezagadas es difícil de visualizar y se tratará en clase. Sin embargo, esto podría representarse mejor con un video (¡uno que se mueva lentamente!). Se puede encontrar una representación realista de la síntesis simultánea de cadenas principales y retrasadas entre los videos de Drew Barry, aquí. Sin embargo, esta animación se mueve rápidamente (a la velocidad real). Un aspecto realmente fascinante de la progresión de la horquilla de replicación es el hecho de que las dos polimerasas, en la hebra principal y la hebra retrasada, están unidas. Ambos se mueven en la misma dirección que la horquilla de replicación, y la plantilla de hebra retrasada tiene que torcerse y enrollarse repetidamente para adaptarse a esta direccionalidad. También verá en este video cómo la ADN polimerasa debe recargarse repetidamente y luego disociarse de la plantilla de hebra rezagada. Ambas polimerasas se estabilizan en sus hebras de plantilla mediante una abrazadera que rodea esa hebra. En el video, verá el "cargador de pinzas" como un gran complejo que agarra y recarga repetidamente pinzas verdes del nucleoplasma.

Síntesis de cadenas principales y rezagadas. La hebra rezagada se crea en múltiples segmentos. Una bifurcación de replicación que muestra la hebra anterior y posterior. Una burbuja de replicación que muestra las hebras anteriores y posteriores.
Imagen original del equipo Bis2A

Una bifurcación de replicación en crecimiento. Todas las enzimas necesarias para la replicación del ADN (en E. coli), con la excepción de la iniciación, se ilustran aquí, aunque de una manera muy estilizada (pero muy clara). ¿Qué componentes están involucrados en la imprimación de la hebra delantera y la rezagada? ¿Extensión de hebra? Eliminación de nucleótidos de ARN (antiguos cebadores). ¿Unión de fragmentos separados de Okazaki? ¿Lidiando con la acumulación de superenrollamientos? Tenga en cuenta que las polimerasas de hebra anterior y posterior están unidas al cargador de abrazadera. ¿Cómo se puede sintetizar simultáneamente el ADN tanto en el soporte principal como en el posterior si las polimerasas están unidas entre sí?

Terminación de la replicación

Un problema específico de los cromosomas lineales: Telómeros y Telomerasa

La terminación de la replicación en cromosomas bacterianos circulares plantea pocos problemas prácticos. Sin embargo, los extremos de los cromosomas eucariotas lineales plantean un problema específico para la replicación del ADN. Debido a que la ADN polimerasa puede agregar nucleótidos en una sola dirección (5 'a 3'), la cadena principal permite la síntesis continua hasta que se alcanza el final del cromosoma; sin embargo, a medida que el complejo de replicación llega al final de la hebra rezagada, no hay lugar para que la primasa "aterrice" y sintetice un cebador de ARN para que se pueda iniciar la síntesis del fragmento de ADN de la hebra rezagada que falta al final del cromosoma. por la ADN polimerasa. Sin algún mecanismo que ayude a llenar este vacío, este extremo cromosómico permanecerá sin aparear y el cromosoma se acortará progresivamente con cada ronda de replicación, comprometiendo finalmente la capacidad del organismo para sobrevivir. Estos extremos de los cromosomas lineales se conocen como telómeros y contienen secuencias muy cortas y muy repetitivas que no codifican proteínas. Como consecuencia, estos telómeros "no codificantes" actúan como tampones de replicación y, en las células somáticas, de hecho se acortan con cada ronda de replicación del ADN. Por ejemplo, en los seres humanos, una secuencia de seis pares de bases, TTAGGG, se repite de 100 a 1000 veces al final de la mayoría de los cromosomas. ¡Claramente esta es una solución provisional! El descubrimiento de la enzima telomerasa ayudó a comprender cómo se mantienen los extremos de los cromosomas. La telomerasa es una enzima compuesta de proteína (una transcriptasa inversa, es decir, una enzima que copia una plantilla de ARN para producir ADN) y una plantilla de ARN corta. La telomerasa se adhiere al final del cromosoma mediante el apareamiento de bases complementarias entre el componente de ARN de la telomerasa y la secuencia telomérica del ADN. El ARN se utiliza luego como molde para el alargamiento del extremo del cromosoma. Este proceso se puede repetir varias veces. Una vez que la telomerasa alarga lo suficiente la plantilla de la hebra rezagada, la primasa creará un cebador seguido de ADN polimerasa que ahora puede agregar nucleótidos que son complementarios a los extremos de los cromosomas. Por tanto, se replican los extremos de los cromosomas.

Los extremos de los cromosomas lineales se mantienen gracias a la acción de la enzima telomerasa.

La telomerasa no es activa en las células somáticas. Las células somáticas adultas que se someten a división celular continúan acortando sus telómeros. Sin embargo, la telomerasa se expresa en células de la línea germinal, células que finalmente producirán gametos. Así, cada cigoto hereda cromosomas con telómeros largos. Los mutantes completamente defectuosos en la función de la telomerasa a menudo no tienen fenotipo, pero a medida que avanzan las generaciones, su descendencia se vuelve cada vez más defectuosa. Esto se debe a la pérdida gradual de secuencias teloméricas con cada división celular; una vez que estas secuencias se pierden, los cromosomas se vuelven extremadamente inestables y exhiben roturas frecuentes. Por lo tanto, las secuencias teloméricas no solo mantienen los cromosomas largos, sino que también evitan que los extremos de los cromosomas se reconozcan erróneamente como "roturas cromosómicas". La inestabilidad de los cromosomas sin telómeros se debe a los intentos equivocados de la célula de "reparar" estas roturas.

Diferencias en las tasas de replicación del ADN entre bacterias y eucariotas

La replicación del ADN ha sido muy bien estudiada en bacterias, principalmente debido al pequeño tamaño del genoma y al gran número de variantes disponibles. Escherichia coli tiene 4,6 millones de pares de bases en un solo cromosoma circular, y todo se replica en aproximadamente 42 minutos, comenzando desde un solo origen de replicación y avanzando alrededor del cromosoma en ambas direcciones. Esto significa que se agregan aproximadamente 1000 nucleótidos por segundo. El proceso es mucho más rápido que en eucariotas.

Tabla 1: Resumen de las diferencias entre replicaciones bacterianas y eucariotas.
PropiedadProcariotasEucariotas
Origen de la replicaciónSolteroMúltiple
Tasa de polimerización por polimerasa500 nucleótidos / s50 a 100 nucleótidos / s
Estructura cromosómicacircularlineal
TelomerasaNo presenteRegalo

Desafío de diseño de replicación: corrección de pruebas

Cuando la célula comienza la tarea de replicar el ADN, lo hace en respuesta a señales ambientales que le dicen a la célula que es hora de dividirse. El objetivo de la replicación del ADN es producir dos copias idénticas de la plantilla de ADN de doble hebra y hacerlo en una cantidad de tiempo que no represente un costo selectivo evolutivamente alto indebidamente. Esta es una tarea abrumadora si se considera que hay ~ 6.500.000.000 pares de bases en el genoma humano y ~ 4.500.000 pares de bases en el genoma de un genoma típico. E. coli cepa y que Nature ha determinado que las células deben hacer copias de sí mismas en 24 horas y 20 minutos, respectivamente. En cualquier caso, es necesario que tengan lugar muchas reacciones bioquímicas individuales.

Si bien lo ideal sería que la replicación ocurriera con perfecta fidelidad, la replicación del ADN, como todos los demás procesos bioquímicos, es imperfecta: se pueden omitir bases, agregar bases adicionales o se pueden agregar bases que no se emparejan adecuadamente. De hecho, la diferencia de energía potencial entre algunos nucleótidos correctamente emparejados y mal emparejados es simplemente insuficiente para "potenciar" la notable fidelidad de la ADN polimerasa (que inserta erróneamente nucleótidos a una velocidad de menos de 1/106). Muchos de los errores que ocurren durante la replicación del ADN son rápidamente corregidos por la propia ADN polimerasa a través de un mecanismo conocido como corrección de pruebas. En corrección de pruebas, la ADN polimerasa "lee" cada base recién agregada al detectar la presencia o ausencia de pequeñas anomalías estructurales antes de agregar la siguiente base a la cadena en crecimiento. Al hacerlo, se puede hacer una corrección.

Si la polimerasa detecta que una base recién agregada se ha emparejado correctamente con la base en la hebra plantilla, se agrega el siguiente nucleótido. Sin embargo, si se agrega un nucleótido incorrecto al polímero en crecimiento, la doble hélice mal formada hará que la ADN polimerasa se detenga y la hebra recién creada será expulsada del sitio de polimerización en la polimerasa y se moverá hacia un sitio de exonucleasa. En este sitio, la ADN polimerasa es capaz de escindir los últimos nucleótidos que se agregaron al polímero. Una vez que se hayan eliminado algunos nucleótidos, se agregarán nuevos de nuevo. Esta capacidad de revisión viene con algunas compensaciones: el uso de una polimerasa de corrección de errores / más precisa requiere tiempo. Cuanto más lento vaya, más preciso podrá ser. Sin embargo, ir demasiado lento puede evitar que se repita tan rápido como su competencia, por lo que es clave encontrar el equilibrio.

Los errores que no se corrigen mediante la corrección de pruebas o la reparación de desajustes (ver más abajo) pueden convertirse en mutaciones, pero solo si su presencia no es detectada por otro proceso de control de calidad: reparación de desajustes (discutido a continuación).

La corrección por ADN polimerasa corrige errores durante la replicación.

Discusión sugerida

¿Cuáles son los pros y los contras de las capacidades de corrección de pruebas de las ADN polimerasas?

¡La síntesis de cadenas principales y rezagadas es complicada! ¿Por qué no tener una segunda ADN polimerasa que extienda la hebra en la dirección 3 'a 5' en su lugar? Tener dos polimerasas, unidas juntas y proceder en ambas hebras simultáneamente, parecería ser una solución más simple. El requisito de energía aún se cumpliría: para ejecutar la polimerización en la dirección opuesta, simplemente tendríamos una hebra en crecimiento que termina con un trifosfato 5 ', que sería atacado por el 3' OH del dNTP entrante. Sin embargo, la polimerasa imaginaria que se agrega al extremo 5 ', en lugar del extremo 3' de la cadena, tendría problemas con la revisión. Su nucleótido agregado más recientemente lleva el trifosfato. Si esta base es errónea y es eliminada por la exonucleasa de corrección de pruebas, ya no habrá un trifosfato en el extremo 5 'de la cadena. Por tanto, la cadena no se pudo alargar. Intente dibujar esta situación, para una polimerasa real frente a esta polimerasa imaginaria que alarga el extremo 5 'de la cadena en crecimiento.

Errores de replicación y reparación del ADN

Aunque la replicación del ADN es típicamente un proceso muy preciso y la corrección de las ADN polimerasas ayuda a mantener baja la tasa de error (hasta aproximadamente 1/106 bases), todavía se producen errores. Además de los errores de replicación, también pueden producirse daños ambientales en el ADN. Tales errores de replicación no corregidos o daño ambiental del ADN pueden tener consecuencias graves. Por lo tanto, la naturaleza ha desarrollado varios mecanismos para detectar y reparar el ADN dañado o sintetizado incorrectamente.

Reparación de desajustes

Algunos errores no se corrigen durante la replicación, sino que se corrigen una vez finalizada la replicación; este tipo de reparación se conoce como reparación de desajustes. Enzimas específicas reconocen el nucleótido agregado incorrectamente y lo extirpan; reemplazándolo con la base correcta, usando la hebra hermana como plantilla. ¡Suficientemente simple! El problema es: ¿cómo reconocen las enzimas reparadoras de desajustes?

cuales

de las dos bases emparejadas incorrectamente es el

incorrecto

¿uno?

En E. coli, en algún momento después de la replicación, un subconjunto de adeninas (en una secuencia específica de 4 bases) adquiere un grupo metilo. Inmediatamente después de la replicación, la hebra de ADN parental (antigua) tendrá grupos metilo en estas A, mientras que la hebra recién sintetizada carece de ellos (la enzima que reconoce estos sitios aún no ha encontrado la nueva hebra). Por lo tanto, esta es una ventana de oportunidad para que las enzimas de reparación de desajustes sean capaces de escanear el ADN y eliminar las bases incorporadas incorrectamente de la hebra no metilada recién sintetizada, utilizando la hebra metilada como la plantilla "correcta" a partir de la cual incorporar una nueva. nucleótido. En eucariotas, el mecanismo para distinguir entre edad y edad vs.las nuevas hebras no se comprenden tan bien, pero se cree que implica el reconocimiento de mellas no selladas en la nueva hebra, así como una asociación continua a corto plazo de algunas de las proteínas de replicación con la nueva hebra hija después de que se haya completado la replicación.

Reparación por escisión de nucleótidos

Reparación por escisión de nucleótidos las enzimas reemplazan las bases dañadas haciendo un corte en los extremos 3 'y 5' del sitio dañado. El segmento completo de ADN se elimina y se reemplaza con nucleótidos correctamente emparejados mediante la acción de una ADN polimerasa. Una vez que se rellenan las bases, el espacio restante se sella con un enlace fosfodiéster catalizado por la enzima ADN ligasa. Este mecanismo de reparación se emplea a menudo cuando la exposición a los rayos UV provoca la formación de dímeros de pirimidina.

La escisión de nucleótidos repara los dímeros de timina. Cuando se exponen a los rayos UV, las pirimidinas adyacentes entre sí pueden formar dímeros, lo que distorsiona la hélice y no es una plantilla aceptable para la síntesis de ADN por la polimerasa replicativa. En las células normales, se extirpan y reemplazan.

Inversión de daño

Los mecanismos descritos anteriormente reflejan una estrategia de "eliminar y reemplazar" para la reparación del ADN y aprovechar la redundancia en la información de la doble hélice. Tenga en cuenta que la reparación por escisión no se puede emplear en genomas de ADN o ARN monocatenarios, que se encuentran con frecuencia en los virus. Sin embargo, hay un par de tipos de daño que son tan comunes que ha evolucionado una vía de reparación específica para reconocer y simplemente revertir este tipo específico de daño a las bases, en lugar de extirpar y reemplazar un oligonucleótido dañado. Un ejemplo es la fotoliasa, una enzima que reconoce y revierte los dímeros de pirimidina, la forma más común de daño inducido por los rayos UV. En realidad, esta enzima está "alimentada" por luz azul (que debería estar presente en cualquier entorno en el que se encuentre luz ultravioleta). La proteína reconoce los dímeros de pirimidina y, cuando es golpeada por la luz, dona (y luego recupera) un electrón, rompiendo los enlaces inapropiados entre las dos bases adyacentes. Casi todos los seres vivos expresan esta enzima, excepto, desafortunadamente, los mamíferos placentarios. Estamos "atascados" con la reparación por escisión como nuestro único modo de reparación del daño inducido por los rayos UV.

Consecuencias de los errores de replicación, transcripción y traducción

Algo sobre lo que pensar:

Las células han desarrollado una variedad de formas para asegurarse de que los errores de ADN se detecten y se corrijan. Ya hemos comentado varios de ellos. ¿Por qué evolucionaron estos? Tales mecanismos no evolucionaron para reparar ARN o proteínas. ¿Cuáles serían las consecuencias de un error en la transcripción? ¿Tal error afectaría a la descendencia? ¿Sería letal para la celda? ¿Qué pasa con los errores de traducción? ¿Cómo contrastan estos con los errores en la replicación del ADN? Si no está familiarizado con la transcripción o la traducción, no se preocupe. Las aprenderemos pronto y volveremos a esta pregunta.


La replicación alterada del ADN desreprime la cromatina y genera una memoria epigenética heredada transgeneracionalmente

La replicación alterada del ADN es un sello distintivo del cáncer y una causa de inestabilidad genómica. Informamos que, además de causar un cambio genético, la replicación alterada del ADN durante el desarrollo embrionario puede tener importantes consecuencias epigenéticas para un genoma. En una pantalla de todo el genoma, identificamos la replicación alterada del ADN como una causa de una mayor expresión de un transgén reprimido en Caenorhabditis elegans. El estado de expresión adquirido se comportó como un "epialélico", siendo heredado durante varias generaciones antes de restablecerse por completo. La desrepresión no se restringió al transgén, sino que fue causada por una reducción global en las modificaciones de las histonas asociadas a la heterocromatina debido a la retención deficiente de las histonas modificadas en el ADN durante la replicación en el embrión temprano. Por lo tanto, la replicación alterada del ADN durante el desarrollo puede desreprimir globalmente la cromatina, creando nuevos estados de expresión epigenética heredados intergeneracionalmente.

Cifras

Fig. 1. Deterioro de la replicación del ADN durante la fase embrionaria ...

Fig. 1. La alteración de la replicación del ADN durante el desarrollo embrionario desreprime una matriz transgénica.

Fig. 2. La ausencia de histona represiva ...

Fig. 2. La ausencia de modificaciones de histonas represivas suprime el efecto de la replicación alterada en ...

Fig. 3. La replicación alterada del ADN altera globalmente ...

Fig. 3. La replicación alterada del ADN altera globalmente las modificaciones de las histonas.

( A para C ) Representante ...

Fig. 4. La replicación deteriorada del ADN desreprime globalmente ...

Fig. 4. La replicación alterada del ADN desreprime globalmente la cromatina.

Doble cambio en la expresión del mapeo de genes ...

Fig. 5. La replicación deteriorada interfiere con ...

Fig. 5. La replicación alterada interfiere con la herencia de las histonas paternas modificadas con H3K27me3.

Fig. 6. Herencia epigenética transgeneracional de…

Fig. 6. Herencia epigenética transgeneracional de la expresión adquirida tras el deterioro de la replicación del ADN.

La replicación deteriorada del ADN durante las primeras divisiones embrionarias conduce a una retención ineficiente ...


Regulación del inicio de la replicación del ADN en Schizosaccharomyces pombe

Se cultivaron células de Schizosaccharomyces pombe en medio mínimo con diferentes fuentes de nitrógeno en condiciones de estado estacionario, con tiempos de duplicación que oscilaban entre 2,5 y 14 horas. La citometría de flujo y la microscopía de fluorescencia confirmaron hallazgos anteriores de que a tasas de crecimiento rápidas, la fase G1 era corta y la separación celular se producía al final de la fase S. Para algunas fuentes de nitrógeno, la tasa de crecimiento se redujo en gran medida, la fase G1 ocupó el 30-50% del ciclo celular y la separación celular se produjo en G1 temprano. En contraste, otras fuentes de nitrógeno soportaron bajas tasas de crecimiento sin ningún aumento significativo en la duración de G1. El método descrito permite la manipulación de la longitud de G1 y la posición relativa del ciclo celular de la fase S en células de tipo salvaje. La masa celular se midió mediante citometría de flujo como luz dispersa y como fluorescencia asociada a proteínas. Las extensiones de G1 no estaban relacionadas con la masa celular al entrar en la fase S. Nuestros datos no apoyan la hipótesis de que las células deben alcanzar una cierta masa crítica fija antes de entrar en S. Sugerimos que la masa celular en el punto de transición G1 / S es variable y está determinada por un conjunto de parámetros moleculares. En los presentes experimentos, estos parámetros fueron influenciados por las diferentes fuentes de nitrógeno de una manera que fue independiente de la tasa de crecimiento real.


COMENTARIO

Información de contexto

La CEP humana es muy prometedora en el campo de la medicina regenerativa. Sin embargo, para alcanzar el máximo potencial de estas células, primero debemos capitalizar su capacidad de renovarse rápida e infinitamente para generar un gran número de células genéticamente estables e indiferenciadas. Sin embargo, se ha hecho evidente que las CEP humanas adquieren cambios genéticos durante el cultivo a largo plazo, lo que genera preocupaciones sobre la seguridad de los productos derivados de células madre que se destinan a la clínica (Draper et al., 2004, Olariu et al., 2010). ). La naturaleza recurrente de ciertos cambios cariotípicos, como las amplificaciones de los cromosomas 1q, 12p, 17q y 20q, han puesto de relieve que ciertas mutaciones proporcionan una ventaja de crecimiento a la célula variante, que se selecciona en un cultivo con el tiempo (Amps et al. , 2011, Baker et al., 2016, Olariu et al., 2010). A pesar de que el mecanismo de selección ahora está bien definido, se sabe relativamente poco sobre los mecanismos mutacionales subyacentes, aunque las observaciones del estrés de replicación y el daño genómico en la CEP humana son similares al modelo inducido por oncogenes de inestabilidad genética en el desarrollo y la progresión del cáncer (Halazonetis , Gorgoulis y Bartek, 2008). La autorrenovación de la CEP humana se caracteriza por una fase G1 abreviada que pasa por alto el punto de control Rb / E2F y está impulsada por una alta expresión de ciclina D2 y expresión constitutiva de ciclina E (Becker et al., 2006, Filipczyk, Laslett, Mummery, Y Pera, 2007). Mantener esta rápida proliferación durante períodos de cultivo extensos puede exponer estas células a estrés de replicación, cuyas características, como tasas de replicación reducidas, se han definido en la PSC humana utilizando el ensayo de fibra de ADN (Halliwell et al., 2020). Además, recientemente hemos identificado regiones de microhomología en el punto de ruptura de la amplificación en tándem del cromosoma 20, lo que implica que los mecanismos de cambio de plantilla en las bifurcaciones estancadas o colapsadas son responsables de estas mutaciones (JA Halliwell, D. Baker, PW Andrews, I.Barbaric, observación no publicada). En conjunto, estos estudios han determinado que la estabilidad genética en la CEP humana está abiertamente ligada a la replicación del ADN. Este artículo proporciona detalles experimentales y protocolos necesarios para realizar el ensayo de fibra de ADN, que se han optimizado para estudiar el estrés de replicación en la CEP humana.

El procedimiento descrito en este artículo se ha optimizado para su uso con PSC humana y se ha aplicado con éxito a varias líneas de células iPSC humanas y ESC humanas (Halliwell et al., 2020). Hemos utilizado este ensayo para mejorar las condiciones de cultivo: complementar los cultivos con nucleósidos alivia el estrés de replicación y disminuye la frecuencia de errores mitóticos, destacando que estos eventos están relacionados en la CEP humana (Halliwell et al., 2020). El ensayo de fibra de ADN ha revelado enfoques que pueden usarse para reducir la aparición de inestabilidad genética en la CEP humana, que es necesaria para la aplicación segura de la CEP humana en la medicina regenerativa.

Parámetros críticos

Hemos observado poca diferencia en los resultados del ensayo de fibra si las PSC humanas se cultivan en medio de cultivo celular mTeSR, E8 o Nutristem. Actualmente, no se han probado las prácticas de cultivo de células dependientes de la capa alimentadora. El ensayo completo se puede realizar en un solo día, aunque hemos incluido un punto de parada después del paso de fijación en el Protocolo básico 2, que permite que el protocolo se ejecute durante un período de 2 días.

Aconsejamos permitir que la PSC humana se recupere durante al menos 48 horas después de la siembra en placa. Esto permitirá 24 h en cultivo sin inhibidor de proteína quinasa 1 asociado a Rho, en espiral enrollado que contiene (Y-27632). También permitirá la recuperación del estresante recubrimiento y que las células vuelvan a entrar en la fase de crecimiento logarítmico. Es fundamental, cuando se van a comparar los resultados de los experimentos, que la densidad de las células sembradas inicialmente y la confluencia en el punto de inicio del experimento sean consistentes. Una mayor confluencia puede hacer que la proliferación celular y la replicación del ADN se ralenticen.

Con respecto al marcaje del ADN, es posible aumentar o disminuir los tiempos de marcaje del pulso, pero esto dará como resultado fibras de ADN más largas y más cortas, respectivamente. Nuevamente, el tiempo de etiquetado debe ser constante en experimentos comparables. También es importante que el tiempo de etiquetado se mida con precisión. Las desviaciones de 1 minuto aumentarán el etiquetado en un 5% y confundirán los resultados del experimento. Para garantizar un etiquetado oportuno, se recomienda que los reactivos se preparen mucho antes de comenzar el experimento. Además, al agregar el segundo análogo de nucleótidos (IdU), la placa debe retirarse de la incubadora 1 minuto antes del final del primer período de incubación, para proporcionar un tampón de tiempo al preparar la segunda etiqueta.

Una vez recolectadas, las células deben suspenderse en PBS helado y mantenerse en hielo. La propagación del ADN debe realizarse en 30 minutos para minimizar la muerte celular.

Al esparcir fibras de ADN, el usuario debe seleccionar portaobjetos donde la gota se esparce a lo largo del portaobjetos en 3 a 5 minutos a una velocidad constante. En nuestra experiencia, los lotes de portaobjetos pueden diferir entre sí y cada lote debe optimizarse.

Solución de problemas

La Tabla 2 describe los problemas que pueden surgir con varios pasos del ensayo, junto con sus posibles causas y Soluciones.

Paso Problema Razón posible Solución
Protocolo básico 1 (paso 18) Demasiadas fibras de ADN superpuestas La densidad de las células marcadas para la propagación es demasiado alta. Diluir la solución de células etiquetadas recolectadas
Protocolo básico 2 (paso 6) El esparcimiento de las fibras ocurre demasiado lento o rápido Temperatura ambiente Aumentar o disminuir el volumen del búfer de esparcimiento
Humedad Aumentar o disminuir el ángulo de inclinación de la diapositiva
Portaobjetos de microscopio Optimice las condiciones de esparcimiento para cada marca y lote de portaobjetos de microscopio antes de su uso
Protocolo de soporte 2 Resultados inconsistentes entre réplicas biológicas y técnicas Duración del etiquetado de impulsos Asegúrese de agregar CldU o IdU durante 20 minutos exactamente
Tiempo entre la recolección de células y la propagación. Realice la propagación antes de la recolección de células. Reduzca la cantidad de muestras para que sea más manejable.

Análisis estadístico

Es importante tomar imágenes de campos con un mínimo de cruces de fibra en todo el portaobjetos para garantizar una medición sólida de las horquillas de replicación en progreso. Se debe medir un mínimo de 150-200 fibras individuales para tener en cuenta la heterogeneidad entre las horquillas progresivas. El factor de conversión de las fibras de ADN estiradas es de 2,59 kb / μm (Jackson y Pombo, 1998).

Debería tenerse en cuenta la presentación de datos. Los histogramas y los diagramas de dispersión son apropiados para capturar las diferencias normales en la progresión de la horquilla de replicación. La significancia estadística se puede calcular utilizando un indicador de Mann-Whitney no apareado. U-prueba.

Comprensión de los resultados

Las fibras de ADN producidas pueden ser variables pero, según nuestra experiencia, en condiciones normales de crecimiento, deben contener longitudes iguales de tinción de CldU e IdU. Cuando se mide, encontramos que la velocidad de la horquilla de replicación varía entre 0,5 y 0,75 kb / min. Una longitud de fibra o una velocidad de horquilla reducidas pueden indicar estrés de replicación.

El seguimiento de la frecuencia de los eventos de replicación puede proporcionar información valiosa sobre los procesos de replicación que se llevan a cabo durante el cultivo de la PSC humana (Fig. 3). Se requiere un control estricto de la densidad del origen de replicación para mantener la estabilidad cromosómica (Prioleau y MacAlpine, 2016). La activación excesiva del origen de la replicación puede agotar las proteínas y los metabolitos necesarios para una replicación eficaz del ADN (Sørensen y Syljuåsen, 2012). Una disminución en la distancia entre orígenes o una mayor densidad de fibras etiquetadas solo con IdU es una medida de una mayor densidad de origen, lo que sugiere un mayor número de orígenes de replicación que disparan simultáneamente. El estancamiento de la horquilla es un requisito previo para la rotura del ADN, que puede convertirse en un sustrato para la inestabilidad genética (Toledo, Neelsen y Lukas, 2017). La medición de la frecuencia de las fibras solo CldU o la proporción de las etiquetas IdU en una horquilla bidireccional se puede utilizar para medir el bloqueo de la horquilla. Una fibra IdU más corta en un lado de una bifurcación bidireccional implica un evento de bloqueo de la bifurcación y dará como resultado una mayor proporción entre los tractos IdU.

Consideraciones de tiempo

Protocolo básico 1

Las células deben cultivarse durante un mínimo de 48 horas después de la siembra. Hemos encontrado que 72 horas son óptimas. Pasos 1 a 6: se necesitarán 40 min para la siembra celular. Se necesitarán 20 min por día para refrescar el medio.

Pasos 7 a 18: Se necesitará aproximadamente 1 hora para marcar el pulso y recolectar las células.

Protocolo básico 2

Paso 1 a 4: la preparación del lisado celular para la propagación del ADN requerirá aproximadamente 15 min.

Paso 5 a 7: la propagación del ADN requerirá aproximadamente 20 min para esparcir un juego de tres portaobjetos simultáneamente.

Paso 8 a 10: la fijación de las fibras de ADN requerirá aproximadamente 15 min.

Protocolo básico 3

Paso 1 a 18: los pasos de inmunomarcaje de ADN requerirán aproximadamente 6,5 horas.

Protocolo de soporte 1 y 2

Se necesitarán varias horas para la adquisición de imágenes y el análisis de datos, pero esto variará según la calidad de las fibras de ADN y la pregunta biológica que se plantee.

Expresiones de gratitud

Este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención n. ° 668724.

Este trabajo fue financiado en parte por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No. 668724 y en parte por la Plataforma de Medicina Regenerativa del Reino Unido, referencia de MRC MR / R015724 / 1.


4 respuestas 4

El profesor Allen Gathman tiene un excelente video de 10 minutos en Youtube, que explica la reacción de agregar nucleótidos en la dirección de 5 'a 3' y por qué no funciona al revés.

Brevemente, la energía para la formación del enlace fosfodiéster proviene del dNTP, que debe agregarse. El dNTP es un nucleótido que tiene dos fosfatos adicionales unidos a su extremo 5 '. Para unir el grupo 3'OH con el fosfato del siguiente nucleótido, se debe eliminar un oxígeno de este grupo fosfato. Este oxígeno también está unido a dos fosfatos adicionales, que también están unidos a un Mg ++. Mg ++ tira de los electrones del oxígeno, lo que debilita este enlace y el llamado ataque nucleofílico del oxígeno del 3'OH tiene éxito, formando así el enlace fospodiéster.

Si intenta unir el grupo 3'OH del dNTP al fosfato 5 'del siguiente nucleótido, no habrá suficiente energía para debilitar el enlace entre el oxígeno conectado al fósforo 5' (los otros dos fosfatos del dNTP son en el extremo 5 ', no en el extremo 3'), lo que dificulta el ataque nucleofílico.

Mira el video, está mejor explicado allí.

Las replicaciones del ADN necesitan una fuente de energía para continuar, esta energía se obtiene al escindir el 5'-trifosfato del nucleótido que se agrega a la cadena de ADN existente. Cualquier mecanismo de polimerasa alternativo debe tener en cuenta la fuente de energía necesaria para añadir un nucleótido.

La forma más sencilla que uno puede imaginar para realizar la polimerización inversa 3'-5 'sería usar nucleótido-3'-trifosfato en lugar del nucleótido-5'-trifosfato que utiliza cada polimerasa existente. Esto permitiría un mecanismo prácticamente idéntico al de las polimerasas existentes, solo que con diferentes nucleótidos como sustratos. El problema con este modelo es que los ribonucleótidos-3'-trifosfatos son menos estables en condiciones ácidas debido al vecino 2'-OH (aunque esto obviamente solo se aplica al ARN, no al ADN).

Por lo tanto, cualquier polimerasa 3'-5 'probablemente necesitaría usar los mismos nucleótidos-5'-trifosfatos que la polimerasa 5'-3'. Esto significaría que el trifosfato que proporciona la energía para la adición de un nuevo nucleótido estaría en la cadena de ADN que se extiende y no en el nucleótido recién agregado.

Una desventaja de este enfoque es que los nucleótidos trifosfatos se hidrolizan espontáneamente en condiciones acuosas. Este no es un problema significativo para la polimerasa 5'-3 ', ya que el trifosfato está en el nuevo nucleótido y la polimerasa solo tiene que encontrar un nuevo nucleótido. Para la polimerasa 3'-5 ', la hidrólisis espontánea es un problema porque el trifosfato está en la cadena en crecimiento. Si ese se hidroliza, toda la polimerización debe interrumpirse o el trifosfato debe leerse mediante algún mecanismo.

Puede consultar el artículo "Un modelo para la evolución de la direccionalidad de la polimerasa de nucleótidos" de Joshua Ballanco y Marc L. Mansfield para obtener más información al respecto. Crearon un modelo sobre la evolución temprana de la polimerasa, aunque no llegan a ninguna conclusión final.

En mi opinión, el "gran video de 10 minutos en Youtube" del Prof. Allen Gathman es una pérdida de tiempo si ya sabe cómo ocurre la hidrólisis.De hecho, no ha considerado la ruta 3 '-> 5' de manera imparcial, no parece considerar la posibilidad de que aparezca un trifosfato en la punta creciente de 5 'de la hebra en 3' -> 5 ' caso.

En realidad, la única diferencia entre las dos rutas (5 '-> 3' y 3 '-> 5') es que el trifosfato reaccionante aparece en diferentes lugares. En el caso habitual, el trifosfato hidrolizado pertenece al nucleótido añadido, mientras que en el último caso, el trifosfato hidrolizado pertenece al nucleótido de la cadena en crecimiento. Ambos son factibles.

De hecho, se sabe que ARN La polimerasa tiene actividad dual, pero como ve, ¡la ARN polimerasa no tiene actividad de corrección de pruebas !. La corrección requiere la eliminación de la base que no coincide, pero en la dirección 3 '-> 5 el accesorio de la base había consumido el trifosfato en la punta de 5' de la hebra, por lo que ya no está disponible para agregar la base de reemplazo. La actividad 3 '-> 5' destruye fácilmente la capacidad de corrección de pruebas de una polimerasa Así que básicamente, es la necesidad de revisión lo que restringe la síntesis de cadenas de ADN a 5 '-> 3'. Por qué es así, necesitaría mucha más explicación (si es en palabras) pero creo que una imagen tiene un poder explicativo mucho mejor que mil palabras. He añadido una imagen de Biología celular esencial que muestra la respuesta a la pregunta 'POR QUÉ':

La otra consideración importante es la reparación. Si faltan uno o más nucleótidos en una hebra, la reparación del nucleótido faltante sería imposible para la síntesis de 3 'a 5', porque no hay presente 5'-trifosfato. Por otro lado, la síntesis de 5 'a 3' no requiere un trifosfato 3 'presente en el sitio de reparación. Esto es importante. Es decir, la síntesis de 3 'a 5' no permite la reparación de nucleótidos.


Resultados

Implementación de TrAEL-seq

Varias ligasas pueden unir enlazadores de ADN monocatenarios al extremo 3 'del ADN monocatenario, pero la eficacia es generalmente baja. Un método alternativo descrito por Miura y sus colegas utiliza la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) para agregar de 1 a 4 nucleótidos de adenosina en los extremos 3 'del ADN monocatenario, formando un sustrato para la ligadura del adaptador de ADN mediante ligasas de ARN [41,42] (pasos de la figura 1A i y ii). En un sustrato de prueba in vitro, TdT añadió de 1 a 3 colas de nucleótido A a & gt95% de las moléculas de ADN monocatenario, que se ligó con aproximadamente un 10% de eficacia al adaptador 1 de TrAEL-seq utilizando T4 RNA ligasa 2 KQ truncada (figura 1B) .

(A) Representación esquemática del método TrAEL-seq. El ADN genómico incluido en agarosa se usa como material de partida, los tapones se lavan extensamente para eliminar el adaptador 1 de TrAEL no ligado y la agarosa se elimina antes de la etapa de polimerasa Bst 2.0. El rombo y la ligadura del adaptador TrAEL 2 se realiza usando un kit de ADN NEBNext Ultra II, y los homodímeros del adaptador TrAEL 2 se eliminan lavando perlas de estreptavidina antes del tratamiento con enzima USER. El material terminado está listo para la amplificación por PCR utilizando el sistema de amplificación NEBNext. Tenga en cuenta que TrAEL-seq lee el mapa antisentido de la hebra escindida, leyendo la secuencia complementaria comenzando desde el primer nucleótido antes del sitio de escisión. * - resto de biotina, U - desoxiuracilo, N - cualquier base de ADN, rA - adenosina. (B) Ensayo in vitro de ligadura de adaptadores. Se trató un oligonucleótido de ADN monocatenario de 18 nucleótidos con o sin TdT, luego se ligó al adaptador 1 de TrAEL usando T4 ARN ligasa 2 truncada KQ. Los productos se separaron en un gel PAGE al 15% y se visualizaron mediante tinción SYBR Gold. (C) Gráfico de dispersión que compara los recuentos leídos de ADN de levadura digerido con SfiI, PmeYo y NoI, junto con el promedio del genoma, basado en END-seq y TrAEL-seq. Tenga en cuenta que la señal promedio del genoma abarca todas las regiones de 13 pb de copia única que no se superponen con un sitio, mientras que la cuantificación de la enzima de restricción representa el mapeo de lecturas de 13 pb alrededor del sitio de reconocimiento (SfiEl sitio es de 13 pb, NoI / PmeLos sitios I se ampliaron a 13 pb). (D) Mapeo de precisión de SfiEscinde los sitios por TrAEL-seq y END-seq. SfiLos sitios I, que contienen 5 bases degeneradas, se dividieron en aquellos que no contienen A en el sitio de escisión (GGCCNNNB | BGGCC, 87 sitios, panel superior) o A que flanquean el sitio de escisión (GGCCNNNA | AGGCC, 15 sitios, panel inferior), considerando sitios de escisión en las hebras de avance y retroceso por separado. Las ubicaciones mapeadas de los extremos 3 'se promediaron en cada categoría de sitio y se expresaron como un porcentaje de todos los extremos 3' mapeados por cada método a esa categoría de sitio. (mi) Comparación de perfiles DSB meióticos de dmc1Δ celdas realizadas por TrAEL-seq y sae2Δ células por S1-seq (acceso SRA: SRP261135) [45]. Ambas técnicas deberían mapear los sitios de escisión de Spo11 en los mutantes dados. Se muestran regiones de 25 kb y 2,5 kb en el cromosoma III para lecturas contadas en ventanas de 20 pb. El panel más bajo muestra 500 bp alrededor del pico principal para las lecturas contadas con una resolución de un solo bp. (F) Gráfico de dispersión de los recuentos de lecturas normalizados transformados logarítmicamente en los 3.907 puntos calientes de escisión de Spo11 anotados por Mohibullah y Keeney, comparando dmc1Δ TrAEL-seq con sae2Δ S1-seq datos (derecha) [16, 45, 47] (acceso de SRA: SRP261135). Los datos numéricos subyacentes a esta figura se pueden encontrar en S1 Data, imagen de gel en S1 Raw Images. DSB, TdT de ruptura de doble hebra, desoxinucleotidil transferasa terminal TrAEL-seq, secuenciación de ligadura de extremos activada por transferasa.

El adaptador TrAEL-seq 1 es una horquilla que prepara la conversión de productos de ligación de una sola hebra en ADN de doble hebra adecuado para la construcción de bibliotecas, incorpora una fracción de biotina flanqueada por residuos de desoxiuracilo que permite la purificación y elución selectiva de los productos de ligación, e incluye un 8- Identificador molecular único de nucleótidos (UMI) para la eliminación bioinformática de duplicados de PCR (Fig. 1A). Una vez que se liga el adaptador 1 de TrAEL-seq, una polimerasa termófila con un fuerte desplazamiento de hebra y actividades de transcriptasa inversa extiende la horquilla para formar ADN de doble hebra sin cortar (Fig 1A, paso iii), luego el ADN se fragmenta mediante sonicación y material ligado al adaptador se purifica en perlas magnéticas de estreptavidina (Fig. 1A, pasos iv y v). Los extremos de ADN formados durante la fragmentación se pulen y se ligan al adaptador TrAEL 2 mientras aún están unidos a las perlas (Fig 1A, paso vi), luego los fragmentos purificados flanqueados por los adaptadores TrAEL 1 y 2 se eluyen mediante escisión de los residuos de desoxiuracilo antes de la biblioteca. amplificación (Fig. 1A, paso vii). La biblioteca resultante se secuencia utilizando un cebador que se hibrida con el adaptador 1 de TrAEL-seq, de modo que la lectura de TrAEL-seq es el complemento inverso del extremo 3 ′ del ADN original (Figura 1A, paso viii).

Detección de extremos de ADN extendido 3 'mediante TrAEL-seq

Probamos TrAEL-seq en ADN genómico de levadura incrustado en agarosa digerido con enzimas de restricción NoI, PmeYo y SfiI que producen extremos 5 ′ extendidos, romos y 3 ′ extendidos, respectivamente, y generó una biblioteca END-seq de tipo BLESS a partir del mismo material digerido para comparación (Fig. 1C). La biblioteca TrAEL-seq resultante contenía fragmentos de 200 a 2000 pb como se esperaba (figura S1A), y los datos de secuenciación se procesaron a través de una tubería bioinformática personalizada para eliminar la cola A, mapear las lecturas y deduplicar por UMI (ilustrado en la figura S1B). ). La comparación de los datos de TrAEL-seq y END-seq muestra que ambos métodos detectan sitios de escisión de enzimas de restricción: la eficiencia es aproximadamente igual en los extremos extendidos 3 ′, END-seq es más eficiente en los extremos extendidos 5 ′, mientras que TrAEL-seq inesperadamente se desempeñó mejor en el desafilado PmeTermina (Fig. 1C). Por lo tanto, ambos métodos detectan de manera eficiente los DSB a pesar de que las estrategias de etiquetado son muy diferentes.

La enzima de restricción SfiI tiene una secuencia de reconocimiento degenerada (GGCCNNNN | NGGCC) que permite la evaluación de la eficacia de la ligadura de TrAEL-seq en diferentes secuencias del extremo 3 ′, lo que nos permite asegurarnos de que no hay sesgo para los extremos del ADN basados ​​en el 3 ′ o nucleótidos adyacentes (S1C Fig. ). Mapeo fino de escisiones en el SfiEl sitio de reconocimiento I GGCCNNNN | NGGCC revela diferencias entre END-seq y TrAEL-seq: END-seq, en común con otros métodos de tipo BLESS, degrada el saliente 3 'y devuelve una ubicación de escisión consenso 3' de los nucleótidos 4 a 5 del sitio de reconocimiento (Fig. 1D). Por el contrario, TrAEL-seq puede mapear el sitio de escisión real (3 'del nucleótido 8) y lo hace para eventos & gt98%, pero solo para SfiI sitios que carecen de nucleótidos A adyacentes al sitio de escisión (es decir, GGCCNNNB | BGGCC) (Fig 1D, arriba). Este problema se debe a las colas A agregadas por TdT, que no se pueden distinguir de las A codificadas por el genoma. Para conciliar este problema, usamos un algoritmo de recorte que elimina hasta un máximo de 3 T desde el inicio de la lectura. Dado que la longitud promedio de la cola es de 2 a 4 nucleótidos, esto mapea correctamente el SfiI escinde el sitio a los nucleótidos 7 a 9 en & gt98% de las lecturas, incluso cuando solo se consideran los sitios más difíciles para el mapeo (aquellos con la estructura GGCCNNNA | AGGCC) (Fig. 1D, parte inferior). Es importante destacar que este algoritmo no sobrepasa los extremos dentro de los tractos A codificados por el genoma de manera que los 10 SfiLos sitios I con 2 o más 3 'A (GGCCNNAA | NGGCC) se mapean con la misma precisión (S1D Fig). Sugerimos que esta precisión de mapeo global de & gt98% dentro de ± 1 nucleótido sería suficiente para casi todas las aplicaciones.

Una fortaleza importante de TrAEL-seq debería ser la capacidad de mapear sitios originales de DSB incluso después de la resección, un punto en el proceso de recombinación homóloga que es particularmente susceptible de estabilización mediante mutaciones que previenen la invasión de cadenas. Elegimos la meiosis como un sistema modelo in vivo para validar esto, ya que los patrones de DSB meióticos se han caracterizado muy bien. Los DSB meióticos formados por Spo11 son procesados ​​por Sae2, entre otros factores, antes de la resección, después de lo cual la invasión de la hebra en un cromosoma homólogo está mediada por Dmc1 [43, 44]. Por tanto, la pérdida de Sae2 estabiliza las DSB antes de la resección, mientras que la pérdida de Dmc1 estabiliza las DSB después de la resección y antes de la invasión de la hebra. TrAEL-seq para los extremos 3 'de los DSB resecados en dmc1Las células Δ 7 h después de la inducción de la meiosis revelaron un patrón de DSB muy similar al observado para los DSB no resecados en un sae2Δ mutante mapeado por S1-seq (una variante de BLESS específica para la recombinación meiótica) (Fig. 1E) [45]. Las réplicas técnicas de TrAEL-seq son altamente reproducibles en puntos calientes conocidos de escisión de Spo11 (R = 0,99) (Fig. S1E), y la cuantificación de estos puntos calientes por TrAEL-seq se correlaciona bien con S1-seq en sae2Δ células (R = 0,87) (Fig. 1F, izquierda) y secuenciación de oligonucleótidos Spo11 (R = 0,85) (Fig. S1F) [46,47]. De los 3,907 hotspots conocidos, TrAEL-seq detecta 3542 basado en un umbral de 2 SD por encima del fondo, que se encuentra entre S1-seq (2556) y la secuenciación de oligonucleótidos Spo11 (un método mucho más laborioso que forma el estándar de oro para meióticos Cartografía DSB, 3.784). La sensibilidad de TrAEL-seq es muy similar a CC-seq (un método especializado para extremos de ADN asociados a proteínas [19]), que detecta 3223 sitios con los mismos criterios. Esto muestra que TrAEL-seq mapea y cuantifica con precisión los sitios de DSB endógenos incluso después de la resección final. Es importante destacar que la recombinación meiótica es inusual en el sentido de que se conocen mutantes que estabilizan completamente los DSB, mientras que la estabilización de roturas posteriores a la resección es a menudo más práctica en otros sistemas.

En general, TrAEL-seq proporciona un método eficaz para detectar y cuantificar los DSB en todo el genoma incluso después de la resección final.

Mapeo de alta resolución de bifurcaciones de replicación estancadas por TrAEL-seq

Las bifurcaciones de replicación se bloquean en varios impedimentos durante la replicación del ADN y las bifurcaciones bloqueadas pueden sufrir reversión o escisión cuando la célula intenta reiniciar la replicación (Fig. 2A). La barrera de la horquilla de replicación (RFB) en el ADNr de la levadura en ciernes es un sistema clásico para los estudios del estancamiento de la horquilla de replicación, y es el resultado de que las horquillas de replicación encuentran la proteína Fob1 unida al ADN [48]. Fob1 se une justo corriente abajo del gen del ARN ribosómico 35S (ARNr) y evita el paso de horquillas de replicación que se mueven en contra de la dirección de la transcripción 35S que, de otro modo, se encontrarían de frente con la maquinaria de la ARN polimerasa I [49,50]. El RFB se ha estudiado intensamente como un modelo para las bifurcaciones de replicación estancadas que inician la recombinación y el reordenamiento del genoma [51,52], y en el RFB se ha informado de DSB que se cree que se derivan de la escisión en horquilla basándose tanto en la transferencia Southern como en la qDSB-seq (un BLESS -método de tipo para el mapeo de extremos de ADN bicatenario) [13, 53, 54].

(A) Vías de procesamiento potenciales de una bifurcación de replicación estancada. Es probable que el procesamiento de la hebra rezagada termine poco después del estancamiento, y al menos para la RFB de levadura, se sabe que se elimina el cebador de ARN de la hebra rezagada [55]. La bifurcación podría entonces someterse a una inversión de la bifurcación para producir una unión Holliday o cortarse en la hebra delantera o retrasada. Mientras que la escisión es irreversible y requiere un evento de recombinación para reiniciar la bifurcación de replicación, las bifurcaciones invertidas pueden volver a la estructura de la bifurcación de replicación normal mediante la migración de Holliday Junction (denominada migración HJ). Los extremos 3 'del ADN que se predice que son sustratos de TrAEL-seq están marcados con puntos verdes. El cebador de ARN en el fragmento de Okazaki en la estructura más a la izquierda se muestra en rojo. (B) Comparación de las señales RFB de ADNr de levadura en conjuntos de datos TrAEL-seq en comparación con qDSB-seq (acceso SRA: SRX5576747) [13] y GLOE-seq (accesiones SRA: SRX6436839 y SRX6436840) [40]. Las lecturas se cuantificaron en pasos de 1 nucleótido y se normalizaron a lecturas por millón mapeado. Los datos de qDSB-seq se obtuvieron a partir de células sincronizadas en fase S, todas las demás muestras proceden de poblaciones de células en fase logarítmica asincrónicas que crecen en medios YPD. El diagrama esquemático muestra las posiciones de los elementos RFB mapeados previamente por electroforesis en gel 2D [49,50], y los triángulos negros indican los sitios mapeados previamente de los extremos del ADN [53,55]. (C) rDNA TrAEL-seq lee en hESCs. Se muestran dos réplicas biológicas, cada una con un promedio de 2 réplicas técnicas. Las lecturas se sumaron en ventanas corredizas de 100 pb espaciadas cada 10 pb. Se muestra una repetición de ADNr, el ARN 45S transcrito por ARN polimerasa I se muestra como una línea gris con ARNr maduros marcados en verde en el diagrama esquemático. Tenga en cuenta que el gen 45S se muestra como transcrito de derecha a izquierda para mantener la coherencia con los datos de la levadura, de modo que la secuencia es el complemento inverso de la secuencia de referencia de rDNA U13369. Las repeticiones R, que contienen los RFB, están marcadas en verde, mientras que la dirección principal de replicación se muestra con una flecha roja etiquetada como "¿Replicación?" tener en cuenta la evidencia de que las bifurcaciones pueden moverse en ambas direcciones a través del ADNr humano. (D) Perfiles promedio de TrAEL-seq a través de centrómeros +/− 1 kb para 3 réplicas biológicas de células de tipo salvaje (dibujadas en rojo, naranja y morado). Los centrómeros se clasifican según la dirección de replicación en el ensamblaje del genoma de la levadura en aquellos replicados hacia adelante (CEN3, CEN5, CEN13, CEN2), hacia atrás (CEN11, CEN15, CEN10, CEN8, CEN12, CEN9) y aquellos en zonas de terminación que podrían replicarse en cualquier dirección (CEN14, CEN16, CEN1, CEN4, CEN7, CEN6), consulte la Fig. S2C para obtener más detalles. Los recuentos de lecturas por millón de lecturas mapeadas se calcularon en contenedores de 10 pb no superpuestos, las líneas verticales indican los límites anotados de los centrómeros. (mi) Perfiles promedio de TrAEL-seq a través de tRNAs +/− 200 bp para 3 réplicas biológicas de células de tipo salvaje (dibujadas en rojo, naranja y violeta). Los ARNt se clasifican en aquellos para los que la transcripción es codireccional con la bifurcación de replicación y aquellos para los que la transcripción va de frente en la dirección de la bifurcación de replicación. Se excluyeron los ARNt para los que la dirección de replicación no está bien definida. Las flechas indican picos que dependen de la dirección de replicación. Los recuentos de lecturas por millón de lecturas mapeadas se calcularon en contenedores de 5 pb no superpuestos, las líneas verticales indican los límites anotados de los ARNt. Los datos numéricos subyacentes a esta figura se pueden encontrar en S2 Data. hESC, RFB de células madre embrionarias humanas, ARNr de barrera de horquilla de replicación, ARN ribosómico TrAEL-seq, secuenciación de ligadura de extremos activada por transferasa.

Para detectar las bifurcaciones de replicación estancadas en el RFB y probar el requisito de recombinación homóloga en la resolución de estas especies, preparamos bibliotecas TrAEL-seq de tipo salvaje no sincronizado, fob1Δ y rad52Células Δ que crecen a mitad de la fase logarítmica: fob1Las células Δ carecen de actividad RFB, mientras que rad52Los mutantes Δ no pueden iniciar la recombinación homóloga. Por lo tanto, las señales RFB deben estar ausentes fob1Δ, mientras que las señales que representan los DSB formados por la división de la horquilla deben acumularse en rad52Δ ya que este mutante no puede reparar tales roturas de ADN una vez formadas.

Dos sitios RFB son claramente visibles en los datos de TrAEL-seq de tipo salvaje como picos de lecturas de hebra inversa, pero están ausentes en la fob1Δ mutante (Fig 2B, tipo salvaje y fob1Δ paneles). Estos picos se reproducen exactamente entre 2 bibliotecas preparadas independientemente de las mismas células fijadas (por diferentes investigadores que trabajan con 6 meses de diferencia, figura S2A) y se detectan con una alta relación señal-ruido en 3 réplicas biológicas de tipo salvaje (figura S2B). Estos sitios se corresponden bien con los sitios de RFB mapeados utilizando geles de alta resolución [53,55] y también son visibles en los conjuntos de datos qDSB-seq y GLOE-seq publicados, aunque los datos de TrAEL-seq contienen menos picos adicionales en esta región que GLOE-seq los datos y los picos de RFB se corresponden más estrechamente con los sitios conocidos que los picos de qDSB-seq (Fig. 2B) [13,40].

Para determinar la aplicabilidad de TrAEL-seq a células de mamíferos, generamos 2 conjuntos de datos de TrAEL-seq cada uno a partir de 2 bibliotecas de réplicas biológicas de 0,5 millones de células madre embrionarias humanas (hESC). Se observó un pico importante en el ADNr aguas abajo del sitio de terminación de la ARN polimerasa I en ambas réplicas biológicas de hESC, en la hebra inversa ubicada en el más distal de los sitios RFB conocidos (Fig. 2C) [56]. Esta observación es consistente con un RFB polar eficiente ubicado justo debajo de la unidad de transcripción de la ARN polimerasa I, como se observa en diversas especies, desde plantas hasta levaduras y ratones [49,57-60]. Además, detectamos picos más pequeños pero reproducibles en ambas cadenas en los 3 sitios de RFB, en consonancia con la actividad de RFB bidireccional de baja eficiencia que se ha informado en células humanas basadas en geles 2D y combinación de ADN (Fig 2C) [56,61,62]. .

Los RFB de ADNr no son los únicos sitios en los que las bifurcaciones de replicación se estancan, por ejemplo, los picos de GLOE-seq informados en los centrómeros de levadura probablemente provienen de las bifurcaciones de replicación que se estancan en la cromatina centromérica [40,63]. Para probar esta relación, primero estratificamos los centrómeros en aquellos replicados solo por bifurcaciones inversas, aquellos replicados solo por bifurcaciones directas y aquellos ubicados en zonas de terminación donde convergen las bifurcaciones (Fig. S2C). En los centrómeros replicados desde una sola dirección, observamos una acumulación de lecturas en la hebra opuesta a la dirección de replicación ubicada justo antes del centrómero, mientras que las bifurcaciones en las zonas de terminación que se pueden replicar en cualquier dirección muestran ambos picos (Fig. 2D y Archivo S1 ). Un análisis similar de los loci de tRNA, que también se sabe que detienen las horquillas de replicación [64], arrojó patrones más complejos (Fig. 2E).Estas regiones mostraron picos aguas arriba o aguas abajo del tRNA dependiendo de la dirección de replicación (Fig 2E, flechas), de acuerdo con estudios previos que informaron que la transcripción del tRNA tanto codireccional como frontal puede detener las horquillas de replicación, al menos en ausencia de helicasas replicativas. [64–67]. Sin embargo, también observamos un pico importante que cubre los primeros aproximadamente 15 pb del gen tRNA, que no se vio afectado por la dirección de replicación y parece marcar una ruptura asociada a la transcripción en la hebra molde que debe ser una característica conservada de la transcripción del tRNA, ya que también se detecta en las muestras de hESC (Fig. S2D). Aparte de esto, encontramos que los sitios de replicación que se estancan en la horquilla tanto en el RFB como en otros sitios son revelados por una acumulación de lecturas de TrAEL-seq en la hebra opuesta a la dirección de replicación.

Las estructuras resultantes del procesamiento de horquillas estancadas tienen varios extremos 3 'de doble hebra que deberían ser sustratos para TrAEL-seq según nuestro análisis de enzimas de restricción (Figuras 1C y 2A, puntos verdes). Sin embargo, no se observó diferencia en la intensidad de la señal entre rad52Δ y tipo salvaje en el ADNr, centrómeros o ARNt, lo que muestra que estos extremos bicatenarios no son procesados ​​normalmente por la maquinaria de recombinación homóloga (Fig. 2B, S2E y Fig. S2F). Se sabe que los DSB formados en el ADNr se reparan mediante recombinación homóloga, y aunque nosotros y otros hemos informado de una recombinación independiente de Rad52 en el ADNr, estos son eventos poco frecuentes desconocidos en las células de tipo salvaje [68-70]. Si los picos de TrAEL-seq representaran eventos de división de horquilla, esperaríamos una fuerte estabilización en el rad52Δ mutante. Entonces, en base a la falta de estabilización observada, consideramos que la gran mayoría de los extremos de ADN en los sitios de bloqueo de la horquilla de replicación representan horquillas invertidas que pueden revertir a las estructuras de horquilla de replicación normales mediante la migración de Holliday Junction sin recombinación (ver Fig 2A y Discusión).

En conjunto, estos resultados muestran que TrAEL-seq permite un mapeo sensible y preciso del estancamiento de la bifurcación de replicación, muy probablemente a través del etiquetado de las bifurcaciones de replicación invertidas.

Los perfiles de TrAEL-seq describen la direccionalidad de la horquilla de replicación

Una característica sorprendente de los datos de TrAEL-seq de levadura es la variación masiva en el sesgo de hebra de lecturas en diferentes sitios del genoma: un gráfico de violín de la fracción de lecturas inversas en contenedores de 1 kb muestra 2 picos distintos en 15% a 30% y 70 % a 85%, un comportamiento mucho menos obvio en datos comparables GLOE-seq (Fig. 3A) [40]. La polaridad de lectura de TrAEL-seq en células asincrónicas de tipo salvaje (calculada a partir de la diferencia entre las densidades de lectura inversa y directa) forma dominios claros cuando se representa en grandes regiones genómicas que coinciden casi perfectamente con el mapa de GLOE-seq de los extremos del fragmento de Okazaki en una ligasa de ADN Cdc9 experimento de agotamiento, aunque con la polaridad opuesta (Fig. 3B y Fig. S3A) [40]. El mapeo de los extremos de los fragmentos de Okazaki es un método bien validado para detectar las bifurcaciones de replicación [35,36], y la estrecha correlación de los datos de TrAEL-seq con la distribución de los fragmentos de Okazaki sugiere fuertemente que TrAEL-seq detecta las bifurcaciones de replicación procesiva incluso en células de tipo salvaje . De hecho, las ubicaciones en las que la polaridad de TrAEL-seq cambia de negativo a positivo coinciden precisamente con los orígenes de replicación (secuencia de replicación autónoma o elementos ARS) (Fig. 3B, líneas verticales punteadas), y la alineación de TrAEL-seq lee 30 kb a cada lado de todos los elementos ARS revelan un cambio en la polaridad como se esperaría para las horquillas de replicación que divergen de los orígenes de replicación (Fig. 3C). Además, las lecturas de TrAEL-seq en el rDNA reflejan el papel conocido de Fob1 en hacer cumplir la replicación unidireccional del rDNA, ya que las lecturas están altamente polarizadas en las células de tipo salvaje, pero esta polarización está ausente en fob1Δ (Figura S3B).

(A) La polaridad de las lecturas de TrAEL-seq y GLOE-seq evaluadas en ventanas de 1 kb en todo el genoma, excluyendo las ventanas que se superponen a las regiones de múltiples copias, se presenta como el porcentaje de lecturas totales que se asignan a la hebra inversa. La línea de puntos marca el 50%, lo que equivale a una ausencia de sesgo de hebra. Las bibliotecas de TrAEL-seq son 3 réplicas biológicas de BY4741 de tipo salvaje. Las muestras de tipo salvaje GLOE-seq (accesiones SRA: SRX6436839 y SRX6436840) se derivaron de células asincrónicas en fase logarítmica que crecían en YPD, al igual que las muestras de TrAEL-seq. los cdc9 El conjunto de datos es de células sincronizadas agotadas de la ADN ligasa Cdc9 (acceso SRA: SRX6436838). (B) Lea los gráficos de polaridad para el crecimiento de tipo salvaje de TrAEL-seq BY4741 en la fase logarítmica en los datos de agotamiento de YPD y GLOE-seq Cdc9 (acceso de SRA: SRX6436838) en el cromosoma V, calculado como (R − F) / (R + F) donde R y F indica lecturas hacia atrás y hacia adelante, respectivamente. Los datos de TrAEL-seq son un promedio de 2 réplicas técnicas. La polaridad de lectura se calculó para ventanas deslizantes de 1000 pb espaciadas cada 100 pb para todas las regiones de copia única, los espacios cercanos a 450 kb y 500 kb son elementos Ty. Las líneas de puntos verticales muestran la ubicación de los elementos ARS. Tenga en cuenta que el eje de polaridad de lectura del cdc9 Los datos se invierten para facilitar la comparación con TrAEL-seq, ya que cdc9 la mutación se enriquece para los extremos 3 'de la hebra rezagada, mientras que TrAEL-seq detecta el extremo 3' de la hebra principal. (C) Polaridad de lectura promedio de los conjuntos de datos TrAEL-seq y GLOE-seq en ventanas de 30 kb a ambos lados de los elementos ARS anotados. Calculado como el porcentaje de lecturas inversas entre todas las lecturas. Las muestras son como en A. (D) Profundidad de lectura absoluta de TrAEL-seq en lecturas por millón mapeado independientemente de la polaridad de lectura, para la misma muestra que se muestra en B. La profundidad de lectura es ampliamente uniforme en todo el genoma de copia única, excepto por un pico en el centrómero (como en la figura 2D) y caídas en cada ARS activo. (mi) Señales de TrAEL-seq en células de tipo salvaje detenidas en G1 (arriba) o liberadas en S (abajo). Los recuentos de lecturas por millón de lecturas mapeadas se calcularon para ventanas deslizantes de 1000 pb espaciadas cada 100 pb para todas las regiones de copia única, y las cadenas se muestran por separado para revelar tanto el recuento absoluto de lecturas como la polaridad de lectura en cada punto: la distribución de la polaridad de lectura en el cromosoma para celdas de fase S es equivalente a la Fig. 3B. Para permitir la comparación de recuentos de lectura entre 2 muestras, las muestras G1 y G1- & gtS se ligaron a variantes del adaptador 1 de TrAEL que llevaban 2 códigos de barras diferentes. Luego, estas muestras se agruparon, procesaron y secuenciaron juntas para mantener los recuentos de lecturas relativas entre las muestras, y la normalización para cada muestra fue la lectura total mapeada en ambas bibliotecas. Para garantizar que los diferentes códigos de barras del adaptador no afectaran el resultado, se realizaron 2 réplicas técnicas para cada muestra emparejada de G1 y G1- & gtS con los adaptadores de códigos de barras invertidos. Los datos mostrados son un promedio de las réplicas técnicas, pero se observó poca diferencia en la cuantificación relativa de la biblioteca que podría atribuirse a los códigos de barras. Se muestran dos réplicas biológicas del experimento en rojo y azul. (F) Intensidad y reproducibilidad de la polaridad de lectura entre los conjuntos de datos TrAEL-seq y GLOE-seq. La polaridad de lectura se calculó en ventanas de 1000 pb espaciadas cada 1000 pb y se muestra como líneas continuas. Tres conjuntos de datos biológicos replicados para TrAEL-seq de tipo salvaje se representan en el gráfico superior y muestran los mismos perfiles de replicación. En el gráfico inferior se superponen dos conjuntos de datos GLOE-seq de tipo salvaje (accesiones SRA: SRX6436839 y SRX6436840). Los conjuntos de datos TrAEL-seq y GLOE-seq derivan de cultivos asincrónicos recolectados durante la fase logarítmica de crecimiento en YPD [40]. Las líneas de puntos verticales muestran la ubicación de los elementos ARS. (GRAMO) Lea el diagrama de polaridad como en A para 2 réplicas biológicas de los conjuntos de datos de TrAEL-seq de tipo salvaje BY4741 en comparación con los mutantes de RNasa H2 rnh201Δ y rnh202Δ y a la topoisomerasa I mutante top1Δ. (H) Lea los gráficos de polaridad de los datos de TrAEL-seq para las hESC asincrónicas de tipo salvaje, se muestran 2 réplicas biológicas cada una con un promedio de 2 réplicas técnicas. Los datos de GLOE-seq de células HCT116 empobrecidas en LIG1 (promedio de accesiones de SRA: SRX7704535 y SRX7704534) se muestran a modo de comparación. La polaridad de lectura se calculó en ventanas correderas de 250 kb espaciadas cada 10 kb. Tenga en cuenta que la polaridad de los datos del HCT116 se ha invertido para facilitar la comparación con las muestras de TrAEL-seq, esto se resalta con la escala etiquetada en rojo. Los perfiles son muy similares entre los 2 tipos de células, pero algunos orígenes solo están activos en los ejemplos de hESC que se indican con flechas verdes. Los datos numéricos que subyacen a esta figura se pueden encontrar en S3 Data. ARS, secuencia de replicación autónoma hESC, TrAEL-seq de células madre embrionarias humanas, secuenciación de ligadura de extremos activada por transferasa.

La densidad de lectura absoluta de TrAEL-seq es en gran medida uniforme en todo el genoma de copia única, excepto por caídas pronunciadas en cada ARS (Fig. 3D), lo que sugiere que las señales de TrAEL-seq se derivan principalmente de horquillas de replicación activas con poco ruido subyacente. Si es así, las señales de TrAEL-seq deberían variar a lo largo del ciclo celular. Sin embargo, al igual que con otros métodos de secuenciación, la comparación cuantitativa de la señal de TrAEL-seq total entre bibliotecas no es sencilla, ya que no existe una relación entre el recuento total de lecturas en una biblioteca y la cantidad de sustrato en la muestra original. Para permitir tales comparaciones, modificamos la canalización de TrAEL-seq de modo que 2 muestras se codifiquen con barras en una etapa temprana y luego se agrupen para su procesamiento, secuenciación y posprocesamiento como una sola muestra. Este enfoque mantiene la relación absoluta de sustrato entre las 2 muestras, lo que permite una comparación cuantitativa.

Aplicamos este método para comparar las células detenidas en G1 usando factor α con las células del mismo cultivo después de la liberación en la fase S. Se ligaron dos variantes del adaptador 1 de TrAEL-seq con códigos de barras únicos a las muestras G1 y G1- & gtS que luego se combinaron, y en cada experimento, realizamos 2 réplicas técnicas con los códigos de barras intercambiados para asegurar que no surgieran diferencias cuantitativas de los adaptadores ellos mismos. Dos experimentos biológicos replicados produjeron resultados esencialmente idénticos, siendo el recuento de lectura de TrAEL-seq en las regiones de copia única dramáticamente más alto en las muestras G1- & gtS que en las muestras detenidas en G1. Para ilustrar tanto la cantidad absoluta de lectura como el sesgo de la hebra, representamos los recuentos de lectura en las hebras directas e inversas por separado en el cromosoma V (Fig 3E) Las muestras de fase S muestran señales fuertes que se modifican entre las lecturas directas e inversas en el cromosoma, mientras que las señales de G1 las células son casi indetectables. Además, la fase entre avance y retroceso coincide con la variación de polaridad de lectura de muestras no sincronizadas (compare las Fig. 3B y 3E). Este experimento muestra que las señales de TrAEL-seq surgen principalmente de las horquillas de replicación de ADN activas y son muy bajas en las células que no se replican.

La fase de la polaridad de lectura también se observó en muestras de tipo salvaje perfiladas por GLOE-seq pero solo débilmente, mientras que las bibliotecas de TrAEL-seq muestran diferencias de polaridad de lectura muy fuertes que son altamente reproducibles y producen perfiles de replicación esencialmente idénticos (Fig. 3A y 3E, S3C Fig. ) [40]. Como Sriramachandran y sus colegas señalaron para GLOE-seq [40], la polaridad de lectura de esta señal de replicación es opuesta a lo que se esperaría del etiquetado de los extremos 3 'en bifurcaciones normales. Nunca debe haber menos extremos 3 'en la hebra retrasada que en la hebra principal, sin embargo, hasta el 90% de las lecturas de TrAEL-seq emanan de la hebra principal. Para explicar la señal GLOE-seq, Sriramachandran y sus colegas sugirieron que GLOE-seq marque los sitios en los que se corta el ADN durante la eliminación de ribonucleótidos mal incorporados [40]. Para probar esta idea, generamos bibliotecas TrAEL-seq a partir de rnh201Δ y rnh202Δ mutantes que carecen de componentes clave de la RNasa H2, la principal enzima que escinde el ADN en los ribonucleótidos mal incorporados, junto con un control de tipo salvaje [71,72]. Sorprendentemente, la polaridad de lectura en estos mutantes es equivalente al tipo salvaje, lo que muestra que el sesgo de la cadena principal de las lecturas de TrAEL-seq no es causado por la RNasa H2 y, por lo tanto, es poco probable que surja a través de la escisión de ribonucleótidos mal incorporados (Fig. 3G y Fig. S3D). También es posible que las señales de TrAEL-seq (y de hecho GLOE-seq) surjan cuando la maquinaria de replicación encuentra complejos de escisión de Top1 [73], pero no vimos una reducción en la polaridad de TrAEL-seq o la señal en top1Células Δ (Fig. 3G y Fig. S3D). Una observación adicional a este respecto es que los datos de END-seq muestran un sesgo de polaridad, aunque débil, que es paralelo al sesgo de polaridad en los datos de TrAEL-seq generados a partir de las mismas celdas (figura S3E). Esto sugiere que los extremos bicatenarios también se forman durante la replicación normal, aunque estas señales débiles también podrían surgir a través de la escisión de las delicadas regiones monocatenarias de las horquillas de replicación durante el procesamiento.

Luego preguntamos si se observa un sesgo de cadena equivalente en las bibliotecas de hESC. La cobertura de lectura limitada en estas bibliotecas solo permitió determinar la polaridad de lectura en ventanas de 250 kb, pero no obstante, se observó una variación sorprendente en todo el genoma (Fig. 3H). Es importante destacar que estos perfiles fueron muy similares entre las réplicas técnicas y biológicas y, por lo tanto, no pueden ser simplemente el resultado del ruido, esto se puede observar en regiones genómicas definidas, pero también es claro en un diagrama de dispersión que muestra que la polaridad de lectura promedio dentro de cada ventana se correlaciona entre los conjuntos de datos ( R = 0.84, S3F y S3G Fig). Además, la comparación con los resultados de GLOE-seq de una línea celular humana empobrecida en LIG1 que es defectuosa en la ligadura del fragmento Okazaki nuevamente reveló una sorprendente similitud con los datos de hESC TrAEL-seq, aunque con la polaridad opuesta (Fig. 3H y Fig. S3H) [40 ]. Curiosamente, un subconjunto de orígenes se detectó de forma reproducible en muestras de hESC pero ausente en los datos de HCT116, lo que es consistente con la evidencia de que el uso del origen difiere entre estas líneas celulares (Fig. 3H, flechas verdes) [24].

Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que TrAEL-seq detecta principalmente bifurcaciones de replicación procesiva y lo hace con una relación señal-ruido excepcionalmente alta. Los perfiles de TrAEL-seq son altamente reproducibles y se pueden obtener a partir de células de tipo salvaje sin necesidad de sincronización, clasificación o etiquetado de células. Los extremos 3 ′ detectados por TrAEL-seq corresponden a la hebra principal en lugar de la hebra retrasada, a pesar del hecho de que ocurren muchos más extremos 3 ′ en la hebra retrasada, y sugerimos que estos extremos 3 ′ están expuestos por la inversión de la horquilla de replicación que ocurre ya sea in vivo o durante el procesamiento de la muestra (ver Discusión).

Impactos ambientales en el tiempo de replicación y la progresión de la bifurcación

Finalmente, preguntamos si TrAEL-seq puede revelar cambios en la replicación o daños en el ADN y, en particular, si podemos detectar colisiones entre las maquinarias de transcripción y replicación.

Dado que todas las bibliotecas de levadura generadas hasta este punto habían producido perfiles de replicación de ADN esencialmente idénticos fuera del ADNr, en primer lugar queríamos asegurarnos de que los cambios en el perfil de replicación fueran realmente detectables. Por lo tanto, examinamos las células que carecen de Clb5, una ciclina B de levadura que desempeña un papel clave en la activación de las horquillas de replicación de activación tardía [74]. El perfil TrAEL-seq de clb5Δ era muy similar al tipo salvaje en la mayor parte del genoma, pero ciertos orígenes estaban claramente ausentes o fuertemente reprimidos, lo que resultó en extensiones extendidas de síntesis de ADN de orígenes adyacentes visibles como regiones de polaridad muy diferente (Fig 4A, flechas verdes, Fig S4A) . Esto es como se predijo para clb5Δ mutantes y confirma que TrAEL-seq es de hecho sensible a cambios en el perfil de replicación.


Ver el vídeo: Ejercicio: Transcripción de una cadena de ADN a ARNm (Agosto 2022).