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¿Qué regula estos dos métodos de empalme?

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El corte y empalme alternativo puede barajar el orden de los exones y seleccionar de la secuencia del exón de un sitio de un solo gen para proporcionar una selección combinatoria de posibles productos de transcripción de un gen. ¿Puede el empalme trans intergénico hacer esto a partir de múltiples sitios de genes?

¿Qué regula estos dos procesos de combinación de genes "no lineales", transcripción-empalme?


Como dijo Alan Boyd, este proceso se llama empalme trans, donde se unen exones de diferentes ARN. La proximidad física es propicia para el empalme trans. Este estudio muestra que la frecuencia de empalme trans es mayor si los genes son proximales. La proximidad no solo significa más cerca en el genoma, sino también la proximidad 3D gobernada por interacciones cromosómicas.

Ahora, que factores promover el empalme trans no se comprende correctamente.


Empalme de ARN

Empalme de ARN, en biología molecular, es una forma de procesamiento de ARN en el que una transcripción de ARN mensajero precursor (pre-ARNm) recién creada se transforma en un ARN mensajero maduro (ARNm). Durante el empalme, los intrones (regiones no codificantes) se eliminan y los exones (regiones codificantes) se unen. En el caso de los genes con codificación nuclear, el empalme tiene lugar dentro del núcleo durante o inmediatamente después de la transcripción. Para aquellos genes eucariotas que contienen intrones, generalmente se requiere el empalme para crear una molécula de ARNm que pueda traducirse en proteína. Para muchos intrones eucariotas, el empalme se lleva a cabo en una serie de reacciones que son catalizadas por el espliceosoma, un complejo de pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP). También existen intrones auto-empalmados, o ribozimas capaces de catalizar su propia escisión de su molécula de ARN parental.


Ejemplos de empalmes alternativos

Genes de Neurexina

Los seres humanos tenemos 3 genes que codifican una familia de proteínas conocida como neurexinas. Estas proteínas se incorporan a la membrana plasmática. Se extienden fuera de la membrana plasmática y en el espacio entre los nervios. Aquí, se unen a una proteína de la otra célula nerviosa. Este complejo de proteínas mantiene las células en su lugar. Si bien solo hay 3 genes diferentes que codifican las neurexinas, hay más de 3000 proteínas diferentes en la familia de las neurexinas.

Esto es posible mediante empalmes alternativos. A medida que el espliceosoma procesa las moléculas de ARNm primarias de estos genes, está influenciado por varios genes promotores, moléculas en la célula y otras señales. Estos influyen en qué exones se incluyen en el ARNm final. El empalme alternativo puede hacer que las proteínas sean más grandes o más pequeñas, o que falten regiones, pero generalmente todavía produce una proteína funcional. De esta manera, cada variación del entorno celular o señal extracelular crea una proteína diferente con una función ligeramente diferente.

Si bien todas las proteínas de neurexina funcionarán manteniendo unidas las sinapsis entre dos nervios, la variación producida se teoriza para hacer una serie de cosas. Primero, puede alterar la señal que viaja entre las dos neuronas. Esto podría producir un efecto necesario para que el cerebro procese la señal. Pueden emplearse diferentes proteínas en diferentes momentos, en diferentes células, en el mismo animal. Esto podría ser necesario para adaptarse a los diferentes entornos dentro de un organismo y garantizar que las neuronas funcionen correctamente.

Cuando los científicos observaron los mismos genes en los peces, encontraron algo interesante. Si bien los peces también tienen estos genes, no pueden empalmar los genes en tantas alternativas. Esto lleva a los científicos a plantear la hipótesis de que el empalme alternativo podría usarse para modificar estos genes de una manera que los haga específicos para ciertas partes del cerebro. De esta manera, el empalme alternativo puede proporcionar una especie de "sistema de indexación" para el cerebro. Esta podría ser la razón por la que los humanos pueden almacenar tanta información adicional y tienen una memoria a largo plazo tan eficiente.

Fabricación de anticuerpos

En un proceso similar, el cuerpo humano produce anticuerpos para combatir bacterias, virus y cuerpos extraños que infectan los tejidos. Para hacer esto, el cuerpo debe hacer un anticuerpo, o proteína que está específicamente diseñada para adherirse al invasor. Estas proteínas son fabricadas por Linfocitos B, que contienen el ADN y la maquinaria para crear estas proteínas complejas. Sin embargo, existe un problema.

Los linfocitos B necesitan unir la proteína a sí mismos y necesitan liberar el anticuerpo en el torrente sanguíneo. El anticuerpo en el torrente sanguíneo se unirá a los invasores, permitiendo que las células inmunitarias se dirijan a ellos. Al unir anticuerpos directamente a los linfocitos B, estas células pueden tragar fácilmente a los invasores cuando los encuentran. Para hacer esto con un mínimo de energía y utilizando el mismo ADN, estas células inmunes utilizan empalmes alternativos.

Los dos últimos exones del código genético de los anticuerpos son especiales. Estos dos exones codifican una región de proteína que es hidrofóbico, o resiste el agua. Estas regiones se adhieren dentro del núcleo hidrofóbico de la bicapa de fosfolípidos. Esto los bloquea efectivamente en la membrana celular. El empalme alternativo simplemente elimina estos dos exones. Ahora, la proteína servirá para el mismo propósito, pero es Agua soluble y puede viajar a través de la sangre y los fluidos.

Al recibir una señal para crear anticuerpos, el linfocito B debe crear muchos a la vez tanto para sí mismo como para ser liberados en el cuerpo. Para hacer esto, transcribe activamente el gen del anticuerpo rápidamente, para crear tantas transcripciones primarias como sea posible. Algunos de estos se procesarán para retener la región hidrófoba, y algunos espliceosomas eliminarán eso. Por tanto, las proteínas para ambos usos se crean a partir de la misma señal para crear anticuerpos. El empalme alternativo permite iniciar muchos procesos diferentes a partir de la misma señal de transcripción de ADN.

1. ¿Cuál es el propósito principal del empalme alternativo?
UNA. Para crear variantes de proteínas.
B. Para ayudar con el metabolismo.
C. Para acelerar el proceso de creación de proteínas.

2. ¿Por qué los organismos necesitan tantas versiones de la misma proteína?
UNA. No es así, es solo una variación genética adicional
B. Para las miles de funciones diferentes que completan sus células
C. Los científicos no conocen la respuesta

3. ¿Cómo podría el empalme alternativo ayudar a crear inteligencia?
UNA. Al producir diferentes proteínas, puede crear conexiones neuronales avanzadas.
B. Cuanta más proteína tenga, más inteligente será
C. Es poco probable que el empalme alternativo genere inteligencia


¿Qué regula estos dos métodos de empalme? - biología

Al igual que la transcripción, la traducción está controlada por proteínas que se unen e inician el proceso. En la traducción, antes de que pueda comenzar la síntesis de proteínas, debe completarse el ensamblaje de los ribosomas. Este es un proceso de varios pasos.

En el ensamblaje de ribosomas, las subunidades ribosómicas grandes y pequeñas y un ARNt iniciador (ARNtI) que contienen el primer aminoácido de la cadena polipeptídica final, todos se juntan en el codón de inicio de la traducción en un ARNm para permitir que comience la traducción. Primero, la pequeña subunidad ribosómica se une al ARNtI que transporta metionina en eucariotas y arqueas y transporta N-formil-metionina en bacterias. (Porque el tRNAI lleva un aminoácido, se dice que está cargado.) A continuación, la subunidad ribosómica pequeña con el ARNt cargadoI exploraciones aún enlazadas a lo largo de la cadena de ARNm hasta que alcanza el codón de inicio AUG, que indica dónde comenzará la traducción. El codón de inicio también establece el marco de lectura para la cadena de ARNm, que es crucial para sintetizar la secuencia correcta de aminoácidos. Un cambio en el marco de lectura da como resultado una mala traducción del ARNm. El anticodón del ARNtI luego se une al codón de inicio a través del emparejamiento de bases. El complejo que consta de ARNm, ARNt cargadoI, y la subunidad ribosómica pequeña se une a la subunidad ribosómica grande, que completa el ensamblaje del ribosoma. Estos componentes se unen con la ayuda de proteínas llamadas factores de iniciación que se unen a la pequeña subunidad ribosómica durante la iniciación y se encuentran en los tres dominios de la vida. Además, la célula gasta energía GTP para ayudar a formar el complejo de iniciación. Una vez que se completa el ensamblaje del ribosoma, el ARNt cargadoI se coloca en el sitio P del ribosoma y el sitio A vacío está listo para el siguiente aminoacil-tRNA. La síntesis de polipéptidos comienza y siempre avanza desde el N-terminal al C-terminal, llamado dirección N-a-C.

En eucariotas, varias proteínas del factor de iniciación eucariotas (eIF) ayudan en el ensamblaje de los ribosomas. El factor de iniciación eucariota-2 (eIF-2) es activo cuando se une al trifosfato de guanosina (GTP). Con GTP unido a él, la proteína eIF-2 se une a la pequeña subunidad ribosómica 40S. A continuación, el ARNt inicial cargado con metionina (Met-ARNtI) se asocia con el complejo de ribosoma GTP-eIF-2 / 40S, y una vez que todos estos componentes se unen entre sí, se denominan colectivamente complejo 43S.

Los factores de iniciación eucariotas eIF1, eIF3, eIF4 y eIF5 ayudan a traducir el complejo 43S a la tapa 5 & # 8242-m 7 G de un ARNm. Una vez unido al mRNA & # 8217s 5 & # 8242 m 7 G cap, el complejo 43S comienza a viajar por el mRNA hasta que alcanza el codón de iniciación AUG al comienzo del marco de lectura del mRNA & # 8217s. Las secuencias alrededor del AUG pueden ayudar a garantizar que se utilice el AUG correcto como codón de iniciación en el ARNm.

Una vez que el complejo 43S está en el AUG de iniciación, el tRNAi-Met se coloca sobre el AUG. El anticodón del ARNtI-Combina pares de bases con el codón AUG. En este punto, el GTP unido a eIF2 en el complejo 43S se hidroliza a GDP + fosfato y se libera energía. Esta energía se utiliza para liberar el eIF2 (con GDP unido a él) del complejo 43S, dejando la subunidad ribosómica 40S y el tRNA.I-Se encuentra en el sitio de inicio de la traducción del ARNm.

A continuación, eIF5 con GTP unido se une a la subunidad ribosómica 40S complejada con el ARNm y el ARNt.I-Reunió. El eIF5-GTP permite que la subunidad ribosómica grande 60S se una. Una vez que llega la subunidad ribosómica 60S, eIF5 hidroliza su GTP unido a GDP + fosfato y se libera energía. Esta energía impulsa el ensamblaje de las dos subunidades ribosómicas en el ribosoma 80S intacto, con tRNAi-Met en su sitio P mientras que también se empareja con el codón de iniciación AUG en el mRNA. La traducción está lista para comenzar.

La unión de eIF-2 a la subunidad ribosómica 40S está controlada por fosforilación. Si eIF-2 está fosforilado, sufre un cambio conformacional y no puede unirse a GTP. Por lo tanto, el complejo 43S no se puede formar correctamente y se impide la traducción. Cuando eIF-2 permanece sin fosforilar, se une a la subunidad ribosómica 40S y traduce activamente la proteína.

Complejo de iniciación a la traducción: La expresión génica puede controlarse mediante factores que se unen al complejo de iniciación de la traducción.

La capacidad de ensamblar completamente el ribosoma afecta directamente la velocidad a la que se produce la traducción. Pero la síntesis de proteínas también está regulada en varios otros niveles, incluida la síntesis de ARNm, la síntesis de ARNt, la síntesis de ARNr y la síntesis del factor de iniciación eucariota. La alteración en cualquiera de estos componentes afecta la velocidad a la que puede ocurrir la traducción.


¿Por qué las células humanas expresan más variedades de proteínas que los genes que las codifican? ¿Cómo surgió este desajuste? ¿Tiene un propósito biológico? El resultado es que las vías alternativas de empalme de pre-ARNm son responsables de producir decisiones moleculares en forma de transcripciones de ARN mensajero, que diversifican las formas y funciones de las familias de proteínas codificadas en el genoma. En última instancia, el espliceosoma es el guardián bioquímico de las decisiones de empalme. Debe ser ágil en la forma en que dirige las decisiones sobre el reconocimiento del sitio de empalme para favorecer o desfavorecer una vía de empalme sobre otra, preservando al mismo tiempo la precisión. Las decisiones de empalme pueden tener un impacto profundo en el destino y el comportamiento celular. En el sistema nervioso, por ejemplo, la inhibición de ciertas vías de empalme en relación con otras puede automatizar el curso temporal de la diferenciación de precursores neuronales en células maduras, mientras que otros mecanismos especifican patrones de conectividad y propiedades eléctricas de las neuronas. En muchos tipos de células, las decisiones de empalme pueden tener un efecto beneficioso sobre la estructura y función de las proteínas, mientras que la elasticidad de estas vías ofrece a las células los medios para adaptarse rápidamente a los cambios locales en el entorno coordinando sus salidas de proteínas.

El laboratorio de Grabowski está explorando actualmente cómo las vías de empalme exhiben elasticidad, que se ve por su capacidad de respuesta a la estimulación y el estrés ambientales. Hemos desarrollado el receptor NMDA R1 permeable al Ca 2+ como un sistema modelo para comprender la bioquímica subyacente a la elasticidad del empalme en las neuronas, y estamos ampliando nuestros experimentos a otros sustratos modelo en las células cancerosas. Abordamos el siguiente conjunto de preguntas utilizando enfoques de genética, bioquímica y genómica.

¿Qué actores clave en las vías de señalización se activan para responder a las señales ambientales y cómo se determina la especificidad del objetivo?

¿Cuál es la arquitectura de los códigos de empalme a nivel de los objetivos pre-ARNm y cómo responden estos códigos a las vías activadas?

¿Cómo se restablecen las vías de empalme después de que el estímulo externo se desvanece y qué controla la cinética de los mecanismos de restablecimiento?


El regulador de empalme de Drosophila sex-lethal inhibe directamente la traducción del mRNA 2 letal específico de macho.

La expresión específica de macho de la proteína letal específica de macho 2 (MSL-2) controla la compensación de la dosis en Drosophila. La expresión del gen msl-2 es inhibida en las hembras por Sex-lethal (SXL), una proteína de unión a ARN conocida por regular el empalme de pre-ARNm. Un intrón presente en la región no traducida 5 '(UTR) del ARNm de msl-2 contiene sitios de unión putativos de SXL y se retiene en las moscas hembras. Aquí mostramos que SXL juega un papel doble en la inhibición de la expresión de msl-2. La cotransfección de células de Drosophila Schneider con un vector de expresión SXL y un informador que contiene el 5 'UTR del mRNA msl-2 resultó en la retención del intrón 5' UTR y la acumulación eficiente del mRNA sin empalmar en el citoplasma, donde su traducción fue bloqueada por SXL , pero no por el intrón per se. Tanto el empalme como la inhibición de la traducción por SXL se recapitularon in vitro y se encontró que dependían de la unión de SXL a sitios de alta afinidad dentro del intrón, lo que demuestra que SXL regula directamente estos eventos. Nuestros datos revelan un mecanismo coordinado para la regulación de la expresión de msl-2 por el mismo factor regulador: SXL refuerza la retención de intrones en el núcleo y la posterior inhibición de la traducción en el citoplasma.


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9.5 Cómo se regulan los genes

Para que una célula funcione correctamente, las proteínas necesarias deben sintetizarse en el momento adecuado. Todos los organismos y células controlan o regulan la transcripción y traducción de su ADN en proteína. El proceso de activar un gen para producir ARN y proteínas se llama expresión génica. Ya sea en un organismo unicelular simple o en un organismo multicelular complejo, cada célula controla cuándo y cómo se expresan sus genes. Para que esto suceda, debe haber un mecanismo para controlar cuándo se expresa un gen para producir ARN y proteína, qué cantidad de proteína se produce y cuándo es el momento de dejar de producir esa proteína porque ya no se necesita.

Las células de los organismos multicelulares son células especializadas en diferentes tejidos que se ven muy diferentes y realizan diferentes funciones. Por ejemplo, una célula muscular es muy diferente de una célula hepática, que es muy diferente de una célula cutánea. Estas diferencias son consecuencia de la expresión de diferentes conjuntos de genes en cada una de estas células. Todas las células tienen ciertas funciones básicas que deben realizar por sí mismas, como convertir la energía de las moléculas de azúcar en energía en ATP. Cada célula también tiene muchos genes que no se expresan, y expresa muchos que no son expresados ​​por otras células, de modo que puede llevar a cabo sus funciones especializadas. Además, las células activarán o desactivarán ciertos genes en diferentes momentos en respuesta a cambios en el medio ambiente o en diferentes momentos durante el desarrollo del organismo. Los organismos unicelulares, tanto eucariotas como procariotas, también activan y desactivan genes en respuesta a las demandas de su entorno para que puedan responder a condiciones especiales.

El control de la expresión génica es extremadamente complejo. Las fallas en este proceso son perjudiciales para la célula y pueden conducir al desarrollo de muchas enfermedades, incluido el cáncer.

Expresión génica procariota frente a eucariota

Para comprender cómo se regula la expresión génica, primero debemos comprender cómo un gen se convierte en una proteína funcional en una célula. El proceso ocurre tanto en las células procariotas como en las eucariotas, solo que de formas ligeramente diferentes.

Debido a que los organismos procariotas carecen de núcleo celular, los procesos de transcripción y traducción ocurren casi simultáneamente. Cuando la proteína ya no es necesaria, la transcripción se detiene. Como resultado, el método principal para controlar qué tipo y cuánta proteína se expresa en una célula procariota es a través de la regulación de la transcripción del ADN en ARN. Todos los pasos posteriores ocurren automáticamente. Cuando se requiere más proteína, se produce más transcripción. Por lo tanto, en las células procariotas, el control de la expresión génica se encuentra casi en su totalidad a nivel transcripcional.

El primer ejemplo de tal control se descubrió utilizando mi. coli en las décadas de 1950 y 1960 por investigadores franceses y se llama el laca operón. los laca El operón es un tramo de ADN con tres genes adyacentes que codifican proteínas que participan en la absorción y el metabolismo de la lactosa, una fuente de alimento para mi. coli. Cuando la lactosa no está presente en el entorno de la bacteria, la laca los genes se transcriben en pequeñas cantidades. Cuando hay lactosa, los genes se transcriben y la bacteria puede utilizar la lactosa como fuente de alimento. El operón también contiene una secuencia promotora a la que se une la ARN polimerasa para comenzar la transcripción entre el promotor y los tres genes en una región llamada operador. Cuando no hay lactosa presente, una proteína conocida como represor se une al operador y evita que la ARN polimerasa se una al promotor, excepto en casos raros. Por tanto, se fabrica muy poco de los productos proteicos de los tres genes. Cuando la lactosa está presente, un producto final del metabolismo de la lactosa se une a la proteína represora y evita que se una al operador. Esto permite que la ARN polimerasa se una al promotor y transcriba libremente los tres genes, permitiendo que el organismo metabolice la lactosa.

Las células eucariotas, por el contrario, tienen orgánulos intracelulares y son mucho más complejas. Recuerde que en las células eucariotas, el ADN está contenido dentro del núcleo de la célula y allí se transcribe en ARNm. El ARNm recién sintetizado se transporta fuera del núcleo al citoplasma, donde los ribosomas traducen el ARNm en proteína. Los procesos de transcripción y traducción están físicamente separados por la membrana nuclear. La transcripción ocurre solo dentro del núcleo, y la traducción solo ocurre fuera del núcleo en el citoplasma. La regulación de la expresión génica puede ocurrir en todas las etapas del proceso (Figura 9.22). La regulación puede ocurrir cuando el ADN se desenrolla y se afloja de los nucleosomas para unirse a factores de transcripción (nivel epigenético), cuando el ARN se transcribe (nivel transcripcional), cuando el ARN se procesa y exporta al citoplasma después de su transcripción (nivel postranscripcional) , cuando el ARN se traduce en proteína (nivel de traducción), o después de que se ha elaborado la proteína (nivel postraduccional).

Las diferencias en la regulación de la expresión génica entre procariotas y eucariotas se resumen en la tabla 9.2.

  • La transcripción de ARN ocurre antes de la traducción de proteínas y tiene lugar en el núcleo. La traducción del ARN a proteína ocurre en el citoplasma.
  • El posprocesamiento del ARN incluye la adición de un casquete 5 ', una cola poli-A y la escisión de intrones y empalme de exones.

Conexión Evolution

Empalme de ARN alternativo

En la década de 1970, se observaron por primera vez genes que presentaban un empalme de ARN alternativo. El empalme alternativo de ARN es un mecanismo que permite que se produzcan diferentes productos proteicos a partir de un gen cuando se eliminan diferentes combinaciones de intrones (y en ocasiones exones) de la transcripción (figura 9.23). Este empalme alternativo puede ser aleatorio, pero más a menudo se controla y actúa como un mecanismo de regulación de genes, con la frecuencia de diferentes alternativas de empalme controladas por la célula como una forma de controlar la producción de diferentes productos proteicos en diferentes células, o en diferentes etapas de desarrollo. Ahora se entiende que el empalme alternativo es un mecanismo común de regulación de genes en eucariotas, según una estimación, el 70% de los genes en humanos se expresan como proteínas múltiples a través del empalme alternativo.

¿Cómo podría evolucionar el empalme alternativo? Los intrones tienen una secuencia de reconocimiento inicial y final, y es fácil imaginar la falla del mecanismo de empalme para identificar el final de un intrón y encontrar el final del siguiente intrón, eliminando así dos intrones y el exón intermedio. De hecho, existen mecanismos para prevenir tal omisión de exón, pero es probable que las mutaciones conduzcan a su falla. Es muy probable que tales "errores" produzcan una proteína no funcional. De hecho, la causa de muchas enfermedades genéticas es un empalme alternativo en lugar de mutaciones en una secuencia. Sin embargo, el empalme alternativo crearía una variante de proteína sin la pérdida de la proteína original, abriendo posibilidades de adaptación de la nueva variante a nuevas funciones. La duplicación de genes ha jugado un papel importante en la evolución de nuevas funciones de manera similar, proporcionando genes que pueden evolucionar sin eliminar la proteína funcional original.


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Centro de Biología Vascular

El objetivo a largo plazo de mi investigación es ayudar a desentrañar la interacción compleja entre las células inmunes reclutadas y el revestimiento endotelial de la vasculatura en la inflamación crónica, con un enfoque en el empalme alternativo y los cambios en la matriz subendotelial como determinantes críticos de esa interacción. . Nuestros usos de investigación en vivo y in vitro modelos de los efectos del flujo bajo y alterado en el endotelio arterial, cuyas fuerzas físicas impulsan la enfermedad vascular subyacente al ataque cardíaco y al accidente cerebrovascular.

Como becario postdoctoral en el laboratorio del Dr. Richard Hynes en el MIT, examiné la regulación de la fibronectina, una proteína de la matriz extracelular que se encuentra en abundancia en los sitios de lesión vascular. El análisis de la expresión de ARNm de fibronectina en respuesta a un flujo bajo y alterado en el endotelio arterial reveló un cambio de empalme que resultó en la inclusión de dos exones alternativos ampliamente conservados.

Utilizando modelos genéticos, demostré que este interruptor de empalme protege contra la disección hemorrágica de la pared del vaso arterial con flujo bajo y alterado.

El empalme se reconoce cada vez más como un contribuyente importante a las enfermedades humanas. Las variaciones resultantes de cambios en el empalme pueden producir proteínas con funciones completamente nuevas. Aunque una serie de proteínas endoteliales críticas se empalman alternativamente, se sabe poco acerca de la regulación y función del empalme alternativo en el endotelio.

Nuestro trabajo aplica en vivo y in vitro modelos para examinar las interacciones de señalización entre las células inmunes y la pared arterial bajo flujo perturbado, y los eventos de empalme alternativos que regulan estas interacciones.

Trabajamos en estrecha colaboración con un grupo de talentosos investigadores en Biología e Inmunología Vascular para lograr nuestros objetivos, dentro del Centro de Biología Vascular y el Centro de Cardiología Calhoun y los colaboradores del Grupo Inmuno-Cardiovascular.

Proyecto 1: Análisis del empalme alternativo en la inflamación arterial impulsada por el flujo

Regulación del ARN en el endotelio con flujo alterado

Figure shows the consistency in gene expression and in splicing response among different biological replicates of endothelium exposed to low flow in vivo

Using an established model of flow-induced arterial injury, we have recently performed large scale RNA-sequencing analysis of an endothelial enriched fraction in normal and disturbed flow conditions. We have identified thousands of changes in alternative splicing, and a handful of potential upstream regulatory splice-factors. A large portion of these splicing changes are responsive to the recruitment of innate immune cells. We have mouse lines for the conditional deletion of three of these splice factors from the endothelium, allowing us to assess their functions en vivo.

This project involves phenotypic analysis of the consequences of perturbing these splice factors en vivo, with an emphasis on understanding the effects on immune response.

Project 2: Alternative splicing in cross-talk with myeloid cell

Macrophages co-cultured with splicing-mutated endothelial cells

Figure shows a DIC image of an aortic endothelial cell monolayer, which is overlaid with bone marrow derived monocytes from a reporter mouse (red). Profiling of the co-cultured monocytes and their differentiated progeny has revealed striking differences in phenotype, depending on the alternative splicing status of the endothelial cells they are cultured on.

We have developed methods for the conditional expansion of aortic endothelial cells in culture. These cells, and versions of these cells with alterations in specific splice factors or alternatively spliced genes are being used in co-culture experiments with myeloid cells. Pilot experiments have shown strong effects on the phenotype of wild-type myeloid cells cultured with endothelial cells altered in either the expression of the splice factors we have identified en vivo, or the alternative splicing events they regulate. This interesting result suggests how splicing responses in the endothelium, which are responsive to innate immune cell recruitment, shape chronic inflammation in arterial injury and likely other inflammatory processes as well.

This project involves in vitro culture of endothelial cells with mutations in the alternative splicing response, and the isolation and characterization of immune cells by FACs and molecular biology.

Project 3: Identification of splice regulators by candidate screen

Figure shows the relative level of alternative exon inclusion (increasing from left to right) by flow cytometry. Red=baseline, yellow=mutant cells, with impaired inclusion, blue=wild-type cells, with normal inclusion.

The list of regulatory splice factors identified en vivo was done by bioinformatics – specifically an enrichment in the regulatory motifs they bind to among the regulated splicing events. While this has revealed a clear role for the splice factors we are testing in Project 1, we have a handful of other factors which have been less characterized are therefore very interesting. We have established a method to screen the function of these factors in the regulation of a few key splicing events by flow cytometry. This screen will allow us to identify factors that result in either the increased or the decreased inclusion of specific exons in the final RNA in primary and cultured aortic endothelial cells.

This project involves pooled screens, using shRNA and CRISPR depletion approaches, to determine which factors affect the splicing response. We will be using FACs as the screen, and NextGen sequencing enrichment as the readout. "Hits," or novel regulators of splicing, will then be further interrogated in vitro and potentially en vivo.

Project 4: Regulation of NF-kappa B signaling by alternative splicing

For the vast majority of alternative splicing events we have identified, the function remains unknown. However, many of them target key processes in endothelial cells. One of the processes we are most interested in is NF-kappaB signaling. This pathway has a pivotal role in the response of the vascular endothelium to low and disturbed flow, and thus alterations of this pathway induced by changes in splicing are likely to impact the response of the vasculature to chronic flow-induced injury. We will examine these splice variants in our in vitro model, to determine which impact NF-kappaB induction, and then define the mechanism for this regulation.

This project involves the expression cDNA encoding the splice variants, and shRNA or CRISPR mediated suppression of specific splice isoforms. Outcomes will be assessed in a pooled fashion, using murine and human aortic endothelial cells engineered to express NF-kappaB reporters.

<--Molecular components of the NF-kappa B signaling pathway.

Figure reprinted by permission from Macmillan Publishers Ltd: Nature Reviews Molecular Cell Biology, 8, 49-62 (doi:10.1038/nrm2083), copyright 2007

Patrick Murphy
Principal Investigator

Amy Kimble
Research Assistant II

Jess Hensel
Estudiante graduado

Sarah-Anne Nicholas
Estudiante graduado

We are looking for talented researchers to join our team at all levels.

September 2016 - the Murphy lab is up and running!

July 2018 - Congratulations Jess on passing your qualifying exam with flying colors.

October 2018 - Thanks to the North American Vascular Biology Organization, for recognizing Sarah-Anne's work with a Travel Award to the 2018 meeting.

October 2018 - Nice work Jess, on winning a poster prize at the 2018 North American Vascular Biology Organization meeting in Newport!

April 2019 - Congratulations Maria Xu, on your graduation from the Ph.D. phase of your program. I look forward to hearing about your next accomplishments, it was a pleasure working with you and Dr. Vella to uncover new ways in which activated T cells are retained and re-activated within atherosclerotic plaque.

May 2019 - Thank you, to the American Heart Association, for the 2019 Innovative Project Award to apply our screening approach to identify endothelial RNA-binding proteins involved in the regulation of inflammatory responses.

June 2019 - Congratulations Sarah-Anne on passing your qualifying exam, I'm looking forward to your outstanding PhD work!

September 2019 - Happy to share my thoughts on the post-doc to faculty transition through the North American Vascular Biology Organization "Lessons Learned" NAVBO has been a key component of my success in research and I am happy to have a chance to give back!

September 2019 - We appreciate the recognition by the North American Vascular Biology Organization as "Lab of the Month".

Dec 2019 - Thank you, to the American Heart Association, for funding Sarah-Anne's graduate work on endothelial Elavl1 functions in adaptive immune responses.

Dec 2019 - Thank you, to the American Heart Association, for funding Jess's graduate work on the regulation of NFkB responses by RNA-binding proteins.

May 2020 - We were honored to be considered a finalist for the Irvine H. Page Junior Faculty Research Award from the American Heart Association, and congratulations to Hanrui Zhang of Colombia on winning the award.

May 2020 - Thank you, American Heart Association, for the Paul Dudley White International Scholar Award for the top ranked submitted abstract from a United States lab to the 2020 Vascular Discovery Meeting.

August 2020 - We are grateful for RF1 funding ($2.2M) from the NIH's National Institute of Neurological Disorders and Stroke, to support our work on splice factor function in the endothelial cells of the blood brain barrier in Alzheimer's and related diseases. We are incredibly enthusiastic about pushing boundaries over the next five years in work with our collaborators Riqiang Yan (UCONN Health), Li Gan (Weill Cornell) and Chris Schaffer (Cornell). ¡Mira este espacio!

September 2020 - excited to present three different projects at the North American Vascular Biology conference, and to hear about other exciting work on immune cell interactions with the endothelium, and endothelial contributions to atherosclerosis and neurodegenerative disease.

October 2020 - congratulations Sarah-Anne, on a great talk at the 2020 NAVBO meeting, and congratulations Jess on a great poster presentation, and a poster award!



Comentarios:

  1. Llacheu

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  2. Abdul- Sami

    La excelente y debidamente respuesta.

  3. Hanan

    Perdón por Offtopic, ¿puedes decirme dónde puede obtener la misma plantilla de bonita para un blog?



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