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Trozos de células después de la tripsinización

Trozos de células después de la tripsinización



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Recientemente me encontré con un problema después de la tripsinización de mis células CHO transfectadas de manera estable. Cuando agrego medio para enjuagar las células del fondo del matraz, generalmente hay grandes trozos de células, que casi no puedo resuspender correctamente ... También intenté aumentar el tiempo de incubación con tripsina, pero no ayudó mucho.

¿Alguien tiene una solución para esto? La tripsina que uso es el mismo lote que de costumbre y, mientras tanto, también descongelé 2 caldos de congelación diferentes, pero todavía tengo el mismo problema.

También probé diferentes pipetas, de 25 a 5 ml. Pero puedo pipetear como un loco arriba y abajo y arriba y abajo ... todavía hay grandes trozos de células flotando ...


Gibco tiene un agente anti-aglutinante verificado para células CHO, al igual que Lonza, pero a mí me gustan más los reactivos de Gibco. Las células tienden a agruparse por varias razones, incluido el ADN extracelular de las células lisadas y la presencia de iones Ca y Mg (iones importantes para la adhesión y agregación celular).

Podrías probar estos:

1) Lavar y resuspender en una solución salina balanceada. sin magnesio o calcio. Como la solución salina equilibrada de Hank.

o

2) Trátelo con DNasa I. Creo que podría reducirse a 1 UI / ml durante 30 min-1 h para eliminar una buena cantidad de acumulación de ADN. Puede hacer esto en un medio basal (como RPMI, DMEM, etc.) o en la solución salina balanceada. Tu medio puede contener suero sólo si el suero ha sido inactivado por calor como proteasas en el suero con inactivar su DNasa. Incubar con DNasa con agitación suave a 37 ° C (siempre tuve un rotador de tubos en una incubadora para este propósito, simplemente coloque sus células en una cónica de 50 ml y déjelas agitar durante 1 hora. También puede usar una unidad agitadora calentada). Si no tiene esta configuración, puede agitar a temperatura ambiente, pero quizás por un poco más de tiempo.

y tal vez

3) Una de las otras opciones obvias es evitar pasar las células aglutinadas y recolectar el resto. Puede hacer esto poniendo todas sus células en un matraz incl. los grumos, agite por un momento y déjelo reposar para que los pedazos caigan rápidamente al fondo y recojan todo pero las cosas que cayeron al fondo.


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Factores de crecimiento

La carne cultivada en laboratorio a partir de cultivos de tejidos de células animales es sostenible, utilizando células sin matar al ganado, con menor uso de la tierra y menor huella hídrica. Los científicos japoneses lograron cultivar trozos de carne, utilizando estimulación eléctrica para provocar la contracción de las células musculares para imitar la textura del bistec.

¡Bienvenido a r / science! Este es un subreddit muy moderado para mantener la discusión sobre ciencia. Sin embargo, reconocemos que muchas personas quieren discutir cómo sienten que la investigación se relaciona con sus propias vidas personales, para darle a las personas un espacio para hacerlo, Ahora se permiten anécdotas personales como respuestas a este comentario.. Cualquier comentario anecdótico en otra parte de la discusión continuará siendo eliminado y nuestras reglas de comentarios normales aún se aplican a otros comentarios.

Soy un bot y esta acción se realizó automáticamente. Por favor contacta a los moderadores de este subreddit si tiene alguna pregunta o inquietud.

Me pregunto: ¿la carne cultivada en laboratorio elimina el argumento ético para los vegetarianos?

Quiero escuchar ese debate.

Como vegano, creo que la respuesta tiene que ser "Sí, se ha eliminado el problema ético".

Aprecio que inicialmente se requiera una biopsia de algún tipo, pero supongo que una vez que se haya tomado la primera muestra de tejido, puede continuar usándose casi indefinidamente.

Entonces, aunque supongo que todavía hay daño animal al principio, esto es realmente insignificante en la plenitud del tiempo, especialmente cuando se equilibra con los beneficios que aporta.

Los veganos no ignoran, o al menos no deberían ignorar, que una gran cantidad de insectos, ratones, etc. mueren en la producción de cultivos ordinarios, lo cual es inevitable y aceptado. La mayoría de los argumentos racionales de la ética animal no se refieren a la abolición completa del sufrimiento animal, sino a evitarlo cuando sea posible.

Depende de lo que quiera decir con "el" argumento ético, porque existen múltiples razones éticas para reducir o eliminar el consumo de carne.

Probablemente esto se pregunte mucho más por los no vegetarianos que por los vegetarianos.

He escuchado a un vegano decir que no.

He escuchado a otro decir: "Sí, siempre que no tenga el mismo impacto ambiental".

Algunos podrían argumentar que todavía es dañino para los animales debido a las condiciones en las que se crían o si se usa una biopsia viva para obtener las células animales, pero presumiblemente podrían recolectar células animales sin dañar a los animales y sin matarlos, así que lo estoy. Seguro que muchos vegetarianos estarían de acuerdo con esto. Simplemente no todos.

Creo que es importante entender que los vegetarianos no son un solo pueblo. Me volvería loco por estas cosas, pero conozco gente vegetariana que no lo haría & # x27t.

De aquellos con los que he hablado, no tienen ningún problema con eso. Lo único que mencionan es cómo se obtienen las células iniciales, lo cual es bastante justo.

Si. Aunque para mí como verduras porque creo que saben mejor

Soy un poco vegetariano, pero no por las razones habituales. Soy judío y me mantengo kosher. La carne kosher es tan increíblemente cara que en realidad es más barato ser vegetariano que comprar carne kosher. (Especialmente durante la pandemia cuando estoy limitando la cantidad de tiendas en las que compro, ya que no todas las tiendas venden carne kosher).

Tendría curiosidad por saber si esta carne se considera kosher. Por lo general, hay reglas estrictas que deben seguirse, desde cómo se cría el animal hasta su salud y cómo se sacrifica. La mayoría de estos puntos discutibles cuando se trata de carne cultivada en laboratorio. Suponiendo que la vaca original se crió adecuadamente y en buen estado de salud, ¿sería buena toda la línea de carne? Obviamente, no habría ninguna enfermedad de la que preocuparse. (Los contaminantes se mantendrían fuera del entorno de cultivo). Además, el sacrificio no sería un problema, ya que no es realmente un factor de calidad de la misma manera que lo es una vaca. Sería interesante ver si esto hace que la carne kosher sea realmente económica.


Trozos de células después de la tripsinización - Biología

Aislamiento de células endoteliales de pulmón de ratón (MLEC) / Células endoteliales de corazón de ratón (MHEC)

  • Matraces T-75 recubiertos con fibronectina preparados humedeciendo durante & gt1 h. con 2 ml de FN humana (Gibco nº 33016-015, 2,5 ug / ml, filtrado estéril, PBS, $ 0,20 / matraz). Un T-75 para dos ratones y para cada paso.
  • También se pueden usar matraces recubiertos de gelatina al 0,1% para plaquear las células. (No utilice
    gelatina si las células se utilizan para experimentos de cromatografía en columna. Hemos encontrado que la gelatina obstruye las columnas).
  • Medio de aislamiento = DMEM de glucosa alta + FCS al 20% + Pen / Strep.
  • Medio de crecimiento = igual + 100 ug / ml de heparina (Sigma H-3933) + 100 ug / ml
    ECGS (Biomedical Technologies, Stoughton, MA, Cat # BT-203) + 1x aminoácidos no esenciales + L-glutamina 2 mM + 1x piruvato sódico + HEPES 25 mM.
  • Instrumentos para disección animal (esterilizados en EtOH al 70%): dos tijeras, dos pinzas.
  • Instrumentos para la disociación de tejidos (esterilizados en autoclave): pinzas pequeñas, tijeras pequeñas y cánula de metal de calibre 14 de 6 pulgadas de largo (Fisher n. ° 1482516N) y colador de células B-D Falcon de 70um de tamaño de poro (Fisher n. ° 08-771-2).
  • Colagenasa de tipo I (Worthington) de Core, disuelta 2 mg / ml (150-170 U / mg) en 25 ml de DPBS + Ca / Mg & rarr caliente a 37 C, 1 h. & rarr 0.22 um Filtro estéril.
  • Dynabeads M-450 Oveja anti-IgG de rata (Dynal # 110.07) en PBS + 0.1% BSA + 0.02% NaN3. Concentración: 4 x 108 perlas / mL.
  • Anticuerpo purificado de rata anti-CD102 de ratón (ICAM-2) (Pharmingen # 553325), 1 mg / 1 ml.
  • Anticuerpo purificado de rata anti-CD31 de ratón (PECAM-1, clon MEC13.3) (Pharmingen nº 553369), 0,5 mg / 1 ml.
  • DPBS- sin Ca 2+ y Mg 2+

    Preparación de Dynabeads anti-ratón ICAM-2 (PECAM-1):

  1. Resuspender y alícuota de perlas en 2 mL de PBS + 0.1% BSA. Mezclar bien.
  2. Coloque el tubo en un separador magnético (por ejemplo, Dynal MPC-S) y déjelo durante 1-2 minutos.
  3. Retire el sobrenadante y repita el lavado 3 veces.
  4. Resuspender las perlas al volumen original con PBS + BSA al 0,1%.
  5. Agregue 5 uL de Ab purificado por cada 100 uL de perlas.
  6. Incubar durante la noche en rotador a 4 ° C (o 2 horas a temperatura ambiente).
  7. Repita el lavado como en los Pasos 1 y 3 (4x).
  8. Resuspenda las perlas en el volumen original con PBS + BSA al 0,1% para mantener las perlas a 4x10 8 perlas / ml.
  9. Almacene las perlas a 4 ° C y utilícelas dentro de 1 a 2 semanas.
  10. Se puede agregar azida de sodio al 0.02% como conservante, pero recuerde lavarse bien antes de usar.

  1. Sacrificar un ratón adulto joven por CO2 inhalación.
  2. Remoje la piel con EtOH al 70%.
  3. Corte la piel por encima del pubis con unas tijeras y quite los guantes por encima del pecho.
  4. Sujete el ratón en decúbito supino sobre una tabla de poliestireno en la parte superior de un banco. Quite cualquier pelaje suelto de los guantes o del campo.
  5. Corte el abdomen anterior abierto y baje el diafragma anterior con unas tijeras esterilizadas.
  6. Agarre los lóbulos del pulmón y el corazón y corte el mediastino (con un nuevo juego de tijeras y pinzas).
  7. Coloque los lóbulos / corazón en 15 ml de medio de aislamiento frío en un plato de 10 cm.
  8. Repita los pasos 1 y 7 con un segundo mouse. Combine los lóbulos de dos ratones.

  1. Transfiera el plato con los lóbulos pulmonares a una campana de flujo laminar estéril para el trabajo posterior.
  2. Con nuevas tijeras estériles, corte el corazón (con cuidado de evitar la mayor parte de la aorta posible). Corte el corazón por la mitad y colóquelo en un tubo de 50 ml que contenga 40 ml de medio de aislamiento frío. Agite suavemente.
  3. Luego, corte con cuidado los lóbulos pulmonares de cualquier bronquio visible y tejido conectivo mediastínico.
  4. Poner los lóbulos de los pulmones en un plato seco de 10 cm y picar finamente con unas tijeras durante 1 min.
    (Repita para el corazón en un plato aparte).
  5. Coloque los trozos de pulmón en 25 ml de colagenasa precalentada a 37 ° C (2 mg / ml). Lave todos los trozos del plato. (Repita lo mismo para el corazón).
  6. Incubar a 37 ° C con agitación suave durante 45 min. (baño de agua con agitación o inversión en un horno híbrido).
  7. Con una jeringa de 30 cc fijada firmemente a la cánula, triturar la suspensión 12 veces, teniendo cuidado de evitar la formación de espuma.
  8. Deje que los trozos se asienten. Pipetee la suspensión a través de un colador de células desechable de 70um (Falcon # 35 2350) en un tubo cónico de 50 ml. Lavar el tamiz con 10 ml de medio.
  9. Centrifugar la suspensión celular a 400 g (1300 rpm en rotor GH3.7), 8 min., 4 ° C.
  10. Resuspenda en 2 ml de PBS frío + BSA al 0,1%. Deje los grumos rebeldes.
  11. Cuente las células nucleadas (por ejemplo, cuente en un contador Coulter agregando 5 uL de suspensión a 10 ml de tampón isotónico + 3 gotas de Zap-globina).

  1. Resuspenda las células cardíacas en 1 ml de DPBS- y las células pulmonares en 2 ml de DPBS-. (Pulmón y ndash 1 ml / ratón, Corazón y ndash 1 ml / 2 ratones, 2 ml / 3 ratones).
  2. Transfiera a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml. Agregue Anti-mouse PECAM-1 Dynabeads (preparado en la Sección A) a la suspensión de células a 15 ul de perlas / mL de suspensión de células.
  3. Incubar en un rotador, RT, 10 min.
  4. Monte el tubo en un separador magnético (por ejemplo, Dynal MPC-S) y déjelo durante 1-2 minutos.
  5. Retire el sobrenadante. Las perlas + células deben verse algo espumosas si hay un buen rendimiento de selección positiva.
  6. Retire el tubo del separador magnético y resuspenda las perlas + células en 3 ml de medio mediante una trituración vigorosa. A menos que sea vigoroso, obtendrá muchas células contaminantes. (Más relevante para los MLEC)
  7. Montar en separador magnético durante 1-2 min.
  8. Repita los pasos 5-7 hasta que el sobrenadante esté claro (generalmente 4-5 lavados).
  9. Resuspender en medio de crecimiento y placa de perlas + células en un matraz T75 recubierto de gelatina para pulmones y un matraz T75 recubierto de gelatina para corazón.
  10. Al día siguiente, enjuague el matraz tres veces con medio de aislamiento para eliminar las células poco adheridas.

  1. Alimente con medio de crecimiento los lunes, miércoles y viernes.
  2. Deje que las células crezcan hasta que se acerquen a la confluencia a los 5-9 días después de la siembra. Debería ver nidos de & ldquocobblestone & rdquo EC que comprenden entre un 10 y un 90% de células. Otras células mesenquimales son notables por la forma en que se acumulan y no forman monocapas.
  3. Separe las células con tripsina: EDTA (0,05%: 0,5 M) enjuagando 3 veces con tampón libre de Ca / Mg, y luego deje la nueva tripsina: EDTA encendida solo el tiempo que sea necesario para lograr una suspensión de células.
  4. Agregue 10 ml de medio de aislamiento para inactivar la tripsina.
  5. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugar a 1300 durante 8 min.
  6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 2 ml de DPBS-.
  7. Agregue las Dynabeads SAR recubiertas de ICAM-2 a la suspensión celular (15 ul / ml). Incubar durante 10 min. RT.
  8. Colocar en el imán y dejar reposar durante 1-2 min. Retire el sobrenadante.
  9. Lavar suavemente 2 veces en 3 ml de medio.
  10. Después del lavado final, resuspender en 10 ml de medio MEC y colocar en placa en T75 recubierto de gelatina. (Dividir en una proporción de 1: 2 si la recuperación celular es buena).

  1. Alimente con medio de crecimiento los lunes, miércoles y viernes.
  2. Dividir las células 1/3 con tripsina: EDTA cuando alcancen una confluencia del 75-100%.
  3. Vuelva a colocar las células endoteliales en un T75 recubierto de gelatina. Es importante mantener una placa de alta densidad para evitar un gran número de células senescentes.


Preguntas sobre la división del cultivo celular: ¿por qué centrifugar las células después de neutralizar la tripsina? Y tener problemas con las nuevas técnicas de laboratorio. ¿se trata sólo de mí?

Hola r / biology, soy nuevo aquí. Acabo de comenzar un puesto de asistente de investigación en un laboratorio de ciencias básicas en células y, por supuesto, es difícil sentirse inútil al principio porque todos los residentes de investigación y técnicos de amplificación están ocupados aprendiendo nuevas técnicas (transferencias, PCR, etc.) o ocupado con sus propios proyectos.

Sin embargo, mi mayor pregunta es la división celular: ¿por qué centrifugar después de tripsinizar las células? Siempre he aprendido en mi puesto de laboratorio anterior, que después de la tripsinización de las células, neutralizando tryspin w / media, tienes que centrifugarlo durante unos 4 minutos más o menos. Luego, deseche el sobrenadante, vuelva a mezclar el sedimento en 10 ml nuevos de medio y luego distribúyalo en placas. El laboratorio aquí no centrifuga, simplemente pipetean hacia arriba y hacia abajo durante 5 minutos y luego disparan la mezcla en las placas.

En cuanto a mí, anteriormente, trabajé 2 años en un laboratorio de células madre de ciencias básicas hace 3 años, y lo único que hice realmente bien fue dividir / plaquear / mantener cultivos celulares. Mi antiguo supervisor era súper anal acerca de ser estéril y limpio y limpiar todo con alcohol, siempre con guantes, siempre desechando las cosas correctamente, ya sea que estuvieras pipeteando medios o algo realmente biopeligroso. Especialmente en técnicas de cultivo celular.

En mi nuevo laboratorio, además de sentirme inútil, noté que hay grandes diferencias en la forma en que llevan a cabo los experimentos. Por ejemplo, cuando pipetean en la campana, descartan las puntas al azar en alguna esquina de la campana en lugar de en un tubo de 50 ml (como me enseñaron) o en un frasco de puntas. O cuando quitan los medios viejos de una placa, no usan una pipeta de vacío + pasteur (quemada para ser estéril), sino una pipeta. No rocían sus micropipetas con EtOH con tanta frecuencia cuando mueven cosas dentro y fuera del capó. No estoy seguro de si estoy experimentando problemas de ajuste o algo así ...

Es frustrante porque soy la persona más baja del laboratorio, no tengo habilidades más allá del cultivo de células, pero todavía no quiero estar a cargo de las células de otras personas. Y ellos (comprensivamente) no me creen cuando dije que solía centrifugar células. Hay más cosas, pero siento que cada vez que les pregunto, les resulta un poco molesto. Me gusta & quotoh, bueno, este es el atajo & quot y mi jefe de laboratorio anterior me enseñó a hacerlo de cierta manera hace dos años y medio, quien era extremadamente hábil.


Fondo

Los ensayos clonogénicos y MTT son pruebas bien conocidas para la evaluación de estudios de quimiorradiación y radiosensibilidad [1-4]. Los ensayos clonogénicos se utilizan comúnmente para investigar la supervivencia de las células cancerosas irradiadas, mientras que los ensayos MTT son bien conocidos por estudiar la quimiosensibilidad [5] o la toxicidad [6] de fármacos en líneas de células tumorales humanas. El ensayo es menos común para estudiar la supervivencia de las células cancerosas después de la irradiación, en particular cuando el ensayo MTT se realiza para estudiar la proliferación de las células tratadas.

El objetivo de este estudio es comparar el ensayo clonogénico bien establecido con una versión adaptada del ensayo de proliferación MTT para superar limitaciones como la larga duración del experimento, el bajo rendimiento de la muestra, el nivel de error limitado y el recuento de clones que consume mucho tiempo.

El ensayo MTT se basa en la formación de colorante formazán de color oscuro por reducción de la sal de tetrazolio MTT por células metabólicamente activas [7]. Después de cierta incubación, el tinte de formazán insoluble en agua forma cristales, que se pueden disolver en un disolvente orgánico y la cantidad se puede determinar de forma semiautomática utilizando un lector de microplacas. Las lecturas de absorbancia están relacionadas con el número de células [8], lo que brinda la posibilidad de utilizar el ensayo MTT como ensayo de proliferación para evaluar el crecimiento celular después de la irradiación. En el presente estudio se compara nuestra versión adaptada del ensayo MTT con el ensayo clonogénico para abrir la posibilidad de reemplazar uno por otro.

En la literatura, se pueden encontrar varios estudios sobre la comparabilidad de MTT y ensayo clonogénico. Allí, el ensayo MTT se realiza como ensayo de un solo punto después de un tiempo definido después del tratamiento. En este caso, se pierde mucha información sobre el comportamiento de crecimiento de las células (tiempo de duplicación, fase de retraso, comportamiento de crecimiento, etc.). Por el contrario, con nuestro ensayo MTT múltiple, recopilamos todos esos datos y los usamos para una interpretación más detallada.


Discusión

En este manuscrito, describimos un protocolo para generar y propagar esferas prostáticas (prostatosferas) a partir de tejidos prostáticos y líneas celulares de CaP humano y murino. Este ensayo depende de la capacidad de las células madre para sobrevivir en una matriz de cultivo 3D (por ejemplo, Matrigel & # x02122) en medio bajo o sin suero, mientras que las células diferenciadas crecen en cultivos de monocapa adherentes y medio que contiene FBS. La siembra en placa primaria de la suspensión de células individuales en una matriz 3D no confirma la existencia de una subpoblación de células madre enriquecida, que se caracteriza por su capacidad de autorrenovación y su potencial de diferenciación. Se necesitan propagaciones múltiples y en serie de las esferas para confirmar la existencia de CSC dentro de un tumor o una línea celular, dependiendo de encontrar una SFU / SFE relativamente constante dentro de cada generación.

El tema de la autorrenovación representa una característica central de las CSC y está estrechamente asociado con su capacidad patológica para regenerar tumores después del tratamiento. Representa la capacidad de estas células para reproducirse indefinidamente, mientras mantiene su capacidad multipotente para diferenciarse. 45 discutieron este tema en términos de propagación y autorrenovación de células madre adultas neuronales, cultivadas como neuroesferas en suspensión. (45) Argumentan correctamente que las células progenitoras no madre retienen la capacidad de autorrenovación y, de hecho, pueden propagarse a esferas secundarias o terciarias (G2 y G3, respectivamente). En teoría, las células madre de próstata mantendrán la capacidad de autorrenovación indefinidamente. Debido a las limitaciones técnicas enfrentadas in vitro, la propagación de esferas derivadas de células de próstata durante cinco generaciones (o más) puede ser práctico para aislar y propagar CSC de próstata; la capacidad de formación de esferas de las células progenitoras disminuye posteriormente, mientras que la de las CSC de próstata se mantiene.

El origen clonal de las esferas formadas es otro aspecto importante de este ensayo. Trabajos anteriores mostraron la tendencia de las neuroesferas a fusionarse y fusionarse cuando se cultivan en suspensión. Con el fin de generar colonias clonales utilizando células cultivadas en suspensión para cultivar neuroesferas, la deposición de una sola célula por pocillo presentó el criterio de oro para alcanzar ese objetivo (39). Estudios previos han cultivado con éxito prostatosferas en cultivo en suspensión sin suero, a partir de líneas celulares de CaP (51, 52). Sin embargo, este problema no se ha solucionado correctamente. El protocolo propuesto en este documento sugiere el crecimiento de células en matriz semisólida, para evitar su migración y agregación, y superar la carga técnica de cultivar esferas no adherentes a partir de una sola célula por pocillo. Se cultivaron y controlaron esferas discretas partiendo de una suspensión de una sola célula (Video S1). Matrigel & # x02122 proporciona una matriz enriquecida que alberga diferentes glicoproteínas y factores de crecimiento que se ven en la membrana basal, incluyendo colágeno IV, laminina y factor de crecimiento de fibroblastos. Proporciona una matriz semisólida capaz de simular el rico medio extracelular de las células. en vivo (53). El uso de Matrigel & # x02122 se ha implicado aún más en el cultivo de organoides a largo plazo, otra modalidad de cultivo en 3D que refleja fielmente la en vivo próstata de células derivadas de seres humanos y murinos (54). Además, Matrigel & # x02122 se ha utilizado para facilitar el establecimiento de xenoinjertos tumorigénicos derivados de líneas celulares humanas en ratones inmunodeprimidos (53).

Un estudio anterior descubrió que las esferas sólidas 3D de las glándulas mamarias, cultivadas en Matrigel & # x02122, podrían usarse para repoblar las almohadillas de grasa mamaria sin glándulas en ratones, alcanzando una frecuencia de injerto del 71% (55). Esto significa que las esferas formadas pueden usarse para trasplantes de tejido y que este ensayo podría desarrollarse más en el futuro para que sea aplicable a injertos de tejido humano. Curiosamente, también se encontró que el ensayo de esfera podría usarse para comparar los mecanismos celulares de células normales y malignas a través del desciframiento de vías activas y patrones de diferenciación. Se encontró que las esferas derivadas de tejido pulmonar normal, cultivadas en Matrigel & # x02122, pudieron formar un lumen, mientras que las esferas derivadas de líneas celulares y biopsias de tumores de cáncer de pulmón no lo fueron (56), lo que demuestra un uso potencial de la esfera. -Ensayo de formación para comparar los procesos celulares subyacentes que gobiernan las CSC y los de las células madre de tejido normal, y sus implicaciones fisiopatológicas en la progresión de la enfermedad. Otro estudio, de Hur et al. encontraron que las hematoesferas podrían aislarse de la sangre y cultivarse en Matrigel & # x02122 para permitir la formación de una red de vasos (57), proponiendo implicaciones terapéuticas potenciales para tratar oclusiones de arterias coronarias o arterias ateroscleróticas, mediante terapias de reemplazo de vasos.

Debido a que el uso de SFA se ha implementado recientemente para evaluar propiedades similares a las de las células madre en tumores, no se ha prestado mucha atención a los tratamientos farmacológicos dirigidos a estas células autorrenovables. Sin embargo, ha habido varios estudios que se enfocaron en probar medicamentos particulares en esferas generadas. Se utilizó SFA, junto con diferentes ensayos, para demostrar que la nigericina, un antibiótico que suprime la función de Golgi en las células eucariotas, suprime la metástasis del cáncer colorrectal al inhibir la transición epitelio-mesenquimal (EMT) (58). Se demostró que el fármaco metformina inhibe el crecimiento de las células del carcinoma de tiroides, suprime la propiedad de autorrenovación de las células madre cancerosas de la tiroides y actúa como un suplemento potenciador de los agentes quimioterapéuticos (43). Además, se ha demostrado que Eckol suprime el mantenimiento de las propiedades de las células madre y las neoplasias en las células madre del glioma, lo que sugiere una menor probabilidad de recurrencia del cáncer (42). Además, se ha descubierto que las esferas de origen tumoral de esófago implican células madre con actividad elevada de aldehído deshidrogenasa (59). Berberis libanotica Ehrenb (BLE) también se demostró que tienen un alto potencial terapéutico para atacar el CaP y erradicar la capacidad de autorrenovación de las CSC altamente resistentes (35). Todos los ejemplos mencionados han utilizado SFA para evaluar el efecto de los fármacos en las CSC o poblaciones similares a células madre en tumores.Estos estudios se basaron principalmente en dos criterios principales en su evaluación: el volumen promedio de las esferas generadas y el número promedio de esferas formadoras de esferas. unidades (SFU). Sin embargo, la mayoría de los estudios se centran en probar fármacos particulares en esferas generadas para una sola generación, sin evaluar el efecto en esferas propagadas durante varias generaciones, que poseen propiedades enriquecidas de células madre / progenitoras.

Para enfatizar la importancia del uso de SFA en la investigación de células madre y cáncer, hemos elaborado un protocolo detallado sobre cómo realizar un ensayo de formación de esferas semisólido basado en Matrigel & # x02122 en ausencia o presencia de fármacos, de forma consecutiva o alternativa, en el contexto de las células madre de CaP. La ventaja de utilizar esta formación de esferas in vitro El ensayo consiste en aislar, propagar, purificar y amplificar poblaciones específicas de células madre prostáticas normales y células madre cancerosas. Permite estudiar las células madre en diferentes etapas de su formación (en diferentes generaciones) y detectar marcadores de sus vías de señalización. También depende únicamente de la propiedad intrínseca funcional de las células madre para formar una estructura compleja en un entorno 3D, a saber, la capacidad de autorrenovación y el potencial de diferenciación.


El pionero de la genómica Craig Venter imagina el futuro de la vida sintética

NUEVA YORK - La vida es un sistema de software de ADN, dijo el científico del genoma Craig Venter en un auditorio abarrotado aquí en el Museo Americano de Historia Natural el lunes por la noche (21 de octubre). En su charla, Venter ofreció una visión a largo plazo de la creación y digitalización de la vida sintética.

La creación de vida sintética es solo un logro supremo de la carrera de Venter y la evolución del campo de la biología. En 2000, Venter dirigió uno de los dos equipos que secuenciaron el genoma humano, el anteproyecto de la vida. Luego, en 2010, su equipo trasplantó ADN artificial a una célula bacteriana para crear el primer organismo sintético.

Para crear una célula sintética, dijo Venter, él y sus colegas tuvieron que encontrar una manera de escribir el software de ADN y arrancarlo. Y esta tecnología abrió un sinfín de aplicaciones prácticas, explica en su nuevo libro "La vida a la velocidad de la luz" (Viking Adult, 2013), en el que Venter cuenta la historia de estos hitos y especula sobre el futuro de la biología en el era digital. [Desentrañar el genoma humano: 6 hitos moleculares]

Teletransportación biológica

Sus ideas solo se vuelven más inusuales a partir de ahí. ¿Qué pasaría si, especuló Venter, uno pudiera enviar un genoma a través del sistema solar a la velocidad de la luz y reconstituirlo en el otro lado? Por ejemplo, si un rover descubrió vida en Marte, podría secuenciar el ADN de la forma de vida y enviar el código a la Tierra, donde los científicos podrían reconstruir el organismo.

Por supuesto, Venter estaba hablando de formas de vida simples como las bacterias. "No estamos listos para transportar humanos a través del universo en el corto plazo", dijo.

Pero la realidad sigue siendo impresionante. La capacidad de sintetizar la vida a partir de su ADN solo podría acelerar enormemente la producción de vacunas, dijo Venter. Los científicos podrían secuenciar un virus de la gripe emergente en cualquier parte del mundo y enviar esa secuencia a través de Internet a las compañías farmacéuticas que podrían desarrollar una vacuna para él. En última instancia, dijo, las personas pueden descargar secuencias genéticas a una máquina que produce vacunas en sus propios hogares.

Venter y sus colegas han sentado las bases para estos desarrollos al desarrollar las herramientas necesarias para construir células vivas.

Sintetizando la vida

El primer paso, explicó Venter, fue crear un software que pudiera construir su propio hardware. Su equipo creó un bacteriófago sintético, un virus que infecta a las bacterias, y lo inyectó en E. coli células bacterianas. Las células incorporaron el ADN sintético en sus genomas y comenzaron a ensamblar bacteriófagos. [5 tecnologías locas que están revolucionando la biotecnología]

El siguiente proyecto de Venter fue ambicioso: su equipo modificó un cromosoma de la bacteria Mycoplasma mycoides y lo insertó en la célula de la bacteria Mycoplasma capricolum. Para hacer eso, su equipo tuvo que desarrollar nuevas técnicas genéticas sofisticadas.

Una vez insertado en el host, M. mycoidesEl ADN comenzó a dar instrucciones a las enzimas que masticaban el genoma de la bacteria huésped. ¿El resultado? "Trasplantamos el genoma de una célula a otra especie y, en el proceso de hacerlo, convertimos una especie en otra", dijo Venter.

El paso final fue juntar un cromosoma bacteriano completo y ponerlo en una célula donde se replicaría, no es tarea fácil. Para hacer eso, Venter y su equipo crearon grandes trozos de ADN bacteriano y los ensamblaron dentro de una célula de levadura. Después de varios obstáculos y años de prueba y error, los científicos produjeron la primera célula sintética en 2010.

El genoma sintético contenía una secuencia de "marca de agua" que incluía los nombres de los científicos que trabajaron en él. También incluía citas de los físicos Richard Feynman y Robert Oppenheimer, y esta cita del escritor James Joyce: "Vivir, errar, caer, triunfar, recrear la vida a partir de la vida".

¿Jugar a ser Dios?

En la medida en que el equipo creó un organismo capaz de prosperar y autorreplicarse, Venter y sus colegas habían creado vida.

"En el sentido restringido en el que habíamos demostrado con este experimento cómo Dios era innecesario para la creación de una nueva vida, supongo que lo eramos", escribe Venter en su nuevo libro.

Pero para Venter, sintetizar la vida es simplemente el resultado lógico de años de retoques genéticos.

Venter cree que la biología moderna nació cuando el físico austriaco Erwin Schr & oumldinger dio una serie de conferencias tituladas "¿Qué es la vida?" en Dublín en 1943. Schr & oumldinger propuso que los cromosomas eran una especie de "escritura de código", que podría ser tan simple como el código Morse.

En 1944, tres científicos canadienses y estadounidenses, Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty, realizaron un experimento que demostró que el ADN, y no las proteínas, era el material hereditario de las células. Y en 1953, el biólogo estadounidense James Watson y su colega británico Francis Crick descubrieron la estructura del ADN, basándose en el trabajo de Rosalind Franklin y Maurice Wilkins.

Las décadas de 1960 y 1970 fueron testigos de enormes avances en la comprensión del ADN y la tecnología del ADN recombinante. Sobre la base de estos fundamentos, el grupo de Venter y el Proyecto Genoma Humano financiado con fondos públicos produjeron el primer borrador de secuencia del genoma humano en 2000.


Citotoxicidad de ciclodipéptidos de Pseudomonas aeruginosa PAO1 conduce a apoptosis en líneas celulares de cáncer humano

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista de plantas y animales, que produce factores de virulencia para infectar o colonizar a sus huéspedes eucariotas. Ciclodipéptidos (CDP) producidos por P. aeruginosa exhiben propiedades citotóxicas hacia las células tumorales humanas. En este estudio, evaluamos el efecto de una mezcla de CDP, compuesta de ciclo (L-Pro-L-Tyr), ciclo (L-Pro-L-Val) y ciclo (L-Pro-L-Phe) que fueron aislado de P. aeruginosa, en dos líneas celulares de cáncer humano. Nuestros resultados demostraron que la mezcla de CDP promovió la muerte celular en cultivos de las líneas celulares de adenocarcinoma cervical HeLa y adenocarcinoma colorrectal Caco-2 de manera dosis-dependiente, con una concentración inhibidora del 50% (IC50) de 0,53 y 0,66 mg / ml, para las células HeLa y Caco-2, respectivamente. El análisis de citometría de flujo, utilizando anexina V y yoduro de propidio como indicadores de apoptosis y necrosis, respectivamente, mostró claramente que las células HeLa y Caco-2 exhibían características apoptóticas cuando se trataban con la mezcla de CDP a una concentración & lt0,001 mg / ml. IC50 los valores de las células apoptóticas en las células HeLa y Caco-2 fueron 6,5 x 10 −5 y 1,8 x 10 −4 mg / ml, respectivamente. Nuestros resultados indican que una vía apoptótica está involucrada en la inhibición de la proliferación celular causada por el P. aeruginosa Mezcla CDP.

1. Introducción

Pseudomonas aeruginosa coloniza muchos entornos biológicos, como el suelo, las plantas y los tejidos animales, siendo un patógeno importante implicado en las infecciones oportunistas en los seres humanos [1] y una de las principales causas de infecciones nosocomiales [2]. Varios mecanismos para impulsar la infección en el huésped se han atribuido a P. aeruginosa, and, among these, the production of toxins, adhesins, pyocyanin, and other virulence factors plays an important role in infecting different hosts, from plants to animals [3, 4]. P. aeruginosa produces and senses N-acyl-L-homoserine lactones (AHLs) for cell-to-cell communication via a regulatory mechanism known as quorum sensing (QS), which links the perception of bacterial cell density to gene expression. QS coordinates many physiological processes, such as symbiosis, production of virulence factors, resistance to oxidative stress, antibiotic resistance, motility, biofilm formation, and the progression of P. aeruginosa infection in animals [5, 6].

The cyclodipeptides (CDPs) cyclo(D-Ala-L-Val) and cyclo(L-Pro-L-Tyr) have been identified in P. aeruginosa cultures, which led to the proposition that CDPs have the ability to inhibit the activity of regulatory LuxR-type proteins that are involved in AHL-dependent QS signaling. This in turn led to the proposition that CDPs and their derivatives, the diketopiperazines (DKPs), represent a new class of QS signals and that they could potentially act as interkingdom signals. However, the mechanism of action and physiological relevance of CDPs are poorly understood [7, 8].

DKPs are cyclized molecules comprising two amino acids bound by two peptide bonds they are produced by a wide range of organisms, from bacteria to fungi and animals (Figure 1(a)) [9, 10]. DKPs belong to the nonribosomal peptides that are synthesized in microorganisms by a multifunctional assembly of enzymes known as nonribosomal peptide synthases [10] and by CDP synthases, another kind of enzymes that utilizes aminoacylated transfer RNAs as substrates instead of free amino acids [11].

CDPs are structurally diverse, and they have been implicated in multiple functions the CDPs cyclo(D-Ala-L-Val) and cyclo(L-Pro-L-Tyr) have been identified as a new class of QS autoinducers in Pseudomonas strains, based on their ability to activate AHL-dependent biosensors [12–14]. The CDP cyclo(L-Phe-L-Pro) isolated from Lactobacillus plantarum exhibited an antifungal effect against Fusarium sporotrichioides y Aspergillus fumigatus [15], while the CDPs cyclo(L-Leu-L-Pro), cyclo(L-Phe-L-Pro), cyclo(L-Val-L-Pro), cyclo(L-Trp-L-Pro), and cyclo(L-Leu-L-Val) isolated from the deep-sea bacterium Streptomyces fungicidicus showed antifouling effects [16]. Moreover, synthetic CDPs such as cyclo(Phe-Pro) induced apoptosis in the HT-29 colon cancer cell line [17], and cyclo(L-Cys-L-Leu) exhibited potential for scavenging free radicals [18]. Recently, it was reported that P. aeruginosa is capable of interacting with the plant Arabidopsis thaliana via the secretion of CDPs such as cyclo(L-Pro-L-Tyr), cyclo(L-Pro-L-Val), and cyclo(L-Pro-L-Phe), appearing to mimic the biological role of auxin, a natural plant hormone [12] (Figure 1(b)). En Staphylococcus aureus, the aureusimines A/B, comprised of the CDP cyclo(L-Val-L-Tyr) and cyclo(L-Val-L-Phe), respectively, are involved in the regulation of bacterial virulence factors in a murine host [19] similarly, the CDP cyclo(L-Phe-L-Pro) in Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, y V. harveyi is involved in controlling the expression of genes that are important in pathogenicity [20]. Moreover, it was reported that CDPs and DKPs may induce cell death in several cancer cell lines [21], by affecting biological processes such as microtubule polymerization for example, cyclo(D-Tyr-D-Phe), isolated from Bacilo species, induced apoptosis via caspase-3 activation in the A549 pulmonary adenocarcinoma cell line [22]. In addition, it was reported that the CDPs cyclo(L-Leu-L-Pro) and cis-cyclo(L-Phe-L-Pro) isolated from Lactobacillus exhibited antiviral activity against the influenza A (H3N2) virus [23].

Although, in the context of bacteria-mammalian interaction, it has been suggested that CDPs could play an important role in bacterial pathogenesis, bacteria-host signaling, or mammalian cell growth, the mechanisms involved are unknown. Therefore, in this study, we focused on investigating the cellular effect of CDPs produced from P. aeruginosa strain PAO1, a pathogenic bacterium in humans that is capable of secreting the CDPs, cyclo(L-Pro-L-Tyr), cyclo(L-Pro-L-Val), and cyclo(L-Pro-L-Phe) into the culture medium (Figure 1(b)). The biological effects of these CDPs on the growth and/or pathogenesis of mammalian cells remain unknown the P. aeruginosa CDPs could be involved in bacterial host colonization phenomena during disease episodes, where antiproliferative or anti-immune properties of these compounds could affect the host organism. In this regard, we employed the HeLa cervical adenocarcinoma and Caco-2 colorectal adenocarcinoma cell lines as host models in this study.

2. Materiales y métodos

2.1. Sustancias químicas y reactivos

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), antibiotic antimycotic solution (100X) penicillin, streptomycin, and amphotericin B were purchased from Sigma-Aldrich Co. 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) were purchased from Sigma-Aldrich Co. Alexa Fluor 488 annexin V and the PI/dead cell apoptosis kit were obtained from Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Tissue-culture plastic ware was acquired from Corning (Tewksbury, MA, USA).

los P. aeruginosa CDP mix was characterized as described previously [12]. Briefly, the P. aeruginosa WT strain was placed in 100 mL of Luria Bertani (LB) medium and incubated for 24 h at 30°C for bacterial growth. Cell-free supernatants were prepared by centrifugation (10,000 ×g, 25°C for 10 min). The resulting supernatant was extracted twice with ethyl acetate supplied with acetic acid (0.1 mL/L). The extracts were evaporated to dryness using a rotavapor at 60°C (Buchi Co., Lawil, Switzerland). The residue was solubilized in methanol : acetonitrile (1 : 1) and analyzed by GC-MS as described [12]. The CDP mix is constituted by the cyclo(L-Pro-L-Tyr), cyclo(L-Pro-L-Val), and cyclo(L-Pro-L-Phe) in a 1 : 1 : 1 molar ratio. For dose-response assays, the CDP mix was evaporated to dryness, weighed out, and dissolved with DMSO to prepare a 100 mg/mL concentration as stock solution.

2.2. Cell Line Growth

The human cancer cell lines HeLa and Caco-2 were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cell procedures were performed under class II biological safety cabinets. Cells were cultured in DMEM supplemented with 10% (v/v) FBS (complete medium) and 1% antibiotic (10,000 units of penicillin, 10 mg streptomycin, and 25 μg of amphotericin B per mL) solution. The cultures were fed twice a week and maintained at 37°C under 80% humidity and incubated in an atmosphere of 5% CO2. HeLa and Caco-2 cells were collected by trypsinization using trypsin/EDTA buffered solution for 5 min at room temperature, followed by the addition of 5 mL of serum-enriched medium (CM) to stop trypsin action. After trypsinization the cells were collected and washed with CM. Finally, cells were counted in a hemocytometer chamber and incubated in fresh CM media.

2.3. Cell Viability Assay

Cell viability was determined by the MTT colorimetric method using thiazolyl blue tetrazolium bromide (Sigma-Aldrich Co). Briefly, HeLa and Caco-2 cells were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 3 × 10 4 cells per well in 200 μL of CM and incubated for 24 h at 37°C as described above. Then, the medium was removed and replaced with new CM or serum-free medium (SS). Then, cells were incubated with CDP mix solution at indicated concentration. Cells were incubated for another 24 h at 37°C. To determine cell viability, 10 μL of 5 mg MTT per mL in PBS was added to each well and incubated for 4 h at 37°C. Finally, 100 μL of 2-propanol/1 M HCl (19 : 1 v/v) was added to dissolve the formazan crystals. Absorbance measurements were conducted utilizing a microplate spectrophotometer (IMarK Microplate Reader, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) at 595 nm.

2.4. Necrosis and Apoptosis Assay

HeLa and Caco-2 cell lines were seeded in 96-well flat-bottomed plates at a density of 3 × 10 4 cells per well in 200 μL of CM and incubated for 24 h at 37°C. Then, cells were synchronized with SS medium for 12 h at 37°C and were incubated with different concentrations of CDPs mixture. DMSO was used as control at same concentration used to dissolve the CDP mix. To determinate the apoptotic effect, cells were collected by centrifugation at 2,000 ×g for 10 min. The pellet was suspended in 20 μL of SS medium and treated with annexin V and propidium iodide (PI) (Dead Cell Apoptosis Kit Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) following the indications recommended by the manufacturer. Fluorescence was immediately quantified by flow cytometry (FC) using a BD Accuri C6 Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). The populations of cells for each of the treatments were gated in forward scatter and side scatter dot plots to eliminate cell debris. Populations corresponding to auto- or basal-fluorescence were located in the left quadrant and cells with emission of fluorescence increasing at least one log unit value were located in the right quadrant of the dot plots. In addition, the percentage of fluorescent cells (PFC) and median fluorescence intensity (FI) were determined in monoparametric histograms of fluorescence emission obtained from the dot plots and labeled as PFC and as relative units of fluorescence. The equipment was calibrated using Spherotech 8-peak (FL1–FL3) and 6-peak (FL-4) validation beads (BD Accuri, San Jose, CA, USA). For apoptosis and necrosis assays, fluorescence for annexin V in emission fluorescence channel FL1 at 495/519 nm and for propidium iodide in the FL2 channel at 535/617 nm was monitored. A minimum of 20,000 cellular events were analyzed.

2.5. Cell Image Captures

HeLa and Caco-2 cells were seeded in 12-well flat-bottomed plates with sterile-covered round objects covered with collagenase at a density of 1 × 10 4 cells per well with one mL of CM and incubated for 24 h at 37°C. Cells were incubated with serum-free medium (SS) for 12 h at 37°C and an atmosphere of 5% CO2 and incubated with different concentrations of the CDP mix. After 12 h of treatment, the cells were washed with PBS. Cells were fixed with paraformaldehyde (PFA at 4%) for 10 min on ice. Then, cells were incubated with DAPI (1 : 1,000) for 10 min at room temperature. Finally, cells were washed with PBS, and the cover glass was removed and placed into a holder with a drop of PBS and glycerol 1 : 1. Cultured cells were photographed using an inverted phase-contrast microscope (Carl-Zeiss HB0-50, San Diego, CA, USA) equipped with an AxioCam/Cc1 digital camera. Cultures of HeLa and Caco-2 cells were grown in CM and incubated with DAPI and visualized using a confocal microscope (Olympus FV1000, Center Valley, PA, USA). The cells were observed by fluorescence emission between 405 and 505 nm.


Detailed product information

General

Handling information

Each type of cell or cell line responds to Trypsin-EDTA for Primary Cells in a unique manner. For optimum results, continuously observe the cells during the dissociation process to prevent damage. For cell-specific information, please refer to the product sheet supplied with the cells or cell line.

  1. Bring the DPBS, the Trypsin-EDTA for Primary Cells, and the Trypsin Neutralizing Solution to room temperature before use. Warm the complete growth medium to 37°C prior to use with the cells.
  2. For each flask, carefully aspirate the spent media without disturbing the monolayer. If the cell culture medium contains serum, each flask should be rinsed with DPBS twice prior to adding the Trypsin-EDTA for Primary Cells.
  3. Using 1 to 2 mL for every 25 cm2, add the appropriate volume of trypsin-EDTA solution to each flask (e.g., each T-25 flask would be dissociated with 1 to 2 mL trypsin-EDTA).
  4. Gently rock each flask to ensure complete coverage of the trypsin-EDTA solution over the cells, and then aspirate the excess fluid off of the monolayer do not aspirate to dryness.
  5. Observe the cells under the microscope. When the cells pull away from each other and round up (typically within about 3 to 6 minutes), remove the flask from the microscope and gently tap the culture flask from several sides to promote detachment of the cells from the flask. Do not over-trypsinize as this will damage the cells.
    1. Some strongly adherent cell types, such as keratinocytes, may take much longer and may require trypsinization at 37°C.
    2. Some cell types may require more vigorous tapping.
    1. Do not over centrifuge cells as this may cause cell damage.
    2. After centrifugation, the cells should form a clean loose pellet.

    Quality control specifications

    Legal disclaimers

    The product is provided 'AS IS' and the viability of ATCC ® products is warranted for 30 days from the date of shipment, provided that the customer has stored and handled the product according to the information included on the product information sheet, website, and Certificate of Analysis. For living cultures, ATCC lists the media formulation and reagents that have been found to be effective for the product. While other unspecified media and reagents may also produce satisfactory results, a change in the ATCC and/or depositor-recommended protocols may affect the recovery, growth, and/or function of the product. If an alternative medium formulation or reagent is used, the ATCC warranty for viability is no longer valid. Except as expressly set forth herein, no other warranties of any kind are provided, express or implied, including, but not limited to, any implied warranties of merchantability, fitness for a particular purpose, manufacture according to cGMP standards, typicality, safety, accuracy, and/or noninfringement.

    This product is intended for laboratory research use only. It is not intended for any animal or human therapeutic use, any human or animal consumption, or any diagnostic use. Any proposed commercial use is prohibited without a license from ATCC.

    While ATCC uses reasonable efforts to include accurate and up-to-date information on this product sheet, ATCC makes no warranties or representations as to its accuracy. Citations from scientific literature and patents are provided for informational purposes only. ATCC does not warrant that such information has been confirmed to be accurate or complete and the customer bears the sole responsibility of confirming the accuracy and completeness of any such information.

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