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¿Se puede hablar de desacetilación de un promotor en lugar de histona asociada?

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Estoy confundido con un detalle de un artículo que estoy leyendo y no estoy seguro de si estoy entendiendo mal la redacción o el concepto. Incluyo el resumen completo de este artículo como fondo:

Regulación epigenética de la biología uterina por el factor de transcripción KLF11 a través de la desacetilación de histonas postraduccionales de las enzimas metabólicas del citocromo p450.

Zheng Y, Tabbaa ZM, Khan Z, Escolar JK, El-Nashar S, Famuyide A, Keeney GL, Daftary GS.

Abstracto:

La regulación endocrina de la biología uterina es fundamental para la receptividad del embrión y la reproducción humana. El endometrio uterino depende de la entrada de esteroides sexuales extrínsecos y, por lo tanto, es probable que tenga mecanismos que permitan la adaptación a la variación hormonal. La evidencia emergente sugiere que la biodisponibilidad de los esteroides sexuales en el endometrio se determina ajustando su tasa metabólica y su destino mediante la regulación de las enzimas del citocromo (CYP) p450. Las enzimas CYP son el objetivo de factores de transcripción de tipo Sp / Krüppel (Sp / KLF) expresados ​​de forma ubicua. Específicamente, KLF11 se expresa en gran medida en los tejidos reproductivos, regula una serie de vías endocrinas / metabólicas a través de mecanismos epigenéticos basados ​​en histonas y, cuando se expresa de manera aberrante, se asocia con diabetes y enfermedades del tracto reproductivo, como el leiomioma y la endometriosis. Utilizando KLF11 como modelo para investigar la regulación epigenética del metabolismo de primer paso del endometrio, evaluamos la expresión de una amplia gama de enzimas metabólicas en las células de Ishikawa. KLF11 reprimió la mayoría de las enzimas CYP endometriales. Para caracterizar los mecanismos reguladores epigenéticos reclutados por KLF11, nos centramos en la enzima metabolizadora de estrógenos CYP3A4. La expresión de KLF11 disminuyó en el epitelio endometrial de la fase secretora asociada con un aumento de la expresión de CYP3A4. Además, KLF11 se unió a los elementos GC del promotor CYP3A4 y, por lo tanto, reprimió el promotor, el mensaje, la proteína y la función enzimática. Esta represión fue mediada epigenéticamente, porque KLF11 colocalizó y reclutó el correpresor SIN3A / histona desacetilasa dando como resultado la desacetilación selectiva del promotor CYP3A4. La represión fue revertida por una mutación en KLF11 que derogó el reclutamiento y la unión del cofactor. Esta represión también fue farmacológicamente reversible con un inhibidor de histona desacetilasa. La alteración farmacológica del metabolismo endometrial podría tener implicaciones traslacionales a largo plazo sobre la reproducción humana y la enfermedad uterina.

Citación:

Zheng Y, Tabbaa ZM, Khan Z, Schoolmeester JK, El-Nashar S, Famuyide A, et al. Regulación epigenética de la biología uterina por el factor de transcripción KLF11 a través de la desacetilación de histonas postraduccionales de las enzimas metabólicas del citocromo p450. Endocrinología. 2014; 155: 4507-20.

Mi pregunta está en la cuarta a última oración de este resumen específicamente:

"Esta represión fue mediada epigenéticamente, porque KLF11 colocalizó y reclutó el correpresor SIN3A / histona desacetilasa dando como resultado la desacetilación selectiva del promotor CYP3A4".

Esta oración parece decir que SIN3A / histona desacetilasa desacetila el propio promotor CYP3A4 (es decir, desacetila directamente una región del ADN). Sin embargo, ¿no debería una histona desacetilasa desacetilar una histona, no una región del ADN? ¿Estoy entendiendo mal el mecanismo? ¿O es "desacetilación del promotor CYP3A4" realmente una forma abreviada de decir "desacetilación de una histona que está asociada con el promotor CYP3A4"?

¡Gracias de antemano por tu ayuda!


Los autores obviamente querían escribir que las histonas asociadas con el promotor se desacetilan. No pueden referirse al promotor en sí mismo, ya que es ADN.

Lo que escribieron no es taquigrafía o uso alternativo aceptable, sino simplemente un error: los artículos publicados a menudo contienen errores tipográficos y de este tipo. Probablemente los autores tenían la intención de escribir la forma técnicamente correcta de las palabras, pero perdieron una frase. O tal vez habían excedido el límite del número de palabras permitidas en el resumen, por lo que pasaron por el recorte, pero recortaron demasiado.

¿Por qué los árbitros no recogieron esto? Por supuesto que deberían haberlo hecho, pero probablemente estaban más preocupados por el contenido del artículo y si los experimentos descritos por los autores justificaban sus conclusiones. Son científicos ocupados y probablemente están haciendo el trabajo de forma voluntaria.

En conclusión, los científicos son humanos, la escritura científica es difícil y todos cometemos errores. Sin embargo, debemos tratar de transmitir nuestras ideas lo más claramente posible y, ciertamente, no copiar algo que sea técnicamente incorrecto o ambiguo, solo porque se haya publicado.


Se trata de interacciones ADN-proteína. La región promotora del ADN interactúa con las modificaciones de las histonas, que están controladas por otras proteínas.


Arabidopsis histona desacetilasa 6: un enlace verde al silenciamiento del ARN

La reprogramación epigenética es la base del inicio y la progresión del cáncer. En general, la reducción en todo el genoma de la metilación de citosina contrasta con la hipermetilación de las regiones de control de genes supresores de tumores funcionalmente bien establecidos y muchos otros genes cuyo papel en la biología del cáncer aún no está claro. Si bien la comprensión de los mecanismos que inducen la metilación aberrante de la citosina en las células cancerosas apenas está comenzando a surgir, las señales de inicio de la metilación del promotor análogo en las plantas están bien documentadas. En Arabidopsis, el silenciamiento de los promotores requiere componentes de la maquinaria de interferencia del ARN y del ARN de doble hebra del promotor (ARNdc) para inducir un estado represivo de cromatina que se caracteriza por metilación de citosina y desacetilación de histonas catalizadas por la histona desacetilasa de tipo RPD3 AtHDA6. Se ha demostrado que se producen mecanismos similares en las levaduras de fisión y los mamíferos. Esta revisión se centra en las conexiones entre la metilación de citosina, el dsRNA y la desacetilación de histonas controlada por AtHDA6 durante el silenciamiento del promotor en Arabidopsis y analiza las similitudes mecánicas potenciales de estos eventos de silenciamiento en células cancerosas y vegetales.


Fondo

Los cambios ambientales repentinos pueden desencadenar cambios rápidos y dramáticos en la expresión genómica. Esto implica la expresión coordinada de cientos a miles de genes, cuya expresión se modula con precisión en el tiempo y la magnitud. Muchos factores de transcripción diferentes funcionan en la célula en un momento dado y responden a distintas señales ascendentes. Por lo tanto, las células deben integrar la acción de numerosas señales y factores reguladores para producir un programa de expresión genómica coherente personalizado para cada nuevo entorno.

Las levaduras responden al estrés en parte iniciando la Respuesta al Estrés Ambiental (ESR), que consta de aproximadamente 600 genes cuya expresión está reprimida y aproximadamente 300 genes cuya expresión es inducida por diversos estreses [1, 2]. Los genes reprimidos incluyen aproximadamente 130 genes de proteína ribosómica ('RP') y un grupo distinto de aproximadamente 450 genes relacionados más ampliamente con la síntesis de proteínas ('genes PS'). Ambos grupos están altamente expresados ​​en células en crecimiento activo pero fuertemente reprimidos, con perfiles de expresión ligeramente diferentes, en respuesta al estrés. Los genes inducidos en la ESR ('genes iESR') están involucrados en diversos aspectos de la defensa del estrés, incluida la regulación redox, el plegamiento de proteínas, la osmo-tolerancia, la señalización celular y otras funciones. La iniciación de la VSG no es necesaria para sobrevivir al estrés ofensivo, sino que ayuda a proteger las células contra dosis severas posteriores del mismo o diferente estrés (aunque no puede explicar completamente la resistencia adquirida al estrés en todos los casos) [3].

Aunque se activa por muchas tensiones diferentes, la ESR se regula de manera diferente según el entorno. Numerosas vías de señalización en sentido ascendente se han implicado en la regulación de la ESR específica de la condición, incluido el glicerol de alta osmolaridad (HOG) [4] (Jessica Clarke y APG, datos no publicados), MEC [5] y la proteína quinasa C (Scott Topper y APG, vías no publicadas) en respuesta al choque osmótico, daño del ADN o agentes reductores, respectivamente, y las vías de la proteína quinasa A y la diana de la rapamicina (TOR) en el alivio del estrés [6-10] (revisado en [11]). Además, diferentes subconjuntos de genes iESR pueden ser inducidos por factores de transcripción específicos del estrés, como el factor de estrés oxidativo Yap1p [1], el factor de choque térmico Hsf1p [12-14], Sko1p y Hot1p bajo estrés osmótico [15-18 ], y los factores de transcripción de 'estrés general' Msn2p y Msn4p en respuesta a diversos estreses (revisado en [11]). Sin embargo, se sabe poco acerca de cómo se integran estas señales para mediar la iniciación de la ESR, o cómo los genes reprimidos en la ESR se coordinan con los genes inducidos en el programa.

Un mecanismo de alteración de la expresión génica es a través de cambios en el estado de la cromatina. La histona desacetilasa Rpd3p desacetila las histonas tanto en las regiones codificantes como no codificantes, donde se cree que funciona en al menos dos complejos distintos (revisado en [19, 20]). Un pequeño complejo (Rpd3S) suprime el inicio de la transcripción críptica desacetilando histonas después de alargar la polimerasa [21-23]. Rpd3S se recluta a través de la acción combinada de las subunidades Eaf3p y Rco1p a la histona H3 metilada por Set2p durante la transcripción del marco de lectura abierto [21-23]. Por el contrario, un gran complejo (Rpd3L) es reclutado para los promotores por proteínas de unión al ADN específicas del sitio, incluida la subunidad Ume6p de Rpd3L, donde se cree que funciona en el inicio de la transcripción [23-27]. Se sabe que Rpd3p se une a diferentes promotores en diferentes condiciones, como el tratamiento de choque frío y rapamicina [28-30]. De hecho, muchos promotores a los que se relocaliza Rpd3p son de genes reprimidos en la ESR. Los efectos de Rpd3p en estos promotores no se han demostrado a escala global, pero el resultado sugiere que se requiere Rpd3p para la represión dependiente del estrés de los genes ESR [11, 30].

Aunque tradicionalmente están vinculadas a la represión, las histonas desacetilasas también pueden funcionar durante la activación de genes [31-36]. La inducción de varios genes de levadura diferentes requiere Rpd3p después del tratamiento con sal, hipoxia o daño del ADN [32-34]. El mecanismo preciso no está claro, pero requiere Rpd3p para el reclutamiento de la ARN polimerasa a los promotores de genes (incluidos los genes iESR) inducidos por choque osmótico y daño en el ADN [32, 34]. Además, la inducción de genes hipóxicos requiere la desacetilación de histonas dependiente de Rpd3p para el desplazamiento del nucleosoma y la unión estable del factor de transcripción Upc2p dentro de las regiones reguladoras de los genes [33]. El hecho de que Rpd3p se haya relacionado con la inducción y represión de genes dependientes del estrés planteó la posibilidad de que Rpd3p participe en la regulación de genes tanto inducidos como reprimidos dentro de la ESR.

De hecho, aquí mostramos que se requiere Rpd3p para la iniciación adecuada de la ESR, incluida la regulación normal de genes tanto inducidos como reprimidos, en levaduras que responden a múltiples tensiones. Falta de células RPD3 o la subunidad Rpd3L PHO23 tenía un defecto importante, específicamente durante la fase transitoria inmediatamente después de H2O2 tratamiento, mientras que las células que carecen de la subunidad Rpd3S RCO1 No. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en genes de ESR candidatos reveló que Rpd3p se mueve a numerosos promotores bajo estrés para mediar la desacetilación de histonas; sin embargo, el patrón preciso de cambio de cromatina fue diferente para los diferentes nucleosomas y genes investigados. Mostramos que Rpd3p se une directamente a genes inducidos por estrés y es necesario para la unión normal de Msn2p a numerosos promotores. En conjunto, este trabajo implica a Rpd3L como un cofactor importante en la red reguladora de ESR.


Resultados

Las estructuras G4 marcan a los promotores con una mayor ocupación de Pol II

Para investigar si el proceso de transcripción modula la formación de la estructura G4 en la cromatina, utilizamos la línea celular de leucemia mielógena crónica humana K562 ampliamente caracterizada como un sistema modelo [13]. La formación de la estructura G4 se determinó mediante G4 ChIP-seq [14], la accesibilidad a la cromatina mediante ATAC-seq (ensayo de cromatina accesible a transposasa mediante secuenciación) y la ocupación de Pol II mediante Pol II ChIP-seq (Fig. 1a). Consenso, los G4 endógenos se definieron como picos de G4 ChIP-seq presentes en al menos dos de cada tres réplicas biológicas (correlación de Pearson R & gt 0,96). La mayoría de los picos de consenso G4 (& gt 75%) comprenden motivos de secuencia G4 que se ha demostrado de forma independiente que se pliegan en una estructura G4 in vitro, mediante un ensayo de estancamiento de la ADN polimerasa (G4-seq Archivo adicional 1: Fig. S1A) [15 ]. En las células K562, los G4 de consenso estaban altamente enriquecidos en promotores (definidos como TSS ± ​​500 pb Archivo adicional 1: Fig. S1B), en lo sucesivo denominados promotores G4. El promotor G4 marcó genes con una expresión significativamente mayor en comparación con los promotores que carecen de una estructura G4 (pag & lt 2.2 × 10 - 16 Archivo adicional 1: Fig. S1C RNA-seq dataset GEO no de acceso. GSE88473). ATAC-seq en tres réplicas biológicas independientes (correlación de Pearson R & GT 0,98) reveló además que la mayoría de todos los G4 de consenso (88,2%) se encontraban en NDR (archivo adicional 1: Fig. S1D) como se ejemplifica por MI C y KRAS promotor G4s (Fig. 1b). Estos resultados corroboran nuestras observaciones anteriores, en células HaCaT y queratinocitos primarios [5] y apoyan que los G4 endógenos se encuentran principalmente dentro de la cromatina abierta en los promotores. Dado que el promotor endógeno G4 marca una transcripción elevada, como primer paso, determinamos la ocupación de Pol II en dichos genes. Usando la secuenciación de ChIP Pol II (5 réplicas biológicas de la correlación de Pearson R & gt 0,99), observamos una ocupación de Pol II significativamente mayor en los promotores con un G4 endógeno en comparación con aquellos sin (pag & lt 2,2 × 10 - 16 Fig. 1c). Para dilucidar cómo la formación de G4 puede verse influenciada por la transcripción activa y si la formación de G4 es promovida por un entorno de cromatina más abierto frente a compactado, hemos centrado la mayoría de los siguientes estudios exclusivamente en el promotor G4 (TSS ± ​​500 pb) ocupado por Pol II.

La transcripción no es necesaria para la formación de G4 en los promotores. a Descripción general del diseño experimental. Negro, datos generados en este estudio azul, conjuntos de datos publicados de RNA-seq. B Ejemplos representativos de pistas genómicas G4 ChIP-seq en células K562 para MI C y KRAS. De arriba a abajo, las pistas muestran la señal G4 ChIP-seq (amarillo), el control de entrada G4 ChIP-seq (amarillo), la señal ATAC-seq (verde) y los motivos de secuencia que pueden formar G4 in vitro (definidos como sitios G4-seq, ver árbitro [15]) en la hebra delantera (+ ss) o inversa (−ss) (azul). La señal se cuantifica como recuento por millón (CPM). C Diagrama de caja de la señal ChIP-seq Pol II (log2CPM) en los promotores (TSS ± ​​500 pb) en cromatina accesible (ATAC +) con un G4 endógeno (G4 ChIP +) o sin un G4 (G4 ChIP−) pero con motivos de secuencia que pueden plegarse en estructuras G4 in vitro (G4- seq). Prueba de Wilcoxon: pag & lt 2,2 × 10 - 16. D Representación gráfica de la formación de G4 y los experimentos de inhibición transcripcional. mi Western blot para Pol II Ser2-P y Pol II total de células K562 tratadas con o sin DRB 100 μM durante 1 h. ß-actina proporciona el control de carga. F Gráfico de Bland Altman (MA) que muestra el cambio de veces en la señal G4 ChIP-seq en los promotores entre las células K562 tratadas con DRB frente a las tratadas con DMSO. Estadísticamente significante (pag & lt 0.01) las señales más altas y más bajas están en rojo y azul, respectivamente, los puntos negros indican que las regiones no cambian. gramo Western blot para Pol II Ser5-P y Pol II total para células K562 tratadas con o sin triptolida 10 μM (TPL) durante 30 min o 2 h. ß-actina proporciona el control de carga. h Gráfico MA similar al panel F que ilustra el cambio de veces en la señal G4 ChIP-seq en los promotores entre las células K562 tratadas con TPL y las no tratadas (pag & lt 0.01)

La formación del promotor G4 no requiere transcripción activa

Evaluamos directamente si la transcripción activa es necesaria para la formación del promotor G4, como se ha sugerido [12, 16], midiendo si la inhibición de la transcripción causa la pérdida de G4 (Fig. 1d). Para inhibir el alargamiento de la transcripción, las células K562 se trataron con el inhibidor de CDK9 5,6-diclorobenzimidazol 1-β-d-ribofuranósido (DRB) para evitar la liberación de Pol II pausada [17, 18]. El tratamiento con DRB (1 h) disminuyó la fosforilación de Pol II en la serina 2 sin efecto sobre los niveles generales de Pol II, como se ve por Western blot (Fig. 1e), lo que confirma el mecanismo inhibidor esperado. Las células tratadas con DRB y los controles tratados con DMSO se sometieron a G4 ChIP-seq. El promotor G4 en células tratadas con DRB versus DMSO no mostró cambios estadísticamente significativos en la señal de G4 ChIP en la mayoría de los sitios (pag & lt 0.01 5/4023, 0.1% hacia arriba, 136/4023, 3.4% hacia abajo Fig. 1f). Por tanto, la inhibición del alargamiento dependiente de Pol II no conduce a la pérdida de la formación de G4 en los promotores, sino que el plegamiento de G4 en los promotores debe preceder al alargamiento productivo de la transcripción.

Para evaluar si la inhibición del inicio de la transcripción causa la pérdida del promotor G4, utilizamos triptolida (TPL), que inhibe covalentemente la helicasa XPB asociada a Pol II [19]. Como se observa por transferencia Western, el tratamiento con TPL de 2 h conduce a una pérdida sustancial de la fosforilación de la serina 5 Pol II y una pérdida general de los niveles de proteína Pol II (Fig. 1g). Sin embargo, la inhibición de TPL no disminuyó significativamente la señal global del promotor G4-ChIP (pag & lt 0.01 11/4268 hacia abajo, 0.3% Fig. 1h). Por el contrario, un número significativo (pag & lt 0,01 449/4268 arriba, 10,5%) del promotor G4 mostró un aumento de la señal G4 después del tratamiento con TPL. Esto contrasta con los experimentos en células de adenocarcinoma humano que no mostraron alteraciones de G4 después del tratamiento con TPL [20]. Nuestra observación del aumento de la formación de G4 en los promotores después del tratamiento con TPL es probable que surja de la abrogación de la actividad helicasa de las helicasas XPB / XPD que resuelven G4 [19, 21]. En contraste con trabajos anteriores que sugerían que el plegamiento de G4 es promovido por la transcripción activa a través de la generación de ADN monocatenario [12], nuestros resultados sugieren que la transcripción activa no es necesaria para el plegamiento de G4 en los promotores.

El plegamiento del promotor endógeno G4 es sensible a la compactación de la cromatina

Dada la inhibición transcripcional no elimina el promotor G4 en la cromatina, y dado que la relajación de la cromatina por inhibición de la histona desacetilasa puede aumentar su formación [5], planteamos la hipótesis de que el estado de la cromatina puede regular la formación del promotor G4. Para explorar esto, usamos hipoxia para manipular el estado de la cromatina (Fig. 2a). La hipoxia induce la compactación global de la cromatina [22, 23] caracterizada por un aumento de la expresión de la proteína de heterocromatina HP1BP3 [24], una metilación elevada de la histona H3 lisina 9 (H3K9me3) [25] y una reducción de la acetilación de las histonas [26]. Las células K562 se expusieron a condiciones de hipoxia aguda (1% de oxígeno, 1 h). La hipoxia fue confirmada por Western Blot para la inducción del factor 1α inducible por hipoxia [27] (Fig. 2b).La compactación de la cromatina en todo el genoma tras la hipoxia se demostró por una disminución de la sensibilidad a la digestión por nucleasa microcócica [28] (archivo adicional 1: Fig. S2A). Además, en la cromatina hipóxica, ATAC-seq mostró un mayor tamaño de los fragmentos de acuerdo con la compactación de la cromatina (archivo adicional 1: Fig. S2B). La validación adicional de la inducción de hipoxia fue dada por la disminución de la ocupación de Pol II visto en genes que se sabe que tienen expresión reducida en células K562 hipóxicas [29] (Archivo adicional 1: Fig. S2C).

La compactación de la cromatina disminuye el plegamiento del promotor G4. a Representación gráfica del diseño experimental que examina G4, transcripción y compactación de cromatina inducida por hipoxia. B Western blot para HIF1α de células K562 cultivadas en condiciones normóxicas o hipóxicas. ß-actina proporciona el control de carga. C Accesibilidad de la cromatina en los promotores en condiciones normóxicas. Panel superior, gráfico de metagen para la mediana de la señal ATAC normalizada (3 réplicas biológicas) centrada en el TSS en condiciones normóxicas. Verde, promotores de genes activos con un azul G4 (Pol II + G4 +), genes activos sin un promotor G4 (Pol II + G4 -). Panel inferior, datos trazados para loci individuales y representados por mapas de calor. d – f Gráficos MA que muestran el cambio de veces en la señal ATAC-seq (D), Señal G4 ChIP-seq (mi) y la señal ChIP-seq Pol II (F) después de la hipoxia en los promotores activos con un G4 (Pol II + G4 +). Azul y rojo, sitios con señal significativamente reducida o aumentada respectivamente (pag & lt 0,05). Recuento de lecturas de CPM por millón. gramo Vista genómica de EIF4E-BP1 y KCTD5 ejemplifican genes que cambian significativamente en los picos ATAC-seq (verde), Pol II ChIP-seq (negro) y G4 ChIP-seq (amarillo). Las pistas comparan picos entre hipoxia y normoxia. Las coordenadas genómicas indican el rango de seguimiento y la señal se cuantifica como recuentos por millón (CPM). En todos los paneles, la normoxia se refiere a células cultivadas en 21% de O2 e hipoxia se refiere a las células expuestas al 1% de O2 por 1 h

Primero determinamos el estado de la cromatina de los promotores de genes activos en normoxia (21% O2) por ATAC-seq y encontró que los promotores marcados con G4 (es decir, Pol II + G4 +) se encuentran en una cromatina más accesible en comparación con sus homólogos activos no marcados con G4 (es decir, Pol II + G4 -) (Fig.2c). La inducción de hipoxia resultó en una reducción significativa en la intensidad de la señal de ATAC-seq en la mayoría de los sitios del promotor G4 (pag & lt 0,05 7920/9217 hacia abajo, 85,9% Fig. 2d). En comparación, los promotores no marcados con G4 muestran mucha menos compactación de la cromatina (archivo adicional 1: Fig. S2D). Después de la inducción de hipoxia, aproximadamente una quinta parte del promotor G4 mostró una disminución estadísticamente significativa en la intensidad de la señal (pag & lt 0,05 1105/5558 hacia abajo, 19,9% Fig. 2e), lo que indica que muchos promotores G4 son sensibles a la compactación de la cromatina. A continuación, validamos el principio general de pérdida de G4 en la compactación de cromatina asociada a hipoxia mediante el uso de una línea celular adicional no relacionada. La hipoxia aguda en las células U2OS de osteosarcoma humano también indujo la compactación de la cromatina y condujo a una reducción de la intensidad de la señal G4 en los promotores (pag & lt 0.05 6150/8505 abajo, 72,3% Archivo adicional 1: Fig. S3).

En las células hipóxicas K562, también observamos una pérdida significativa de la intensidad de la señal Pol II general en los promotores Pol II + G4 + (pag & lt 0.05 1348/8307 abajo, 16.2% Fig. 2f), con la pérdida de Pol II ocurriendo casi por completo en sitios donde G4s fueron disminuidos (Archivo adicional 1: Fig. S2E). Estos hallazgos se ejemplifican mediante las vistas del navegador del genoma en la Fig. 2g. Por el contrario, hubo una pérdida insignificante de Pol II en Pol II + G4 - promotores (archivo adicional 1: Fig. S2F). Por tanto, la compactación de la cromatina provoca una pérdida de muchos promotores G4 con la pérdida concomitante de Pol II.

La estabilización de G4 por moléculas pequeñas contrarresta la pérdida de G4 y Pol II en la hipoxia

Para analizar directamente si la estabilización de G4 afecta la formación de G4 en la hipoxia, visualizamos focos de G4 nucleares [30] utilizando células U2OS, ya que las células K562 no eran susceptibles de obtener imágenes de G4. pyPDS, un análogo de PDS con lipofilicidad mejorada (clogP PDS 2.35, pyPDS 4.79, calculado usando MarvinSketch versión 20.19.0), se utilizó para estabilizar G4s [31, 32] (Archivo adicional 1: Fig. S4A). En hipoxia sin pyPDS, la intensidad de la señal G4 global y el número de focos G4 se redujeron (pag & lt 0.0001, archivo adicional 1: Fig. S5). Sin embargo, con la adición de pyPDS, se perdieron menos G4 (pag & lt 0,0001), que muestra que la estabilización de G4 protege a los G4 del despliegue en hipoxia.

Dado que la compactación de la cromatina conduce a una pérdida de Pol II en los sitios donde los promotores G4 están disminuidos, evaluamos si la persistencia inducida de las estructuras G4 en la hipoxia causada por la estabilización de G4 podría causar la retención de la unión de RNA Pol II (Fig. 3a). Utilizando ATAC-seq con células K562, primero confirmamos que el tratamiento con pyPDS no alteró apreciablemente la accesibilidad a la cromatina en normoxia y que la compactación de la cromatina todavía se produce en condiciones hipóxicas (Fig. 3b, archivo adicional 1: Fig. S4B). Para los promotores Pol II + G4 +, encontramos que el tratamiento con pyPDS redujo la pérdida de Pol II en 10 veces en hipoxia en comparación con las células tratadas con DMSO (10,6% frente a 1,2% respectivamente, pag & lt 0.05 Fig. 3c, d Archivo adicional 1: Fig. S4C-D). Estos hallazgos se ejemplifican mediante las vistas del navegador del genoma para los promotores de los reguladores de la cromatina. BRD4 y CBX1 (Figura 3e). Además, no se observaron cambios en Pol II con el tratamiento de pyPDS en normoxia (archivo adicional 1: Fig. S4E), o en promotores no marcados con G4 en células hipóxicas tratadas con pyPDS (archivo adicional 1: Fig. S4F). Estos resultados descartan efectos no específicos asociados a ligandos sobre el reclutamiento de Pol II. Por tanto, la persistencia inducida de una estructura G4, que de otro modo se perdería durante la compactación de la cromatina, provoca la retención de la unión de Pol II.

La estabilización de G4 en cromatina compactada retiene la ocupación del promotor Pol II. a Representación gráfica del diseño experimental que examina las consecuencias de la estabilización de G4 por pyPDS sobre la compactación de cromatina y la ocupación de Pol II. B Diferencias de accesibilidad a la cromatina para promotores de genes activos con un G4 (Pol II + G4 +) en hipoxia para células tratadas con DMSO o pyPDS. Panel superior, gráfico de metagen de la señal ATAC centrada en el TSS que muestra la diferencia de señal entre las células hipóxicas tratadas con DMSO y pyPDS. Panel inferior, datos trazados para loci individuales y representados por un diagrama de mapa de calor. C Diagrama de Venn que muestra los sitios que han perdido la ocupación de Pol II entre células normóxicas e hipóxicas tratadas con DMSO y su superposición con los sitios de Pol II perdidos en el tratamiento con pyPDS en condiciones hipóxicas en comparación con el tratamiento con DMSO en condiciones normóxicas. Esto muestra que la mayoría de los sitios Pol II que se ven reducidos en la hipoxia son retenidos por pyPDS. D Similar al panel B pero por diferencias de señal en la ocupación de Pol II. mi Vista del navegador del genoma que muestra ejemplos de genes implicados en la biología de la cromatina (p. Ej. BRD4 y CBX1) que muestran cambios en la accesibilidad de la cromatina (ATAC-seq, verde) y la ocupación Pol II (Pol II ChIP-seq, negro) para células en condiciones normóxicas (arriba), hipóxicas (medio) o hipóxicas tratadas con pyPDS (abajo). Las coordenadas genómicas se indican arriba y la señal se cuantifica como recuentos por millón (CPM)


Modificaciones de histonas y asma. La interfaz de los paisajes epigenético y genético

Las enfermedades pulmonares complejas, como el asma, están influenciadas tanto por la predisposición genética como por los estímulos ambientales. El panorama epigenético de estas enfermedades está atrayendo un interés y una investigación cada vez mayores. La epigenética cubre ampliamente los cambios transitorios y heredables en la expresión génica que no se deben directamente a cambios en las secuencias de nucleótidos. Los mecanismos epigenéticos podrían tener un impacto significativo en las vías alérgicas, inmunes y reguladoras relacionadas con el asma, así como en la generación de biomarcadores y la transmisión hereditaria de los fenotipos del asma. Los avances tecnológicos recientes han permitido el mapeo del epigenoma y el análisis de los contribuyentes epigenéticos de la enfermedad en todo el genoma. Como resultado, han surgido observaciones innovadoras con respecto a las modificaciones postraduccionales de las histonas en una serie de enfermedades inmunológicas. En esta revisión, miramos más allá de la información biológica codificada por el ADN y revisamos las modificaciones epigenéticas realizadas a las histonas, con evidencia que sugiere un papel para su modificación en el asma.

El asma se caracteriza por la inflamación de las vías respiratorias y la obstrucción reversible de las vías respiratorias, identificándose y confirmando progresivamente los procesos inflamatorios crónicos. Se han descrito varios fenotipos de asma clínicos y biológicos y se han identificado muchos desencadenantes de asma variados (1). A pesar de esto, la patogenia del asma a nivel celular, molecular y genético es menos clara. Los objetivos de un solo gen se han replicado de manera deficiente en estudios genéticos extensos y sus contribuciones a los criterios de valoración clínicos son inciertas. Existen tratamientos y estrategias de manejo efectivos para el asma leve a moderada, pero no tienen cura.

La escasa replicación de dianas de un solo gen se ejemplifica mediante múltiples estudios de asociación de todo el genoma (2-5). Estos representan poderosos estudios independientes de hipótesis que identifican una gran cantidad de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) asociados con el asma, como la hiperreactividad bronquial o la polarización T helper (Th) 2. Surgen dificultades en la replicación de estos análisis que pueden atribuirse a la heterogeneidad del asma y al gran número de fenotipos observados. Los fenotipos del asma se pueden evaluar mediante una variedad de variables, incluida la edad de inicio (inicio en la niñez / edad adulta), el tipo de desencadenante (alérgico, sensible a la aspirina, metabisulfito, ciclo menstrual, inducido por ejercicio, aire frío, etc.), tipo de inflamación de las vías respiratorias (neutrofílica, eosinofílica o paucicelular), tipo de respuesta de las células T (Th2 o Th17) y diferentes respuestas a la terapia. Es probable que cada fenotipo de asma tenga su propia biología única, por lo que la identificación de biomarcadores y genes diana es inconsistente (1). Algunos genes candidatos para el asma replicados incluyen la isoforma 3 de la proteína similar a la orosomucoide (ORM) (levadura), el receptor de IL-4, el receptor de IL-6, la IL-33, el receptor de IL-1 similar a 1, un dominio de metalopeptidasa de desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) 33, y supresión de la tumorigenicidad 2 (2-5). Aunque prometedoras, estas observaciones parecen explicar menos del 5% de la heredabilidad del asma (6).

Esta mala correlación genética contrasta con la alta tasa de concordancia del asma en los estudios de gemelos monocigóticos (alrededor del 70% de heredabilidad) (7). Esto sugiere que un componente hereditario significativo de la enfermedad no se está detectando mediante la detección de mutaciones genéticas, lo que a su vez sugiere un papel de los factores epigenéticos. Las interacciones entre la genética, la epigenética y el medio ambiente sugieren fuertemente que ninguna mutación genética única será la causante. La respuesta inmunológica a los estímulos ambientales es fundamental para el asma, y ​​es fundamental conocer mejor la causa de la desviación inmunitaria y el papel de la epigenética en el asma.

El término "epigenética" cubre tanto los cambios transitorios como los heredables en la expresión génica que no se deben directamente a cambios en las secuencias de nucleótidos. Estas modificaciones pueden transmitirse a través de la división celular tanto en la meiosis como en la mitosis. Los tres principales mecanismos epigenéticos son: (1) Metilación del ADN (2) las interacciones y acciones del ARN no codificante y (3) modificación de histonas. La metilación de la citosina del ADN se produce en sitios clave, lo que dificulta la unión de la maquinaria transcripcional al promotor o potenciador de un gen o expresa el ARNm de un gen diana por completo. El ARN no codificante regula la expresión génica a nivel postranscripcional. Interactúan con el ARNm de varias formas para modificar la expresión génica. La tercera forma de epigenética implica modificaciones postraduccionales de histonas (PTM) que alteran la estructura de la proteína de los complejos octámeros de histonas dentro del nucleosoma sin alterar la secuencia de ADN (Figura 1). Esto es fundamental para la composición bioquímica y la coordinación de la remodelación de la cromatina y la accesibilidad del ADN a la maquinaria transcripcional.

Figura 1. Complejo octámero de histonas y modificaciones postraduccionales de histonas conocidas. El complejo octámero está compuesto por las histonas centrales H2A, H2B, H3 y H4, y el ADN, que se envuelve alrededor de un complejo octámero de histonas y la histona H1 asociada, estabilizando la estructura de la cromatina de orden superior. Se muestran algunos de los residuos que están sujetos a las modificaciones postraduccionales y sus modificaciones de activación / represión generalmente aceptadas. Las modificaciones específicas de los mismos residuos de histonas tienen impactos específicos del sitio en la accesibilidad de los genes a la maquinaria transcripcional, que se muestra con más detalle en la Figura 2. K, lisina R, arginina T, treonina S, serina Y, tirosina. Hexágonos, metilación triangulos, acetilación cuadrícula, fosforilación verde, activando modificación rojo, desactivando la modificación naranja, modificación de diafonía.

Parte de la complejidad de la epigenética han sido las PTM de histonas reversibles y parcialmente heredables que pueden controlar y ser controladas por el genoma (8, 9). Las modificaciones de las histonas no tienen la misma fidelidad a lo largo de la división celular que la metilación del ADN, y algunas modificaciones se restablecen a niveles comparables después de la fase S y otras no (10). Esto puede ocurrir particularmente porque las modificaciones de las histonas dependen de enzimas codificadas genéticamente para regular la estructura de las histonas a lo largo de la meiosis y la mitosis. En contraste con esta generalización está el informe de trimetilación (me3) de lisina 27 en la histona 3 (H3K27me3) en células germinales que exhiben herencia específica de sitio a través de varias rondas meióticas de replicación, en ausencia de la histona metiltransferasa asociada en Caenorhabditis elegans (11). Este tipo de memoria epigenética aún no se ha observado en humanos y el mecanismo sigue sin estar claro; sin embargo, podría deberse a la redundancia genética de las modificaciones de las histonas.

Aunque las modificaciones de las histonas en sí mismas son modificaciones epigenéticas, se ha demostrado que la variación de la secuencia de ADN afecta los estados de la cromatina. Kasowski y sus colegas (12) analizaron la variación en los estados de cromatina entre 19 individuos mapeando modificaciones de histonas en líneas celulares linfoblastoides derivadas de pacientes usando inmunoprecipitación de cromatina y secuenciación de alto rendimiento. Demostraron que el paisaje de la cromatina era más variable en las regiones potenciadoras y promotoras y que esta variación era hereditaria, y la atribuyeron a los SNP en los sitios de unión del factor de transcripción. Otros dos estudios recientes también proporcionan evidencia de esto, demostrando que los estados de la cromatina son específicos de alelos y están influenciados por la maquinaria reguladora, en particular, la unión del factor de transcripción (9, 13).

Los avances tecnológicos en el análisis epigenómico (14) han proporcionado herramientas vitales para estudiar la herencia de las modificaciones de las histonas y sus efectos en el asma. En el útero Se ha demostrado que la suplementación con una dieta rica en donantes de metilo aumenta las características de la enfermedad alérgica de las vías respiratorias en un modelo de ratón a través de dos generaciones a través de la metilación del ADN (15). Esta observación se refleja de manera similar en humanos, donde vemos un mayor riesgo de desarrollar asma en los nietos de fumadores paternos, y un riesgo aún mayor cuando la madre también ha estado expuesta al humo del cigarrillo durante el embarazo (16). Este desequilibrio en la herencia de los padres puede atribuirse a la impronta genómica (17), un proceso de silenciamiento del gen específico del padre de origen en el que la metilación de histonas desempeña un papel rector al marcar las regiones de control de la impronta para la metilación posterior del ADN (18). Como las enzimas que modifican las histonas pueden estar sujetas a mutaciones genéticas adquiridas además de los estímulos ambientales, las PTM de histonas no son del todo consistentes con la definición clásica de epigenética, sino que son un puente entre los paisajes genético y epigenético.

La estructura de la cromatina no es un andamio inerte para el empaquetado de información genómica, es un mapa fluido e informativo de todo el genoma del potencial de transcripción específico de la célula. Puede cambiar como resultado de estímulos internos o externos, o como un contribuyente o una respuesta a las decisiones sobre el destino celular durante la diferenciación celular. Para el control de la cromatina son fundamentales las enzimas de modificación de histonas especializadas que pueden eliminar, ajustar o añadir alteraciones bioquímicamente a las unidades de histonas.

El nucleosoma, la unidad central de la cromatina, consta de aproximadamente 142 pares de bases (pb) de ADN envuelto alrededor de un complejo octámero de histonas. Este complejo está compuesto por dos conjuntos de subunidades del complejo de histonas centrales, H2A y H2B, y H3 y H4, junto con la proteína histona H1 estabilizadora del ADN internucleosomal asociada (Figura 1). El ADN que se adhiere firmemente al andamio proteico está protegido de la maquinaria transcripcional y las enzimas PTM, debido a su naturaleza compacta. Esto también protege al ADN de otras modificaciones epigenéticas, como la metilación del ADN (19). Los elegantes estudios de digestión de ADNasa I en 1980 de extractos purificados de ADN completo produjeron bandas de aproximadamente 142 pb, lo que sugiere que esta región está protegida de la actividad enzimática (20). Como tal, la estructura de la cromatina alrededor de un gen es capaz de acompañar cuándo y dónde se transcribe y expresa esa secuencia de ADN. Por lo tanto, la expresión génica está influenciada por una gran cantidad de factores, incluidos factores de transcripción, estímulos externos y PTM de histonas remodeladoras de cromatina.

Las modificaciones de histonas ocurren en las colas N-terminales de cada histona dentro del octámero (Figura 1). Todos los residuos "básicos" pueden modificarse; sin embargo, existen residuos clave de lisina, serina, arginina, tirosina y treonina que son dianas para la modificación, alterando así la estructura del complejo de histonas para favorecer o reprimir la actividad génica local. Esto puede implicar metilación (me), acetilación (ac), fosforilación, ubiquitinación o sumoilación, todas reguladas por enzimas específicas (21). Las modificaciones de histonas (en particular, metilaciones de lisina en la histona 3) pueden tener funciones tanto activantes como represivas en la expresión génica (Figura 2). Las modificaciones de histonas también pueden actuar como señales reconocidas por factores de transcripción y cofactores que regulan la expresión génica (21).

Figura 2. Código de histona de algunos residuos clave de lisina en la histona H3. (A) Código de histonas general. Las modificaciones específicas de residuos están asociadas con la expresión génica activa o reprimida. El grado y tipo de modificación realizada en cada residuo (lisinas 4, 9, 14, 20, 27, 36 y 79 de la histona H3 representada por círculos azules) tienen diferentes impactos sobre la expresión génica (es decir, monometilación [me1], dimetilación [me2], trimetilación [me3] y acetilación [ac]). Además del impacto individual de estas modificaciones, está la colocalización de lisina-4 en modificaciones de la histona-3 (H3K4me3 activa) y H3K27me3 (represiva) que, cuando se encuentran en las regiones promotoras, dan como resultado un estado bivalente en el que la expresión génica está equilibrada. para activación. (B) Impacto específico del sitio de algunas modificaciones de histonas. La ubicación de la modificación en el contexto del gen es significativa. Por ejemplo, H3K4me3 a menudo se encuentra solo en la región promotora de regiones transcritas activamente, mientras que la metilación de H3K36 se encuentra a través del gen transcripcionalmente activo en la región codificante hacia el extremo 3 '(23).Estas cifras básicas son representativas de sólo algunas de las modificaciones conocidas realizadas en los residuos de lisina de la histona H3. Hay muchas modificaciones que se pueden hacer a estos y otros residuos de las histonas dentro del complejo octámero.

El grado de modificación en cada residuo de histona y la combinación y ubicación de las modificaciones pueden tener impactos marcadamente diferentes sobre la expresión génica y la estructura de las histonas. Esto es cierto en diferentes tipos de células, lo que indica la posibilidad de una reprogramación fenotípica. Por ejemplo, me3 de histona-3-lisina-4 (H3K4) se encuentra en regiones promotoras de 1 kb altamente enriquecidas en los sitios de inicio de la transcripción de genes activos, mientras que la dimetilación (me2) o monometilación (me1) del mismo residuo de lisina se observa además dentro de las regiones codificantes de genes transcritos activamente (22, 23). Las modificaciones preexistentes dentro del mismo octámero de histona también pueden determinar qué colocalizado adicional (cis) y adyacente (trans) pueden producirse modificaciones, y esto puede ser específico de la célula. Por ejemplo, H3K9me y H3K14ac pueden coexistir en la misma molécula dentro de las células humanas, mientras que, en los eritrocitos de pollo, son mutuamente excluyentes (21).

Existen numerosas enzimas que regulan las histonas PTM que se conservan en gran medida en eucariotas. Su expresión está influenciada por factores genéticos y ambientales. Por ejemplo, el humo del cigarrillo induce la expresión génica de una enzima desmetilasa específica de H3K27me3: demetilasa específica de lisina (K) (KDM) 6A (24). Esta enzima actúa a través de su dominio proteico funcional Jumonji, característico de una gran familia de histonas desmetilasas capaces de eliminar el residuo de lisina trimetilada de las histonas (24). La regulación positiva de esta enzima da como resultado la eliminación de los sitios de metilación supresores y activa genes asociados con la progresión del ciclo celular a través de la vía del retinoblastoma en líneas celulares de cáncer renal (24, 25). De manera similar, la inhalación pasiva de humo en niños con asma grave disminuye drásticamente la expresión génica de la histona desacetilasa (HDAC) 2 (26) en los macrófagos alveolares. HDAC2 puede desacetilar múltiples modificaciones de acetilación a través de residuos de lisina en la histona 3 y la histona 4 (26). HDAC2 se ha implicado en la fisiopatología de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, donde su reducción se produce como consecuencia del aumento del estrés oxidativo y nitrativo en los pulmones. Está regulado por los corticosteroides, lo que suprime la expresión de genes inflamatorios y reduce el daño pulmonar (27). El potencial terapéutico de los genes de modificación de histonas tiene una base sólida de evidencia, particularmente HDAC2 en el asma. Pocos ensayos clínicos se han dirigido a HDAC específicos y, en cambio, están utilizando inhibidores de amplio espectro, como la tricostatina A y el ácido valproico, que pueden provocar efectos fuera del objetivo y ofrecen una comprensión deficiente de las acciones de los inhibidores de HDAC (28).

Además de los estímulos ambientales, las influencias genéticas pueden afectar las PTM de histonas, con mutaciones de enzimas modificadoras de histonas y sus proteínas chaperonas, alterando la distribución de los patrones de metilación de histonas. El Consorcio GABRIEL (un estudio multidisciplinario para identificar las causas genéticas y ambientales del asma en la comunidad europea) estudio de asociación del genoma de sujetos con asma identificó SNP significativos (PAG ≤ 0.01) dentro de las enzimas de modificación de histonas, KDM2A, KDM4C, HDAC4, HDAC7, HDAC9 (29). El impacto funcional de estos SNP observados queda por analizar y, debido a la heterogeneidad del asma, un análisis detallado de fenotipos específicos podría revelar más SNP relevantes. Las mutaciones catalíticamente inactivadoras de la histona metiltransferasa, potenciador del homólogo 2 de zeste (Ezh2) mejoran específicamente la plasticidad de las células T y favorecen un fenotipo Th2, con un aumento de la IgE circulante (30) (Figura 2). EZH2 posee el dominio SET altamente conservado, lo que le permite trimetilar H3K27. La eliminación del dominio SET en las células T CD4 + aumenta la gravedad de la enfermedad en un modelo animal de asma alérgica que coincide con la acumulación de células Th2 de memoria (30). También se han explorado mutaciones con pérdida de función en una proteína chaperona de la enzima modificadora de histonas, supresora del homólogo 1 de variegación 3-9 (SUV39H1). Las mutaciones de SUV39H1 dan como resultado un producto catalíticamente inactivo que no puede apuntar a un subconjunto de loci genéticos de tipo Th1 para el silenciamiento. El papel normal de este gen proporciona el sitio de unión para la proteína heterocromatina 1a, un mediador del silenciamiento génico a través de la interacción con varias enzimas de modificación de histonas (30). Sin la acompañante SUV39H1, este mediador genético no puede garantizar un linaje Th2 estable en las células que contienen estas mutaciones inactivadoras (31).

Aunque la mayoría de las enzimas de modificación de histonas son específicas de los residuos a los que se dirigen, algunas tienen menor fidelidad a las proteínas de histonas y también pueden modificar proteínas que no son de histonas. Los ejemplos incluyen una serie de histonas acetiltransferasas y desacetilasas (32) e histonas metiltransferasas, como el dominio SET que contiene 7 (SETD7) (33). SETD7 monometila H3K4 (H3K4me1), una modificación activadora, pero también tiene múltiples sustratos distintos de la histona relevantes para las patologías del asma, que incluyen: transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) (34), proteína tumoral p53 (35), receptor de estrógeno-α ( 36), ADN metiltransferasa 1 (37), factor de transcripción E2F 1 (38) y la subunidad p65 / RelA del factor nuclear-κB (NF-κB) (39). Curiosamente, la metilación de SETD7 del residuo de lisina K140 en STAT3 altera este factor de transcripción que es parte del promotor del supresor de señalización de citocinas regulado por STAT3 (SOCS3), que ha sido identificado como un impulsor del asma (40). Las citocinas asociadas al asma, como IL-6, promueven esta metilación sin histona, lo que da como resultado la disociación de STAT3 del promotor SOCS3 y un aumento de la expresión de SOCS3 (Figura 3). De esta manera, SETD7 permite que se produzcan puentes epigenéticos y genéticos, y es crucial para mantener una respuesta celular normal a las citocinas (34).

Figura 3. La desmetilación que contiene el dominio SET (SETD) 7 de proteínas distintas de la histona es un regulador negativo de la respuesta inmune de tipo T helper (Th) 2. La estimulación de IL-6 conduce a la fosforilación del transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) 3 en los residuos Y705 y S727, lo que conduce a su dimerización y unión al promotor de señalización de citocinas regulado por STAT3 (SOCS3). Esto activa la transcripción de un gen SOCS3 que se sabe que está asociado con una respuesta exagerada de tipo Th2 en el asma. La unión coincidente de SETD7 dimetila STAT3 en K140. Esta metilación de lisina de STAT3 unido al promotor es un evento regulador negativo. Dificulta la capacidad de STAT3 para activar SOCS3 en respuesta a IL-6 y, en consecuencia, conduce a una regulación a la baja biológicamente importante de la respuesta Th2. M, metilación P, fosforilación.

Se sabe que una serie de modificaciones de histonas desempeñan un papel fundamental en los cánceres (41) y en las enfermedades neurológicas (42) y autoinmunes (43, 44), y en la orientación del desarrollo celular (45). Lo que se comprende menos en estas enfermedades, como en el asma, es el impacto acumulativo de todas las modificaciones de las histonas. Los esfuerzos de colaboración del Consorcio de Epigenómica de la Hoja de Ruta de los Institutos Nacionales de Salud (46) y la Enciclopedia de Elementos de ADN (ENCODE) han realizado esfuerzos recientes para producir ricos recursos de conjuntos de datos para abordar esta preocupación y evitar inconsistencias en los datos al proporcionar protocolos optimizados. El sistema regulador de histonas no es tan simple como la activación frente a la represión. Aunque, la mayoría de las veces, la hiperacetilación y la hipometilación favorecen la cromatina transcripcionalmente activa y lo contrario para la transcripcionalmente inactiva cromatina, esto no siempre es así. Para complicar aún más el papel de las modificaciones de histonas, están las combinaciones de colocalizadas (cis) histonas PTM en la misma histona, adyacentes (trans) histonas dentro del mismo nucleosoma, y ​​modificaciones regionales entre nucleosomas a lo largo de la hebra de cromatina que pueden producir señales complejas y dialogar con la remodelación directa de la cromatina. La combinación de una variedad de modificaciones mono, di y tri que pueden estar en múltiples residuos en el panorama de la cromatina se suma a las complejidades de lo que ha surgido como un "código de histonas" (Figura 2) (47). Existe un debate en torno a este término, ya que no es un predictor preciso de resultados, como ocurre con el código genético. Por ejemplo, la colocalización de H3K4me3 y H3K27me3, exhibe características tanto activantes como represivas, produciendo un estado de cromatina bivalente donde los genes están preparados para una activación rápida. Esto juega un papel importante en el desarrollo y la diferenciación (48). La presencia de una modificación preexistente puede prevenir la modificación de otros residuos, sin embargo, se desconoce el alcance total de la interacción entre las modificaciones. En otro lugar se revisa una revisión completa de la regulación cruzada de las modificaciones de histonas en la formación de un código de histonas (21).

Existe una investigación en curso sobre los mecanismos que sustentan la regulación epigenética de la expresión génica, incluida la investigación de la PTM de la cola de histonas y su impacto en la remodelación de la cromatina y la expresión génica. Las enzimas modificadoras de histonas que regulan las PTM en todo el genoma se han descrito como "Los reguladores de las decisiones de desarrollo y los impulsores de las enfermedades humanas" (45). Aunque las PTM de histonas no modifican las secuencias de nucleótidos, las mutaciones en la secuencia de las enzimas activas pueden influir en cómo, qué, dónde y cuándo se produce una modificación de la expresión génica. La evaluación de las mutaciones de la enzima histona PTM en una enfermedad requiere prestar atención a la interacción entre las mutaciones de los genes de la enzima, la cromatina y la expresión génica, y el efecto posterior en las vías de la enfermedad.

El asma se caracteriza clásicamente por una activación sesgada de las células T CD4 + vírgenes para diferenciarse en subconjuntos Th que impulsan la enfermedad. Los subconjuntos del linaje de células Th, Th2 y Th17, secretan citocinas distintas de las células reguladoras Th1 o T (Treg). Los mecanismos epigenéticos (como la modificación de histonas) regulan las células dendríticas presentadoras de antígenos (CD) (49–51) y el compromiso del linaje celular de las células T (22, 30, 31, 52–54) (Tabla 1, Figura 4). La modificación de activación de H3K4me3 contrasta con H3K27me3, un sitio de metilación supresor involucrado en el silenciamiento de genes más que en la expresión de genes (25, 55). Las modificaciones en estos sitios afectan la diferenciación y función de las CD derivadas de monocitos tanto en entornos tumorales como de inflamación (49). Las CD pueden diferenciarse en estados activados o tolerados y sufrir un proceso complejo de maduración y migración a los ganglios linfáticos regionales para activar las células T naive residentes para que respondan al antígeno (52). Los sitios H3K4me3 y H3K27me3 caracterizan la expresión génica de las CD derivadas de monocitos en condiciones inflamatorias a medida que pasan de células presentadoras de antígenos inmaduras a maduras (Figura 4). La colocalización de estas PTM de histonas bivalentes da como resultado un estado bivalente con regulación dinámica de moléculas coestimuladoras clave de DC, CD14, CD83 y CD86, así como antígeno leucocitario humano (HLA) -DRB1, factores de transcripción de la familia NF-κB y otras citocinas , quimiocinas y sus receptores. Estos productos génicos determinan la capacidad de una DC para responder de manera apropiada e interactuar con moléculas coestimuladoras críticas para la comunicación con las células T y la patogénesis del asma. Cuando las CD son activadas por LPS o tolerizadas por factor de crecimiento transformante-β (induciendo una respuesta Th2 o Treg), H3K27me3 y H3K4me3 se localizan diferencialmente alrededor de estos genes importantes, lo que potencialmente determina el estado inflamatorio (49).

Tabla 1. Estudios de modificaciones de histonas asociadas con patologías de células T y células dendríticas relacionadas con el asma

Definición de abreviaturas: CXCR4, quimiocina (motivo CXC) ligando 4 DC, células dendríticas Ezh, potenciador del homólogo zeste GM-CSF, factor estimulante de colonias de granulocitos / macrófagos H3K, histona-3-lisina HDAC, histona desacetilasa KDM6A, lisina 6A desmetilasa específica , enlazador para la activación de células T ORMDL3, proteína 3 tipo orosomucoide 1 PBMC, células mononucleares de sangre periférica PTM, modificación postraduccional Sirt1, sirtuina 1 SUV39H1, supresor de variegación 3–9 homólogo Th, T helper.

Figura 4. Los roles documentados de las modificaciones de histonas y el asma, como se revisa en este artículo, de estudios tanto en humanos como en murinos. Debido a la naturaleza de la cola de la histona 3 que sobresale, es más fácil de modificar y, por lo tanto, más fácil de estudiar. Esta figura demuestra algo de nuestro conocimiento actual de las funciones que tienen estas enzimas y los residuos en H3 que modifican en la patología del asma. Flechas verdes indican estimulantes, mientras que líneas rojas que terminan con una barra indican regulación negativa. Varias modificaciones de histonas (ver el texto principal para una explicación detallada) son capaces de influir en la activación de las células dendríticas y promover el desarrollo y la infiltración de las células inmunes Th2 y Th17, características de la inflamación del asma. Las células Th2 producen IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13, lo que lleva al reclutamiento de eosinófilos, cambio de IgE en las células B, hipersecreción de moco y remodelación de la pared de las vías respiratorias. Los mastocitos activados por IgE se degranulan, liberando más IL-5 y otros mediadores proinflamatorios, lo que lleva a una infiltración adicional de eosinófilos y otras células inmunitarias, lo que contribuye a la inflamación de las vías respiratorias. Las células Th17 producen IL-17, que parece estar específicamente asociada con la infiltración de neutrófilos y la remodelación tisular, que caracterizan el asma grave. Ezh, potenciador del homólogo zeste HDAC, histona desacetilasa Sirt1, sirtuina 1 SUV39H1, supresor del homólogo de variegación 3-9.

Los subtipos de células T influyen en las respuestas inmunitarias en el asma, donde se puede potenciar una respuesta Th2 o Th17 (1). Los fenotipos de células Th2 tienen igualmente una plasticidad significativa, con una población productora de IL-5 y otra que no. La IL-5 tiene funciones en la activación de las células B y en la proliferación y diferenciación de eosinófilos (56), y actualmente está siendo el objetivo del tratamiento del asma. La selección de células Th2 con diferente expresión de IL-5 está relacionada con diferencias en PTM de histona H3K4me3 activa y represiva H3K27me3 que se colocalizan alrededor del promotor del gen IL-5 (57). El mapeo de las diferentes ubicaciones de estos sitios en ratones entre Th1, Th2, Th17, llamadas Treg inducidas y células Treg naturales ha ayudado a identificar cómo estas modificaciones bivalentes pueden equilibrar los genes del desarrollo para la activación o represión durante la diferenciación celular, con algunos patrones únicos observados (Figura 4) (54).

Numerosas modificaciones de histonas y enzimas asociadas son relevantes para la función de las DC y la sensibilización y respuesta de las células T. La acetilación de histonas es una modificación de activación, y las enzimas de desacetilación de histonas se han dirigido a la inhibición o modulación del comportamiento de las DC mediante la regulación de los componentes posteriores de las vías de señalización, como NF-κB (50). Una de estas enzimas es la sirtuina 1 (Sirt1), una histona desacetilasa que emerge como un regulador inflamatorio crítico tanto en la inmunidad de las células T asmáticas como en la activación de los macrófagos, y más recientemente en la activación de las células T guiada por DC (Figura 4). Sirt1 programa a las CD para que presenten antígenos y regulen la diferenciación de las células T favoreciendo una vía Th17 durante la inflamación (51). La inhibición de Sirt1 en un modelo de ratón imita la respuesta inflamatoria asmática (58). Además, la mejora de la expresión del gen Sirt1 con un activador específico (SRT1720) suprime la inflamación (59) con reducción de eosinófilos y citocinas proinflamatorias en el líquido broncoalveolar (60).

Un tema unificador de las PTM de histonas en los estados patológicos es su impacto en la plasticidad fenotípica de las células y su capacidad para responder adecuadamente a estímulos externos o internos. Los estudios de acetilación de histonas que afectan la resistencia a los corticosteroides en sujetos con asma grave muestran una correlación directa entre la actividad de HDAC, conocida por su participación en la regulación de la producción de citocinas Th1 y Th2 (61), y la insensibilidad a los esteroides (62). En algunos sujetos con asma grave, sus células mononucleares de sangre periférica pierden plasticidad fenotípica, no responden adecuadamente a los corticosteroides y reducen los síntomas y las exacerbaciones del asma. Esta falta de respuesta a los corticosteroides inhalados es posterior a la liberación aberrante del factor estimulante de colonias de granulocitos / macrófagos y de citocinas inflamatorias IFN-γ, en parte debido a defectos en las enzimas modificadoras de histonas que provocan un desequilibrio en la desacetilasa y la acetiltransferasa (62).

La proporción de histona desacetilasa e histona acetiltransferasa es relativa a la gravedad y la intensidad fisiológica de la hiperreactividad bronquial en niños con asma atópica. En estos pacientes, hay una reducción significativa de la HDAC y un aumento de la actividad de la histona acetiltransferasa (63). Esta reducción en la expresión / actividad de HDAC también se refleja en adultos con asma grave, pero no leve (62). El reequilibrio de la acetilación en relación con la desacetilación puede ser útil, pero sigue siendo posible que el estado de acetilación de las histonas sea el resultado, no la causa, de la hiperreactividad bronquial. La actividad de HDAC también se atribuye a la resistencia de los fibroblastos pulmonares a las enfermedades pulmonares fibróticas apoptóticas, como la fibrosis pulmonar intersticial, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y el asma.

El efecto de las modificaciones epigenéticas sobre el asma depende del tipo de célula. Por ejemplo, si se producen modificaciones en las células CD8 +, que son células de larga vida, es probable que afecten más al fenotipo del asma que las CD que tienen una vida media corta. Se ha demostrado que las modificaciones de las histonas juegan un papel importante en la diferenciación de las células CD4 + y CD8 + (30, 64), dando forma a los perfiles transcripcionales de estas células y, por lo tanto, impactando la función (65). También se ha demostrado que los mecanismos epigenéticos afectan la diferenciación y función de las CD, con un estudio que muestra que los fosfolípidos oxidados que se generan durante las reacciones inflamatorias desregulan la diferenciación de las CD (66). Estos ejemplos demuestran la importancia de distinguir el tipo de célula cuando se estudian las modificaciones epigenéticas.

Las histonas PTM pueden ser un producto o un contribuyente a factores genéticos y ambientales asociados con el asma. Existe un acuerdo cada vez mayor de que las modificaciones de las histonas son fundamentales para las respuestas inmunitarias en el asma, pero el papel y las funciones de las modificaciones de las histonas están lejos de ser entendidos y se beneficiarían de más estudios en modelos asmáticos, ya que la mayor parte de nuestro conocimiento hasta la fecha proviene de la investigación del cáncer. . Se necesitan estudios que integren datos sobre funciones celulares globales, modificaciones de histonas, unión de factores de transcripción y cambios resultantes en la expresión génica. Es igualmente imperativo que la investigación adicional se base en una mayor precisión fenotípica y mejores datos sobre el impacto de los factores ambientales. La estratificación estricta en grupos fenotípicos, tanto clínicos como moleculares, revelará los micromecanismos de las patologías del asma, y ​​explorar las condiciones ambientales y estimulantes, la secuencia de ADN circundante y las enzimas involucradas proporcionará una mejor comprensión de los impulsores ambientales y las vías moleculares involucradas. En conjunto, esto debería conducir al descubrimiento de dianas terapéuticas para la intervención.

A nivel celular, para que las PTM de histonas sean un objetivo terapéutico viable, se necesitan estudios detallados para caracterizar las PTM específicas de los tipos de células asmáticas, particularmente en respuesta a estímulos asmáticos y para determinar el compromiso posterior del linaje de células Th. También es necesario explorar el papel de los códigos de histonas en la diferenciación celular y la biología de las células madre, con un énfasis particular en la diferenciación de células madre, CD, eosinófilos, células T y B, células epiteliales de las vías respiratorias y otros tipos de células clave involucradas en el asma. . Se deben considerar las vidas medias de las células, ya que la fidelidad de las modificaciones de las histonas adquiridas a través de la división celular aún no se conoce bien. Las células progenitoras, como las células mieloides en la médula ósea que se diferencian en eosinófilos, neutrófilos, monocitos, macrófagos y CD, así como células madre pulmonares, deben analizarse durante la diferenciación para descubrir alteraciones escalonadas en el panorama de las histonas. modificaciones que podrían contribuir a las patologías del asma.

Históricamente, la investigación del asma se ha centrado en productos de un solo gen y su contribución a la patogénesis, mientras que las PTM de histonas y su impacto posterior sobre una miríada de genes pueden generar muchas de las observaciones descritas en el asma. Los avances en la tecnología han permitido la aplicación de microarrays y plataformas de secuenciación de próxima generación para analizar y visualizar modificaciones en todo el genoma y sus impactos en la expresión génica (14). Los estudios futuros sobre las modificaciones de las histonas en el asma deberían centrarse en desarrollar una comprensión más profunda del código de las histonas mediante el mapeo de interacciones complejas y el descubrimiento de los mecanismos moleculares. Los métodos analíticos que se utilizan actualmente, como la inmunoprecipitación de cromatina y la secuenciación de alto rendimiento, están optimizados para funcionar en poblaciones de células de 5.000 a 10.000; sin embargo, se están desarrollando métodos de obtención de imágenes de células vivas y de locus específicos, como la cromatina en vivo ensayos, plantean oportunidades interesantes para el futuro del análisis de células individuales (67, 68).

El papel de las modificaciones de las histonas en el asma grave y cómo influyen en la respuesta al tratamiento es otra vía de investigación importante, en particular porque estos pacientes tienen una morbilidad significativa como resultado de su mala respuesta a los tratamientos convencionales, como los corticosteroides. Por último, los estudios que investigan el papel de las enzimas modificadoras de histonas en otras vías de señalización, la interrelación entre diferentes modificaciones, su relación con los factores de transcripción y el papel de la impronta genética contribuirán a nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la patogénesis y la patogenia del asma. gravedad del asma, que, a su vez, debería dar lugar a terapias más eficaces.

Las histonas PTM son mecanismos epigenéticos capaces de regular importantes componentes genéticos del asma a través de un complejo sistema de intercomunicación, señalización y remodelación de la cromatina. Las histonas PTM y sus enzimas asociadas tienen una influencia significativa en las respuestas de las células T, la maduración de las CD y las respuestas al tratamiento. La investigación sobre esto generará objetivos prometedores para futuros tratamientos. Este ya es el caso del tratamiento de cánceres (69) y otras enfermedades (70). Particularmente notables han sido los avances en el uso de inhibidores de moléculas pequeñas (71) y algunos descubrimientos recientes interesantes de interacciones con las histonas metiltransferasas SETD7 y Ezh2 para atacar cánceres, que ahora se encuentran en ensayos clínicos (72). Hasta la fecha, el estado de acetilación de histonas ha sido el centro de atención, con algunos paralelos observados en el papel de estas enzimas entre otras enfermedades inflamatorias y el asma. Se deben abordar vías de investigación similares para explorar las posibilidades terapéuticas que ofrecen determinadas enzimas de modificación de histonas. El PTM y su regulación se encuentran en el punto de enlace entre los contribuyentes genéticos, ambientales y epigenéticos a la enfermedad. Con la manipulación adecuada de las enzimas que modifican las PTM del complejo octámero de histonas, tenemos acceso a una herramienta poderosa que puede ser capaz de regular la expresión génica inflamatoria más amplia en el asma.


Funciones biologicas

Regulación de la transcripción

El descubrimiento de la acetilación de histonas que causa cambios en la actividad de transcripción se remonta al trabajo de Vicent Allfrey y sus colegas en 1964. [13] El grupo planteó la hipótesis de que las proteínas de histona modificadas por grupos acetilo agregaban cargas negativas a las lisinas positivas y, por lo tanto, reducían la interacción entre el ADN y las histonas. [14] La modificación de histonas ahora se considera un mecanismo regulador importante que está involucrado en muchas etapas diferentes de las funciones genéticas. [15] Nuestro conocimiento actual es que los residuos de lisina acetilada en las colas de histonas están asociados con la activación transcripcional. A su vez, las histonas desacetiladas están asociadas con la represión transcripcional. Además, se han encontrado correlaciones negativas entre varias marcas de acetilación de histonas. [dieciséis]

Se cree que el mecanismo regulador es doble. La lisina es un aminoácido con carga positiva cuando no se modifica. Las lisinas de las colas aminoterminales de las histonas tienden a debilitar la estructura general de la cromatina. La adición de un grupo acetilo, que lleva una carga negativa, elimina efectivamente la carga positiva y, por lo tanto, reduce la interacción entre la cola de histonas y el nucleosoma. [17] Esto abre el nucleosoma, que suele estar muy empaquetado, y permite que la maquinaria de transcripción entre en contacto con la plantilla de ADN, lo que lleva a la transcripción de genes. [18] La represión de la transcripción genética se logra mediante el inverso de este mecanismo. El grupo acetilo es eliminado por una de las enzimas HDAC durante la desacetilación, lo que permite que las histonas interactúen con el ADN de manera más estrecha para formar un ensamblaje de nucleosomas compactado. Este aumento de la estructura rígida impide la incorporación de maquinaria transcripcional, silenciando eficazmente la transcripción génica.

Otra implicación de la acetilación de histonas es proporcionar una plataforma para la unión de proteínas. Como modificación postraduccional, la acetilación de histonas puede atraer proteínas a cromatina alargada que ha sido marcada por grupos acetilo. Se ha planteado la hipótesis de que las colas de histonas ofrecen sitios de reconocimiento que atraen proteínas responsables de la activación transcripcional. [19] A diferencia de las proteínas del núcleo de las histonas, las colas de las histonas no forman parte del núcleo del nucleosoma y están expuestas a la interacción de las proteínas. Un modelo propuso que la acetilación de histonas H3 activa la transcripción de genes atrayendo otros complejos relacionados con la transcripción. Por lo tanto, la marca de acetilo proporciona un sitio para el reconocimiento de proteínas donde los factores de transcripción interactúan con las colas de histonas acetiladas a través de su bromodominio. [20]

Hipótesis del código de histonas

La hipótesis del código de histonas sugiere la idea de que los patrones de modificaciones postraduccionales en las histonas, colectivamente, pueden dirigir funciones celulares específicas. [21] Las modificaciones químicas de las proteínas histonas ocurren a menudo en determinados aminoácidos. Esta adición específica de modificaciones únicas o múltiples en núcleos de histonas se puede interpretar por factores de transcripción y complejos, lo que conduce a implicaciones funcionales. Este proceso es facilitado por enzimas como HAT y HDAC que agregan o eliminan modificaciones en las histonas, y factores de transcripción que procesan y "leen" los códigos de modificación. El resultado puede ser la activación de la transcripción o la represión de un gen. Por ejemplo, la combinación de acetilación y fosforilación tiene efectos sinérgicos sobre el nivel de condensación estructural general de los cromosomas y, por tanto, induce la activación de la transcripción del gen temprano inmediato. [22]

Los experimentos que investigan los patrones de acetilación de las histonas H4 sugirieron que estos patrones de modificación se mantienen colectivamente en la mitosis y la meiosis para modificar la expresión génica a largo plazo. [8] El patrón de acetilación está regulado por las enzimas HAT y HADC y, a su vez, establece la estructura de la cromatina local. De esta manera, los patrones de acetilación se transmiten e interconectan con la capacidad y las funciones de unión a proteínas en la generación celular posterior.

Bromodominio

El bromodominio es un motivo responsable del reconocimiento de lisina acetilada en histonas por proteínas de remodelación de nucleosomas. Las modificaciones postraduccionales de las colas de histonas N- y C-terminales atraen varios factores de iniciación de la transcripción que contienen bromodominios, incluido el coactivador transcripcional humano PCAF, TAF1, GCN5 y la proteína de unión a CREB (CBP), al promotor y tienen un significado en la regulación de la expresión génica. [23] El análisis estructural de los factores de transcripción ha demostrado que los dominios bromodominios altamente conservados son esenciales para que la proteína se una a la lisina acetilada. Esto sugiere que la acetilación del sitio de histona específico tiene un papel regulador en la activación transcripcional de genes. [24]


Enzimas de acetilación / desacetilación de histonas

Histona acetiltransferasa (HAT)

Las histonas acetiltransferasas, también conocidas como HAT, son una familia de enzimas que acetilan las colas de histonas del nucleosoma. Esta y otras modificaciones se expresan en función de los distintos estados del entorno celular. [2] Se han documentado muchas proteínas con capacidad de acetilación y, después de un tiempo, se clasificaron en función de las similitudes de secuencia entre ellas. Estas similitudes son altas entre los miembros de una familia, pero los miembros de diferentes familias muestran muy poca semejanza. [9] Algunas de las familias principales identificadas hasta ahora son las siguientes.

Familia GNAT

Las N-acetiltransferasas (GNAT) relacionadas con 5 (Gcn5) no desprendibles de control general son una de las muchas familias estudiadas con capacidad de acetilación. [10] Esta superfamilia incluye los factores Gcn5 que se incluyen en los complejos SAGA, SLIK, STAGA, ADA y A2, Gcn5L, factor asociado a la proteína de unión a p300 / CREB (PCAF), Elp3, HPA2 y HAT1. [10] [11] Las características principales de la familia GNAT incluyen dominios HAT de aproximadamente 160 residuos de longitud y un bromodominio conservado que se ha encontrado que es un motivo de direccionamiento acetil-lisina. [9] Se ha demostrado que Gcn5 acetila sustratos cuando forma parte de un complejo. [11] Se ha descubierto que la Gcn5 recombinante participa en la acetilación de las histonas H3 del nucleosoma. [2] [11] En menor medida, se ha descubierto que también acetila las histonas H2B y H4 cuando se relaciona con otros complejos. [2] [3] [11] PCAF tiene la capacidad de actuar como una proteína HAT y acetilar histonas, puede acetilar proteínas no histonas relacionadas con la transcripción, así como actuar como coactivador en muchos procesos, incluida la miogénesis, el receptor nuclear -activación mediada y activación señalizada por factor de crecimiento. Elp3 tiene la capacidad de acetilar todas las subunidades de histonas y también muestra participación en la holoenzima de la ARN polimerasa II. [2]

Familia MYST

MOZ (proteína de dedo de zinc de leucemia monocítica), Ybf2 / Sas3, Sas2 y Tip60 (proteína de interacción Tat) componen MYST, otra familia bien conocida que exhibe capacidades de acetilación. Esta familia incluye Sas3, acetiltransferasa esencial relacionada con SAS (Esa1), Sas2, Tip60, MOF, MOZ, MORF y HBO1. Los miembros de esta familia tienen múltiples funciones, no solo con genes activadores y silenciadores, sino que también afectan el desarrollo y tienen implicaciones en enfermedades humanas. [11] Sas2 y Sas3 están involucrados en el silenciamiento de la transcripción, MOZ y TIF2 están involucrados en la formación de productos de translocación leucémica, mientras que MOF está involucrado en la compensación de dosis en Drosophila. Los dominios HAT para esta familia son aproximadamente 250 residuos que incluyen dominios de unión a zinc, ricos en cisteína, así como cromodominios N-terminales. Las proteínas MYST Esa1, Sas2 y Sas3 se encuentran en la levadura, MOF se encuentra en Drosophila, mientras que Tip60, MOZ, MORF y HBO1 se encuentran en humanos. [9] Tip60 tiene funciones en la regulación de la transcripción de genes, se ha encontrado que HBO impacta el proceso de replicación del ADN, MORF es capaz de acetilar histonas libres (especialmente H3 y H4) así como histonas nucleosomales. [2]

Familia p300 / CBP

La proteína adenoviral asociada a E1A de 300 kDa (p300) y la proteína de unión a CREB (CBP) constituyen la siguiente familia de HAT. [10] Esta familia de HAT contiene dominios HAT que tienen aproximadamente 500 residuos de longitud y contienen dominios bromodominios, así como tres dominios ricos en cisteína-histidina que ayudan con las interacciones de proteínas. [9] Se sabe que estos HAT acetilan todas las subunidades de histonas en el nucleosoma. También tienen la capacidad de acetilar y mediar en proteínas no histonas involucradas en la transcripción y también están involucradas en el ciclo celular, la diferenciación y la apoptosis. [2]

Otros HAT

Hay otras proteínas que tienen capacidad de acetilación pero difieren en estructura a las familias mencionadas anteriormente. Un HAT se llama coactivador 1 del receptor de esteroides (SRC1), que tiene un dominio HAT ubicado en el extremo C-terminal de la proteína junto con una hélice-bucle-hélice básica y dominios PAS A y PAS B con un motivo de interacción del receptor LXXLL en la mitad. Otro es ATF-2 que contiene un dominio de activación transcripcional (ACT) y un dominio de unión a ADN de cremallera básica (bZip) con un dominio HAT en el medio. El último es TAFII250 que tiene un dominio quinasa en la región N-terminal, dos dominios bromodominios ubicados en la región C-terminal y un dominio HAT ubicado en el medio. [12]

Histona desacetilasa (HDAC)

Hay un total de cuatro clases que clasifican las histonas desacetilasas (HDAC). La Clase I incluye HDAC 1, 2, 3 y 8. La Clase II se divide en dos subgrupos, Clase IIA y Clase IIB. La Clase IIA incluye HDAC 4, 5, 7 y 9, mientras que la Clase IIB incluye HDAC 6 y 10. La Clase III contiene las Sirtuinas y la Clase IV contiene solo HDAC11. [5] [6] Las clases de proteínas HDAC se dividen y agrupan basándose en la comparación con las homologías de secuencia de Rpd3, Hos1 y Hos2 para las HDAC de clase I, HDA1 y Hos3 para las HDAC de clase II y las sirtuinas para las HDAC de clase III. [6]

HDAC de clase I

HDAC1 y amplificador HDAC2

HDAC1 y amp HDAC2 pertenecen a la primera clase de HDAC y están más estrechamente relacionados entre sí. [5] [6] Al analizar las secuencias generales de ambas HDAC, se encontró que su similitud era aproximadamente un 82% homóloga. [5] Se ha descubierto que estas enzimas son inactivas cuando se aíslan, lo que llevó a la conclusión de que deben incorporarse con cofactores para activar sus capacidades desacetilasas. [5] Hay tres complejos de proteínas principales en los que HDAC 1 y 2 pueden incorporarse. Estos complejos incluyen Sin3 (llamado así por su proteína característica mSin3A), complejo de remodelación y desacetilación de nucleosomas (NuRD) y Co-REST. [5] [6] El complejo Sin3 y el complejo NuRD contienen HDAC 1 y 2, la proteína 48 asociada a Rb (RbAp48) y RbAp46 que constituyen el núcleo de cada complejo. [2] [6] Sin embargo, pueden ser necesarios otros complejos para iniciar la máxima cantidad de actividad disponible posible. Las HDAC 1 y 2 también pueden unirse directamente a proteínas de unión al ADN como Yin y Yang 1 (YY1), proteína de unión a Rb 1 y Sp1. [5] Se ha descubierto que las HDAC 1 y 2 expresan funciones reguladoras en genes clave del ciclo celular, incluido p21. [6]

La actividad de estas HDAC puede verse afectada por la fosforilación. Una mayor cantidad de fosforilación (hiperfosforilación) conduce a un aumento de la actividad desacetilasa, pero degrada la formación de complejos entre las HDAC 1 y 2 y entre HDAC1 y mSin3A / YY1. Una cantidad de fosforilación (hipofosforilación) más baja de lo normal conduce a una disminución en la cantidad de actividad desacetilasa, pero aumenta la cantidad de formación del complejo. Los estudios de mutación encontraron que la fosforilación principal ocurre en los residuos Ser 421 y Ser 423. De hecho, cuando estos residuos mutaron, se observó una reducción drástica en la cantidad de actividad de desacetilación. [5] Esta diferencia en el estado de fosforilación es una forma de mantener un nivel óptimo de fosforilación para garantizar que no haya una expresión excesiva o insuficiente de desacetilación. Las HDAC 1 y 2 se han encontrado exclusivamente en el núcleo. [2] [6] En ratones con inactivación de HDAC1 (KO), se encontró que los ratones morían durante la embriogénesis y mostraban una reducción drástica en la producción pero una mayor expresión de los inhibidores de quinasas dependientes de ciclina (CDKI) p21 y p27. Ni siquiera la regulación al alza de las otras HDAC de Clase I podría compensar la pérdida de HDAC1. Esta incapacidad para recuperarse de HDAC1 KO lleva a los investigadores a creer que hay tanto unicidad funcional para cada HDAC como una interrelación regulatoria entre factores. [6]

HDAC3

Se ha descubierto que HDAC3 está más estrechamente relacionado con HDAC8. HDAC3 contiene una región no conservada en la región C-terminal que se encontró necesaria para la represión transcripcional, así como su actividad desacetilasa. También contiene dos regiones, una llamada Señal de localización nuclear (NLS) y Señal de exportación nuclear (NES). El NLS funciona como una señal para la acción nuclear, mientras que un NES funciona con HDAC que realizan trabajo fuera del núcleo. La presencia de ambas señales para HDAC3 sugiere que viaja entre el núcleo y el ctyoplasma. [5] Incluso se ha descubierto que HDAC3 interactúa con la membrana plasmática. [6] El mediador silenciador para los receptores de ácido retinoico y hormona tiroidea (SMRT) y los factores correpresores del receptor nuclear (N-CoR) deben ser utilizados por HDAC3 para activarlo. [5] [6] Al hacerlo, adquiere la capacidad de coprecipitar con las HDAC 4, 5 y 7. La HDAC3 también se puede encontrar complejada junto con la proteína relacionada con HDAC (HDRP). [5] Se ha descubierto que las HDAC 1 y 3 median las interacciones Rb-RbAp48, lo que sugiere que funciona en la progresión del ciclo celular. [5] [6] HDAC3 también muestra participación en la autorrenovación de las células madre y un papel independiente de la transcripción en la mitosis. [6]

HDAC8

Se ha descubierto que HDAC8 es muy similar a HDAC3. Su característica principal es su dominio catalítico que contiene una región NLS en el centro. Se han encontrado dos transcripciones de este HDAC que incluyen una transcripción de 2,0 kb y una transcripción de 2,4 kb. [5] A diferencia de las otras moléculas de HDAC, cuando se purificó, esta HDAC demostró ser enzimáticamente activa. [6] En este punto, debido a su reciente descubrimiento, aún no se sabe si está regulado por complejos proteicos correpresores. Las transferencias Northern han revelado que los diferentes tipos de tejidos muestran distintos grados de expresión de HDAC8 [5], pero se han observado en los músculos lisos y se cree que contribuyen a la contractilidad. [6]

HDAC de clase II

Clase IIA

Los HDAC de clase IIA incluyen HDAC4, HDAC5, HDAC7 y HDAC9. Se ha descubierto que los HDAC 4 y 5 se parecen mucho entre sí, mientras que HDAC7 mantiene un parecido con ambos. Se han descubierto tres variantes de HDAC9, incluidas HDAC9a, HDAC9b y HDAC9c / HDRP, mientras que se sospecha de más. Se ha descubierto que las variantes de HDAC9 tienen similitudes con el resto de HDAC de Clase IIA. Para HDAC9, las variantes de empalme pueden verse como una forma de crear un "mecanismo ajustado" para los niveles de expresión de diferenciación en la célula. Diferentes tipos de células pueden aprovechar y utilizar diferentes isoformas de la enzima HDAC9, lo que permite diferentes formas de regulación. Las HDAC 4, 5 y 7 tienen sus dominios catalíticos ubicados en el extremo C-terminal junto con una región NLS, mientras que HDAC9 tiene su dominio catalítico ubicado en el extremo N-terminal. Sin embargo, la variante HDAC9 HDAC9c / HDRP carece de un dominio catalítico pero tiene una similitud del 50% con el extremo N de las HDAC 4 y 5. [5]

Para las HDAC 4, 5 y 7, se han descubierto dominios de unión conservados que se unen a la proteína de unión C-terminal (CtBP), factor potenciador de miocitos 2 (MEF2) y 14-3-3. [5] [6] Las tres HDAC trabajan para reprimir el factor de transcripción miogénico MEF2, que desempeña un papel esencial en la diferenciación muscular como factor de transcripción de unión al ADN. La unión de las HDAC a MEF2 inhibe la diferenciación muscular, que puede revertirse mediante la acción de la quinasa dependiente de Ca 2+ / calmodulina (CaMK), que actúa para disociar el complejo HDAC / MEF2 mediante la fosforilación de la porción de HDAC. [5] Se ha visto que están involucrados en la hipertrofia celular en la diferenciación del control muscular, así como en la hipertrofia celular en tejidos musculares y cartilaginosos. [6] Se ha demostrado que las HDAC 5 y 7 funcionan en oposición a HDAC4 durante la regulación de la diferenciación muscular para mantener un nivel adecuado de expresión. Ha habido evidencia de que estas HDAC también interactúan con HDAC3 como un factor de co-reclutamiento para los factores SMRT / N-CoR en el núcleo. Se ha demostrado que la ausencia de la enzima HDAC3 conduce a la inactividad, lo que hace que los investigadores crean que las HDAC 4, 5 y 7 ayudan a la incorporación de reclutadores de unión al ADN para los complejos HDAC que contienen HDAC3 ubicados en el núcleo. [5] Cuando se elimina el HDAC4 en ratones, estos sufren de una hipertrofia de condrocitos pronunciada y mueren debido a una osificación extrema. Se ha demostrado que HDAC7 suprime la apoptosis dependiente de Nur77. Esta interacción conduce a un papel en la expansión clonal de las células T. Se ha demostrado que los ratones HDAC9 KO sufren de hipertrofia cardíaca que se agrava en los ratones que tienen el doble de KO para las HDAC 9 y 5. [6]

Clase IIB

Los HDAC de clase IIB incluyen HDAC6 y HDAC10. Estos dos HDAC están más estrechamente relacionados entre sí en la secuencia general. Sin embargo, el dominio catalítico de HDAC6 es más similar a HDAC9. [5] Una característica única de HDAC6 es que contiene dos dominios catalíticos en tándem uno del otro. [5] [6] Otra característica única de HDAC6 es el dominio de motivo de dedo de zinc (HUB) relacionado con HDAC6, SP3 y Brap2 en el extremo C que muestra algunas funciones relacionadas con la ubiquitinación, lo que significa que este HDAC es propenso a degradarse. [5] HDAC10 también tiene dos dominios catalíticos. Un dominio activo se encuentra en el N-terminal y un dominio catalítico putativo se encuentra en el C-terminal [5] [6] junto con un dominio NES. [5] También se han encontrado dos dominios de unión a Rb putativos en HDAC10, lo que muestra que puede tener funciones en la regulación del ciclo celular. Se han encontrado dos variantes de HDAC10, ambas con ligeras diferencias de longitud. HDAC6 es el único HDAC que ha demostrado actuar sobre la tubulina, actuando como una tubulina desacetilasa que ayuda en la regulación de la motilidad celular dependiente de microtúbulos. Se encuentra principalmente en el citoplasma, pero se sabe que se encuentra en el núcleo, complejado junto con HDAC11. Se ha visto que HDAC10 actúa sobre las HDAC 1, 2, 3 (o SMRT), 4, 5 y 7. Se ha demostrado cierta evidencia de que también puede tener pequeñas interacciones con HDAC6. Esto lleva a los investigadores a creer que HDAC10 puede funcionar más como un reclutador que como un factor de desacetilación. Sin embargo, los experimentos llevados a cabo con HDAC10 sí mostraron actividad de desacetilación. [5]

HDAC de clase IV

HDAC11

Se ha demostrado que HDAC11 está relacionado con los HDAC 3 y 8, pero su secuencia general es bastante diferente de los otros HDAC, lo que lo lleva a estar en su propia categoría. [5] [6] HDAC11 tiene un dominio catalítico ubicado en su extremo N-terminal. No se ha encontrado incorporado en ningún complejo HDAC como Nurd o SMRT, lo que significa que puede tener una función especial única para sí mismo. Se ha encontrado que HDAC11 permanece principalmente en el núcleo. [5]


Entrega de premios por Richard Lifton

La mera existencia de la vida parece milagrosa. El desarrollo de una sola célula de una planta, un insecto o un ser humano, cada uno de los cuales contiene células y órganos especializados con funciones radicalmente diferentes, representa uno de los grandes misterios. Ahora entendemos que todas las formas de vida en la tierra usan información codificada en el ADN como manual de instrucciones para construir un organismo adulto. Las instrucciones se ejecutan copiando segmentos de ADN, llamados genes, en copias de ARN, que dirigen la producción de las proteínas que crean una célula muscular, una célula hepática o una neurona. Esto requiere que diferentes conjuntos de genes estén activados, desactivados o sintonizados a los niveles correctos en diferentes tipos de células. Además, la expresión génica también debe modularse para responder a cambios periódicos en el entorno externo.

Nuestros primeros conocimientos sobre cómo los genes se activan y desactivan selectivamente provienen de estudios de la bacteria. E. coli por Jacob y Monod a principios de la década de 1960. Establecieron el paradigma de que los factores de transcripción, proteínas que se unen a secuencias específicas de ADN, promueven o inhiben la copia de ADN en ARN.

Más información

No obstante, existen diferencias notables entre bacterias y eucariotas, es decir, plantas, animales y hongos. Por ejemplo, el genoma humano es casi 1000 veces más grande que E. coli. El ADN extendido de una célula humana tiene 6 pies de largo, pero está comprimido en un núcleo que tiene un radio de solo 3 micrones, lo que plantea un grave problema de organización / gestión. El ADN cromosómico de los eucariotas, pero no de las bacterias, está asociado con una familia de pequeñas proteínas llamadas histonas. La investigación de Roger Kornberg, Tim Richmond y otros mostró que este complejo de ADN-proteína comprende una cadena de perlas, llamadas nucleosomas, y cada cuenta tiene un núcleo de proteínas histonas con ADN envuelto alrededor del exterior. Estas perlas se empaquetan en conjuntos de orden superior en los cromosomas, con la longitud de las fibras de ADN comprimidas hasta 10.000 veces durante la división celular.

La uniformidad de las perlas de histonas y su falta de preferencia por secuencias de ADN específicas llevó a la amplia presunción de que estos nucleosomas eran simplemente el material de empaquetamiento inerte para el ADN en el núcleo. No obstante, en la década de 1960 Vincent Allfrey había hecho la provocadora observación de que las proteínas histonas podían modificarse químicamente. Mostró que las histonas acetiladas se enriquecían en partes del genoma altamente expresadas y se reducían en segmentos que no expresan genes. Sin embargo, las herramientas disponibles en ese momento no pudieron establecer si la modificación de las histonas era una causa o una consecuencia de la expresión génica, y estas observaciones languidecieron.

Ingrese Michael Grunstein, quien en la década de 1980 se propuso probar la idea de que las histonas desempeñaban un papel activo en la regulación de la expresión génica. Estudió la levadura de panadería.S. cerevisiae—Porque este hongo unicelular podría manipularse genéticamente. Grunstein diseñó levadura en la que la producción de histonas podía activarse y desactivarse a voluntad. En 1987, Grunstein y sus colegas informaron que la desactivación de la producción de histonas conducía a un agotamiento de los nucleosomas sorprendentemente, y descubrieron que esto provocaba la activación de la expresión de genes que normalmente estaban desactivados, lo que indica por primera vez que los nucleosomas regulan la expresión de genes in vivo.

Luego hizo una pregunta aún más ambiciosa: ¿las mutaciones específicas del ADN que alteran las proteínas histonas alteran la expresión génica? En una elegante serie de experimentos, mostró primero que la deleción de un trozo corto de un extremo de una de las proteínas histonas, llamadas H4, eliminaba selectivamente la inducción de la expresión de genes que están altamente regulados por la disponibilidad de diferentes nutrientes en el medio ambiente. Es importante destacar que este segmento incluyó los cuatro sitios de la proteína que fueron acetilados. Luego mutó estos cuatro sitios para que ya no pudieran acetilarse y demostró que estas mutaciones eran suficientes para evitar la activación de estos genes.

Por el contrario, Grunstein descubrió además mutaciones en las colas de histonas que activaron la expresión génica al evitar la compactación normal de los cromosomas en segmentos altamente condensados ​​llamados heterocromatina en los que la expresión génica está apagada. Aclaró un hermoso mecanismo bioquímico que muestra cómo esta heterocromatina se propaga en continuidad a lo largo del cromosoma, explicando un fenómeno bien descrito pero misterioso.

El trabajo pionero de Grunstein estableció por primera vez la relación causal entre las alteraciones de sitios específicos en las proteínas histonas en la activación normal y la represión de la expresión génica.

Paralelamente, David Allis estaba utilizando la bioquímica para aislar las enzimas que median la modificación de las histonas. Los niveles de estas enzimas eran extremadamente bajos en las células, lo que llevó a Allis a recurrir a Tetrahymena, un protozoo inusual en el que la expresión génica se produce en núcleos en los que el ADN cromosómico se fragmenta en pequeños trozos del tamaño de un gen que luego se amplifica a un alto número de copias. Estos núcleos tienen altos niveles de expresión génica con altos niveles de acetilación de histonas. Mediante un ingenioso enfoque experimental, el equipo de Allis purificó en 1996 la primera histona acetil transferasa. La secuencia de esta proteína proporcionó una sorpresa espectacular, revelando que estaba estrechamente relacionada con una desconcertante proteína de levadura, Gcn5p, que había sido identificada como una proteína que no se unía al ADN, pero que, sin embargo, era necesaria como compañera de diferentes factores de transcripción para activarse. expresión de genes altamente regulados. En poco tiempo, el equipo de Allis demostró que este coactivador de levadura, al igual que su Tetrahymena contraparte, acetila selectivamente los sitios en las colas de histonas que se acetilan in vivo.

Estos estudios implicaron colectivamente la modificación covalente de las proteínas histonas en la regulación normal de la expresión génica y prendieron fuego al campo, atrayendo a un gran número de científicos talentosos. El torrente de trabajo resultante ha cambiado nuestra comprensión de la expresión génica regulada y ha revelado un lenguaje previamente no reconocido en el que diferentes modificaciones químicas de sitios específicos en proteínas histonas tienen distintas consecuencias. Por ejemplo, la acetilación en un sitio particular promueve la activación de la expresión génica, mientras que la metilación en ese mismo sitio inhibe la expresión génica. Por el contrario, la metilación en un sitio diferente, trabajando a través de una proteína adaptadora diferente, promueve la activación de la expresión, y la fosforilación de otro sitio más promueve la compactación extrema de los cromosomas antes de la división celular. Allis ha jugado un papel importante en el descubrimiento de muchas de estas modificaciones de histonas y el mecanismo de sus efectos. Es importante destacar que estas modificaciones químicas pueden persistir, proporcionando una memoria celular que sostiene la diferenciación de los tipos de células y pueden cebar genes particulares que se han activado transitoriamente, por ejemplo, en respuesta a una lesión, para que estén listos para una reactivación inmediata en caso de lesión en el mismo sitio se repite.

Grunstein y Allis desempeñaron un papel clave en la apertura de este campo robusto y han desempeñado papeles directos en muchos de estos descubrimientos transformadores.

La importancia de estas modificaciones de histonas se ha vuelto cada vez más clara con el tiempo. Algunas anomalías clásicas del desarrollo en la mosca de la fruta Drosophila, en las que una parte del cuerpo se transforma en otra, demostraron ser causadas por mutaciones que anulan las enzimas modificadoras de histonas. Y en los últimos años estos hallazgos se han extendido a los humanos, donde las mutaciones en modificadores de histonas y lectores de estas modificaciones son la causa más frecuente de malformaciones congénitas como la cardiopatía congénita y también son una causa frecuente de anomalías del neurodesarrollo como el autismo. Además, las mutaciones somáticas en docenas de modificadores de histonas diferentes o en los sitios de las histonas que modifican son impulsoras de una amplia gama de cánceres. En un ejemplo sorprendente, los gliomas pediátricos, un cáncer cerebral devastador, comúnmente se atribuyen a una sola mutación de histona recurrente en un sitio normalmente metilado por una enzima modificadora de histonas. El equipo de Allis ha demostrado que esta histona mutante se une estrechamente a su enzima modificadora, secuestrándola y evitando que haga su trabajo normal.

Todo este trabajo ha estimulado los esfuerzos para desarrollar nuevas terapias que se dirijan a estas enzimas modificadoras de histonas, algunas de las cuales se encuentran ahora en uso clínico de rutina, por ejemplo, los inhibidores de enzimas que eliminan los grupos acetilo de las histonas son beneficiosos en cánceres, incluido el linfoma cutáneo de células T y mieloma múltiple, y muchos más se encuentran en investigación clínica para diversas enfermedades.

Los descubrimientos de Grunstein y Allis fueron originales e imprevistos y han transformado nuestra comprensión de la regulación de la expresión génica. Su trabajo también fue valiente, dedicando años de esfuerzo, superando desafíos técnicos desalentadores en sus programas de investigación, mientras nadaba contra una fuerte corriente de un campo avanzado que no preveía la necesidad de un papel para las proteínas histonas en la regulación genética. Además, vale la pena señalar que los descubrimientos de Grunstein y Allis provienen de sus perspicaces selecciones de sistemas experimentales simples para el estudio: levadura y Tetrahymena. Estos sistemas simples han producido innumerables conocimientos fundamentales sobre la biología, lo que nos recuerda que el apoyo público a la investigación impulsada por la curiosidad sigue produciendo conocimientos profundos que, en última instancia, impactan en nuestra comprensión de la salud y la enfermedad humanas. Me complace felicitar a Michael y David por sus espectaculares logros científicos que merecen excepcionalmente el Premio de Investigación Médica Básica Albert Lasker de este año.


Desplazamiento de histonas en promotores de Saccharomyces cerevisiae Los genes de choque térmico se asocian diferencialmente con la acetilación de histona H3

HIGO. 1. Cinética del desplazamiento de la histona H3 en los promotores de genes de choque térmico. (A) Doble desplazamiento de histona H3 (y eje) a lo largo del tiempo (0 a 64 min) (X eje) en relación con el nivel sin choque térmico (0 "), que se estableció arbitrariamente en 1. Todos los valores de PCR en tiempo real se normalizaron en relación con el PHO5 promotor, que se sabe que contiene nucleosomas posicionados que no cambian durante el choque térmico (13). Los valores representan medias ± desviaciones estándar (norte ≥ 3). (B) El mismo experimento que en el panel A, excepto que los chips se realizaron con anticuerpos producidos contra la forma acetilada de H3. (C) Cambio relativo de abundancia de H3 acetilado (AcH3) / H3 (y eje), calculado a partir de los datos de los paneles A y B. Abundancia de AcH3 / H3 = desplazamiento de H3 / pérdida de AcH3. (Nota: el valor de desplazamiento [pérdida] es un valor inverso de abundancia). HIGO. 2. Cinética del desplazamiento de la histona H4 en los promotores de genes de choque térmico. Se realizó un experimento como en la Fig. 1, excepto que los chips se realizaron con anticuerpos anti-H4. Se utilizó una cepa que expresa una versión etiquetada con myc de H4. (A) Desplazamiento de H4 total (anticuerpo anti-myc). (B) Pérdida de H4 acetilado (anticuerpo anti-tetra-acetil H4). (C) Cambio en la relación H4 acetilada (AcH4) / H4 total, calculada a partir de los datos de los paneles A y B, como se describe en la leyenda de la Fig. 1. HIGO. 3. Cinética de la remodelación de la cromatina en el HSP12 promotor en cepas que expresan diferentes versiones de HSF. Los datos de los paneles A, B y C están representados en el mismo formato que en la Fig. 1. Los dibujos animados de la izquierda representan mapas de las construcciones HSF expresadas en las cuatro cepas de levadura diferentes. Nota: la expresión de constructos representa la única fuente de HSF. HIGO. 4. Cinética de la remodelación de la cromatina en el HSP82 promotor en cepas que expresan diferentes versiones de HSF. Los datos de los paneles A, B y C se representan en el mismo formato que en la Fig.1. HIGO. 5. Cinética de la remodelación de la cromatina en el SSA4 promotor en cepas que expresan diferentes versiones de HSF. Los datos de los paneles A, B y C se representan en el mismo formato que en la Fig.1. HIGO. 6. La abundancia de HSF aumenta diferencialmente en los promotores de genes de choque térmico con el cambio de temperatura. (A) Abundancia de HSF antes del choque térmico en los promotores indicados. Las señales de PCR en tiempo real para muestras sin choque se normalizaron a PHO5 y para ingresar. (B) Cambio de abundancia de HSF en el HSP12 promotor durante el transcurso del tiempo del choque térmico en relación con el nivel sin choque térmico (0 ′), que se fijó arbitrariamente en 1. (C y D) El mismo experimento que se muestra en el panel B, excepto que las señales se obtuvieron para el HSP82 y SSA4 promotores, respectivamente. HIGO. 7. Cinética de la carga de Pol II en promotores de genes de choque térmico. Los datos en los paneles A a D se representan en el mismo formato que en la Fig.6, excepto que en lugar de normalizar al PHO5 La normalización del promotor se realizó en la región intergénica del cromosoma V (ver Materiales y Métodos para las secuencias de los cebadores). HIGO. 8. El desplazamiento dramático de histonas durante la activación de genes de choque térmico no se asocia uniformemente con acetilación robusta de histonas H3. El modelo molecular representa esquemáticamente los procesos diferenciales en los tres promotores de genes de choque térmico estudiados durante la inducción de la transcripción. Nucleosomas acetilados enriquecidos con H3 en el estado intermedio en el HSP12 y HSP82 los promotores están representados en violeta. Los nucleosomas con H3 no acetilado se muestran en marrón. El HSF inactivo en el estado no inducido se representa en azul y el HSF activado se muestra en rojo. Los niveles intermedios de carga de HSF y Pol II están representados por dibujos animados reducidos para las proteínas correspondientes. El desplazamiento de histonas está representado por una cantidad decreciente de nucleosomas en el estado intermedio. Las caricaturas del estado intermedio representan aproximadamente la situación de los promotores después de 2 minutos de choque térmico.

Información de soporte

S1 Fig. Análisis del nivel de proteína acetiltransferasa.

Análisis de transferencia Western de p300 (A) y PCAF (B) en extractos de células tratadas con PJ34 durante 3 h en relación con células no tratadas (NT). Los histogramas indican el nivel de proteína p300 y PCAF, normalizado con α tubulina, de las células tratadas con PJ34 durante 3 h (negro) en relación con las células no tratadas (NT, gris). Los anticuerpos utilizados fueron: anti-KAT3B / p300 CT monoclonal de ratón (Millipore, 05-257), anti-KAT2B / PCAF policlonal de conejo (abcam, ab12188) y anticuerpo monoclonal de rata anti-α tubulina (Santa Cruz Biotechnology, sc-53030) .

S2 Fig. Mapa de los fragmentos de promotor usados ​​en los ensayos de ChIP.

Para cada gen se indican el TSS (Transcriptional Start Site) y el ATG.

S3 Fig. Análisis de la expresión de PARG.

(A) qRT-PCR de Parg Nivel de ARNm de las células NIH3T3 tratadas con PJ34 durante los tiempos indicados, en relación con las células no tratadas. Los valores de ARNm se normalizaron a la expresión media de dos genes de mantenimiento, Gusb y Hprt1. Las sondas Taqman fueron: Mm00449466_m1 para Parg, Mm00446956_m1 para Gusby Mm00446968_m1 para Hprt1. Las condiciones de qRT-PCR fueron las descritas en Ciccarone et al., Plos One 2008. Las barras de error indican la desviación estándar de los datos obtenidos de tres experimentos independientes. (B) Western blot de extractos de células enteras de las mismas células que en (A) ejecutados en una SDS-PAGE al 8% y probados con anti-PARG (Santa Cruz sc-21480), anti-PAR o anti-tubulina anticuerpos.

S4 Fig. Análisis del nivel global de acetilación de histonas en células L929 y N2a.

(A) Western blot de extractos de células completas de células L929 tratadas con el inhibidor PJ34 (5 M) durante 3 h en relación con las células no tratadas (NT, valor

1), se realiza en una SDS-PAGE al 15%, se sondea con anticuerpos anti-acetil-histona H3 o anti-C-terminal de H3 para medir el nivel relativo de acetilación de H3. Las barras de error indican la desviación estándar de los datos obtenidos de los tres experimentos independientes.(B) Igual que en (A) pero la hibridación se realizó con anticuerpos anti-acetil-histona H4 o anti-C-terminal de H4 para medir el nivel relativo de acetilación de H4. (C) Los mismos extractos usados ​​en los paneles A y B se procesaron en un SDS-PAGE al 8% y se sondaron con anticuerpo anti-PAR para visualizar el nivel de polímeros de ADP-ribosa. Paneles D, E y F: igual que en A, B y C, respectivamente, pero el análisis se realizó con extractos de células completas de células de neuroblastoma N2a.

S5 Fig. Análisis del nivel global de acetilación de la histona H3 tras la sobreexpresión de CTCF.

(A) Transferencia de Western de proteínas totales de células transfectadas con vector vacío (pCI) o CTCF recombinante marcado con His (pCI-CTCF-His, Guastafierro et al., J. Biol. Chem 2008) ejecutado en una SDS-PAGE al 8% y se sondaron con anticuerpo anti-PAR. (B) Igual que en (A) pero la hibridación se realizó con anticuerpo anti-His para visualizar CTCF, y con anti-Lamin B1, como control de carga de proteína. (C) Los mismos extractos usados ​​en el panel A y B se procesaron en un SDS-PAGE al 15% y se sondaron con anticuerpos anti-acetil-histona H3 y anti-C-terminal de H3.

S6 Fig. Análisis del nivel global de acetilación de histonas en presencia de galotanino.

(A) Western blot de extractos de células enteras de células NIH 3T3 tratadas con el inhibidor de PARG galotannin (ácido tánico, Sigma) (30 M) durante los tiempos indicados en relación con las células no tratadas (NT) ejecutadas en una SDS-PAGE al 8%, y sondeado con anticuerpo anti-PAR para visualizar polímeros de ADP-ribosa. (B) Los mismos extractos que en (A) se procesaron en una SDS-PAGE al 15% y se sondaron con anticuerpos anti-acetil-histona H3 o anti-C-terminal de H3 para medir el nivel relativo de acetilación de H3. (C) Igual que en (B) pero la hibridación se realizó con anticuerpos anti-acetil-histona H4 o anti-C-terminal de H4 para medir el nivel relativo de acetilación de H4.


Ver el vídeo: Co-occupancy Networks for Histone Modifications and Chromatin Associated Proteins (Julio 2022).


Comentarios:

  1. Marco

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