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¿Cómo ocurre el ataque nucleofílico en la replicación del ADN?

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Hola,

Estoy confundido acerca de cómo ocurre el ataque nucleofílico en la replicación del ADN. Vi este video de un profesor de biología (https://www.youtube.com/watch?v=y4hKibS2fAo)

Vi este video que decía que durante la replicación del ADN, el grupo hidroxl forma un enlace covalente con el fosfato y los dos grupos de fósforo son un grupo saliente.

Entiendo los conceptos básicos de este tipo de reacciones, pero esta parece confusa. Puedo ver que el oxígeno que formaba parte del grupo hidroxl forma un enlace covalente con el fósforo. Pero, ¿qué pasa con el hidrógeno? ¿Y por qué el doble enlace y la posición del HO cambian de posición de la primera imagen a la segunda imagen?

También hay algunas imágenes que muestran la producción de agua. Pero el video indica que el grupo hidroxl está formando un enlace con el grupo fosfato. ¿Cómo funciona?

Muchas gracias


Las polimerasas utilizan un mecanismo de iones de dos metales para llevar a cabo la adición de un nuevo NTP a una cadena de ARN en crecimiento. En este proceso se utilizan dos iones Mg2 +; El ión metálico A participa en la formación del nucleófilo (O-) para que se produzca la reacción SN2 y el ión metálico B participa en la estabilización del estado de transición en la reacción. Para que se produzca la adición de un NTP a una cadena de ARN, un grupo hidroxilo 3 'activado (O-) actúa como nucleófilo y ataca el alfa fosfato del NTP entrante. La reacción se inicia por un evento de desprotonación. El ión metálico A ayuda con esta desprotonación, ya que reduce el pKa del hidroxilo (por lo que es más ácido), lo que facilita la desprotonación y la formación del nucleófilo, el protón es aceptado por un residuo de aspartato cercano (no agua) - doi: 10.1021 / ja403842j. Después del ataque de hidroxilo, el mecanismo pasa por un estado de transición pentacovalente como en una reacción estándar de Sn2 y el grupo pirofosfato (PPi) se expulsa. La imagen no es mía pero viene de este artículo: https://doi.org/10.1038/34542, que es bastante bueno, al igual que este artículo: doi: 10.1074 / jbc.274.25.17395 y este https: // doi .org / 10.1016 / j.molcel.2006.03.013


Replicación y reparación del ADN

La replicación del ADN es el proceso mediante el cual se copia el material genético que está codificado en una secuencia de ADN para que pueda pasar a nuevas células y descendencia. Para los humanos, la replicación del ADN es la razón por la que tenemos similitudes con nuestros padres y parientes.

Si bien el objetivo de la replicación es producir una copia idéntica del ADN original, los errores en el proceso lo hacen imposible y conducen a mutaciones. Aunque estas mutaciones pueden ser fatales para las células, muchas no lo son y actúan como un medio para diversificar la descendencia celular. El proceso de replicación es esencial para el crecimiento y la reproducción celular.

Comenzaremos nuestra discusión mirando globalmente cómo ocurre la replicación del ADN y qué tipos de mutaciones ocurren comúnmente. Luego, veremos más específicamente las moléculas responsables de facilitar la replicación y los mecanismos químicos detrás del proceso. Finalmente, veremos cómo los sistemas de reparación incorporados que usa el ADN para producir copias fieles mantienen bajas tasas de mutación.

2 & # 8242 trifosfato de desoxirribonucleósido & # 8211 Los componentes básicos de la replicación del ADN. Un anillo de azúcar ribosa de cinco miembros que contiene oxígeno que tiene tres grupos fosfato unidos a su carbono 5 & # 8242 y un grupo base de adenina, citosina, guanina o timina unido a su carbono 1 & # 8242.

Escisión de pares de bases & # 8211 Una clase de sistema de reparación de ADN. Reconoce y elimina mutaciones de un solo nucleótido que resultan de bases no naturales.

Hebra hija & # 8211 Se refiere a la hebra de ADN recién sintetizada que se copia mediante la adición de nucleótidos complementarios de una hebra de ADN preexistente durante la replicación del ADN.
DNA Helicase & # 8211 La enzima responsable de separar las dos hebras de ADN en una hélice para que puedan copiarse durante la replicación del ADN.

ADN ligasa& # 8211 La enzima responsable de sellar juntas roturas o mellas en una hebra de ADN. Responsable de unir fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada durante la replicación del ADN.
ADN polimerasa & # 8211 La enzima responsable de catalizar la adición de sustratos de nucleótidos al ADN tanto durante como después de la replicación del ADN.

Primase & # 8211 La enzima responsable de iniciar la síntesis de cebadores de ARN en la hebra rezagada durante la replicación del ADN.

Holoenzima & # 8211 Término utilizado para describir una colección de diferentes enzimas que trabajan juntas en un proceso dado, como la replicación del ADN.

Hidrólisis & # 8211 El proceso en el que el agua se agrega químicamente a una molécula.

Hebra rezagada & # 8211 En la replicación del ADN, la hebra de ADN preexistente que está orientada en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242 con respecto a la dirección de replicación en la que la síntesis es discontinua.

Filamento principal& # 8211 En la replicación del ADN, la hebra de ADN preexistente que está orientada en la dirección 3 & # 8242 a 5 & # 8242 con respecto a la dirección de replicación en la que la replicación es continua.

Reparación de desajustes & # 8211 Una clase de sistema de reparación de ADN. Reconoce y elimina mutaciones que resultan del emparejamiento de bases que no es complementario.

Fragmento de Okazaki & # 8211 Pequeños tramos de ADN recién sintetizado que se encuentran en la hebra rezagada durante la replicación del ADN.

Origen de la replicación & # 8211 Sitio de inicio de la replicación del ADN. Tramo corto, generalmente interno, en una hélice de ADN que se abre para que cada hebra esté separada para la replicación del ADN.

Hilo padre & # 8211 En la replicación del ADN, se refiere a la hebra única preexistente de ADN que se copia en una nueva hebra de ADN a través del emparejamiento de bases complementarias.

Pirofosfato& # 8211 Una molécula que contiene dos fosfatos. En la replicación del ADN, se libera de un desoxirribonucleósido trifosfato 2 & # 8242 durante su adición a una cadena de ADN recién sintetizada en crecimiento. Su posterior hidrólisis proporciona la energía para la reacción de adición.

Replicación tenedor & # 8211 Término utilizado para describir la unión en la que se agregan sustratos de nucleótidos a una cadena de ADN en crecimiento durante la replicación del ADN. Su forma se asemeja a un & # 8220Y & # 8221 donde las dos ramas representan hebras hijas de ADN monocatenario y la base representa ADN helicoidal.

Cebador de ARN & # 8211 Pequeños tramos de ribonucleótidos (sustratos de ARN) que se encuentran en la hebra rezagada durante la replicación del ADN. Ayuda a iniciar la replicación de hebras rezagadas y luego se eliminan.

Semiconservador& # 8211 Se refiere al hecho de que después de la replicación de una hélice de ADN, cada una de las dos hélices hijas que resultan contiene una hebra de ADN recién sintetizada y una preexistente.

Escisión de parche corto & # 8211 Una clase de sistema de reparación de ADN. Reconoce y elimina tramos cortos de ADN que rodean las mutaciones resultantes de grandes aductos en una hebra de ADN que impiden la replicación del ADN.

Proteína de unión monocatenaria & # 8211 Una proteína involucrada en ayudar a evitar que las hebras de ADN que han sido separadas por la helicasa de ADN retrocedan en una hélice. Funciona recubriendo las hebras simples de tal manera que no cubran las bases, lo que les permite permanecer libres para el emparejamiento de bases.

Dímero de timina & # 8211 Una forma de daño en el ADN que resulta de la radiación. Las timinas adyacentes en la misma hebra de ADN forman un enlace que da como resultado un aducto voluminoso que puede impedir la replicación del ADN.

Tautomerización& # 8211 Un proceso en el que una molécula sufre un reordenamiento de electrones que resulta en una organización ligeramente diferente de la misma molécula. Las dos formas de la misma molécula se denominan & # 8220tautómeros & # 8221 entre sí.

Replicación de ADN

La replicación del ADN es semiconservadora

La replicación del ADN de una hélice de ADN da como resultado dos hélices idénticas. Si la hélice de ADN original se llama ADN & # 8220parental & # 8221, las dos hélices resultantes pueden llamarse hélices & # 8220hija & # 8221. Cada una de estas dos hélices hijas es una copia casi exacta de la hélice parental (no es 100% igual debido a mutaciones). El ADN crea & # 8220 hijas & # 8221 utilizando las hebras parentales de ADN como plantilla o guía. Cada hebra de ADN recién sintetizada (hebra hija) se obtiene mediante la adición de un nucleótido que es complementario a la hebra original de ADN. De esta manera, la replicación del ADN es semiconservadora, lo que significa que una hebra madre siempre se transmite a la hélice hija del ADN.

Bifurcaciones de replicación y orígenes de la replicación

El primer paso en la replicación del ADN es la separación de las dos hebras de ADN que forman la hélice que se va a copiar. La DNA Helicase desenrolla la hélice en lugares llamados orígenes de replicación. El origen de la replicación tiene forma de Y y se denomina horquilla de replicación. La horquilla de replicación desciende por la hebra de ADN, generalmente desde una ubicación interna hasta el final de la hebra. El resultado es que cada horquilla de replicación tiene una horquilla de replicación gemela, que se mueve en la dirección opuesta desde esa misma ubicación interna hasta el extremo opuesto de la hebra & # 8217. Las proteínas de unión monocatenarias (SSB) trabajan con la helicasa para mantener desenrollada la hélice del ADN parental. Funciona recubriendo las hebras desenrolladas con subunidades rígidas de SSB que evitan que las hebras se vuelvan a juntar en una hélice. Las subunidades SSB recubren las hebras simples de ADN de una manera que no cubren las bases, lo que permite que el ADN permanezca disponible para el emparejamiento de bases con las hebras hijas recién sintetizadas.


cuando las dos cadenas parentales de ADN se separan para comenzar la replicación, una cadena se orienta en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242 mientras que la otra cadena se orienta en la dirección 3 & # 8242 a 5 & # 8242. La replicación del ADN, sin embargo, es inflexible: la enzima que lleva a cabo la replicación, la ADN polimerasa, solo funciona en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Esta característica de la ADN polimerasa significa que las hebras hijas se sintetizan a través de diferentes métodos, uno agregando nucleótidos uno por uno en la dirección de la bifurcación de replicación, el otro capaz de agregar nucleótidos solo en trozos. La primera hebra, que replica los nucleótidos uno por uno, se llama hebra principal y la otra hebra, que se replica en trozos, se llama hebra rezagada.

Las hebras principales y rezagadas

El hilo conductor

Dado que la replicación del ADN se mueve a lo largo de la cadena madre en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242, la replicación puede ocurrir muy fácilmente en la cadena principal. Como se ve en, los nucleótidos se añaden en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Activada por la ARN primasa, que agrega el primer nucleótido a la cadena naciente, la ADN polimerasa simplemente se encuentra cerca de la horquilla de replicación, moviéndose como lo hace la horquilla, agregando nucleótidos uno tras otro, preservando la orientación antiparalela adecuada. Este tipo de replicación, dado que implica que un nucleótido se coloca inmediatamente después de otro en una serie, se llama continua.

La hebra rezagada

Mientras que la ADN polimerasa en la hebra principal puede simplemente seguir la bifurcación de replicación, debido a que la ADN polimerasa debe moverse en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242, en la hebra rezagada la enzima debe alejarse de la bifurcación. Pero si la enzima se aleja de la bifurcación, y la bifurcación está descubriendo nuevo ADN que necesita ser replicado, entonces, ¿cómo se puede replicar la hebra rezagada? El problema que plantea esta pregunta se responde a través de un método ingenioso. La hebra rezagada se replica en pequeños segmentos, llamados fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos son tramos de 100 a 200 nucleótidos en humanos (1000 a 2000 en bacterias) que se sintetizan en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242 alejándose de la horquilla de replicación. Sin embargo, mientras que cada segmento individual se replica lejos de la bifurcación de replicación, cada fragmento de Okazaki posterior se replica más de cerca a la bifurcación de replicación que retrocede que el fragmento anterior. Luego, estos fragmentos se unen mediante ADN ligasa, creando una hebra continua. Este tipo de replicación se denomina discontinua.

Como puede ver en la figura anterior, el primer fragmento de Okazaki sintetizado en la hebra rezagada es el más alejado de la bifurcación de replicación, que a su vez retrocede hacia la derecha. Cada fragmento de Okazaki posterior comienza en la bifurcación de replicación y continúa hasta que se encuentra con el fragmento anterior. Luego, los dos fragmentos se unen mediante ADN ligasa.

En la figura anterior, también podemos ver cómo la replicación en la hebra rezagada permanece ligeramente por detrás de la de la hebra principal. Debido a que la síntesis en la hebra rezagada tiene lugar en un mecanismo de & # 8220 pespunteado & # 8221, su replicación se retrasa ligeramente en relación con la síntesis en la hebra principal. La hebra rezagada debe esperar a que un parche de la hélice madre se abra una distancia corta frente a la hebra recién sintetizada antes de que pueda comenzar su síntesis de regreso al final de la hebra hija. Este tiempo & # 8220lag & # 8221 no ocurre en la hebra principal porque sintetiza la nueva hebra siguiendo justo detrás a medida que la hélice se desenrolla en la bifurcación de replicación.
Otra complicación de la replicación en la hebra rezagada es el inicio de la replicación. Mientras que el cebador de ARN de la hebra principal solo tiene que desencadenar el inicio de la hebra una vez, en la hebra rezagada se debe desencadenar cada fragmento de Okazaki individual. En la hebra rezagada, entonces, una enzima llamada primasa que se mueve con la horquilla de replicación sintetiza numerosos cebadores de ARN, cada uno de los cuales desencadena el crecimiento de un fragmento de Okazaki. Los cebadores de ARN eventualmente se eliminan dejando espacios que son llenados por la maquinaria de replicación.

Problemas

Problema: ¿Por qué la replicación del ADN se denomina & # 8220 semiconservativa & # 8221?
La replicación del ADN es semi-conservadora porque cada hélice que se crea contiene una hebra de la hélice de la que se copió. La replicación de una hélice da como resultado dos hélices hijas, cada una de las cuales contiene una de las hebras helicoidales parentales originales. Es semiconservador porque la mitad de cada hélice madre se conserva en cada hélice hija.
Problema: el número de horquillas de replicación en una hélice de ADN suele ser un número par. Explique este hallazgo.
Dado que los orígenes de replicación generalmente no se encuentran al final de una hélice, sino internamente a una hélice, un origen de replicación conduce a la formación de dos horquillas de replicación. Las horquillas de replicación, por lo tanto, generalmente se encuentran en pares.
Problema: ¿En qué dirección (5 & # 8242 a 3 & # 8242 o 3 & # 8242 a 5 & # 8242) tiene lugar la replicación biológica del ADN?
La replicación del ADN biológico SIEMPRE tiene lugar en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242.
Problema: La hebra en la que la replicación del ADN es continua se llama ___________. La hebra en la que la replicación del ADN es discontinua se llama ___________.
Filamento principal. Hebra rezagada.
Problema: ¿La replicación en la hebra rezagada está mediada por pequeños segmentos de nucleótidos llamados qué?
Fragmentos de Okazaki.

La química de la adición de sustratos de replicación del ADN

Mientras que la hebra principal y la hebra retrasada se replican de manera diferente, cada nucleótido individual agregado a cada hebra se une a través del mismo mecanismo. En esta sección, examinaremos el mecanismo de unión de nucleótidos. Nota: las clases como Biología AP no requieren que conozca los temas cubiertos en esta sección.

Los componentes básicos de la replicación del ADN son los desoxirribonucleótidos
Los bloques de construcción agregados a una cadena hija en crecimiento son nucleótidos individuales. Recuerde, en el ADN falta el grupo -OH en la posición 2 & # 8242 del anillo de ribosa. Como resultado, los sustratos para la síntesis de ADN se denominan desoxirribonucleótidos 2 & # 8242.

Figura%: 2 y # 8242 Trifosfato de desoxirribonucleósido
Unido a cada anillo de desoxirribosa hay un grupo base (C, G, A o T) y un grupo trifosfato. Los tres fosfatos se denominan alfa, beta y gamma (siendo alfa el más cercano al anillo de ribosa). Estos fosfatos juegan un papel clave en la adición de nucleótidos posteriores a la cadena hija.

La adición se produce a través de un ataque nucleofílico

Los desoxirribonucleósidos trifosfatos, como acabamos de decir, son los componentes básicos del ADN. Recuerde, además, que una cadena completa de polinucleótidos de ADN tiene solo un grupo fosfato y que a través de este grupo fosfato cada nucleótido se une al siguiente. Entonces, ¿por qué el sustrato es un trifosfato en lugar de solo un monofosfato? La respuesta a esta pregunta radica en la química subyacente a la adición de nucleótidos a una cadena hija de ADN en crecimiento.

Si bien cada nucleótido agregado a una cadena de ADN en crecimiento carece de un grupo -OH en su posición 2 & # 8242, retiene su -OH 3 & # 8242. Este grupo hidroxilo se usa para atacar el grupo alfa fosfato de un nucleósido trifosfato entrante. En el ataque, el 3 & # 8242 -OH reemplaza los fosfatos beta y gamma que son expulsados ​​del complejo como una molécula de pirofosfato. El resultado es la formación del enlace fosfodiéster entre la cadena hija en crecimiento y el siguiente nucleótido. El 3 & # 8242-OH del nucleótido recién agregado ahora está expuesto en el extremo de la cadena en crecimiento y puede atacar al siguiente nucleótido de la misma manera.

Figura%: Adición de nucleótidos a una hebra hija en crecimiento
La figura anterior presenta un esquema simplificado de una cadena de polinucleótidos en crecimiento. Las líneas representan el azúcar ribosa con un 3 & # 8242 -OH ramificado a partir de él. Cada p representa un grupo fosfato. Esta figura ilustra varios puntos clave de la replicación del ADN. Primero, vemos que la hebra padre está orientada en la dirección 3 & # 8242 a 5 & # 8242. En segundo lugar, cada nuevo nucleótido agregado a la hebra hija en crecimiento es complementario al nucleótido de la hebra parental que está frente a ella y se forma un enlace entre ellos. Finalmente, vemos cómo el grupo 3 & # 8242 -OH desplaza los dos grupos fosfato más externos de un nucleótido entrante para agregarlo a la cadena en crecimiento.

La fuerza impulsora de la reacción de adición

Cada nucleótido entrante suministra la energía para su adición en el enlace de alta energía entre los fosfatos beta y gamma que se expulsan al agregarse. No es la liberación del pirofosfato lo que impulsa la reacción, sino la posterior hidrólisis que tiene lugar. Se libera una cantidad mucho mayor de energía cuando los dos fosfatos se separan en fosfatos individuales a través de la reacción de hidrólisis.

Problemas →
Problema: ¿Qué dicta qué nucleósido trifosfato se agregará junto a una cadena de ADN en crecimiento?
La adición química de nucleótidos a una cadena de ADN en crecimiento está dictada por la cadena madre que se está copiando. Se agregará un trifosfato de nucleósido con una base complementaria a la de la hebra original a una cadena en crecimiento.

Problema: ¿Qué grupo lateral de un nucleósido trifosfato (componente básico del ADN) es responsable de mediar la adición del siguiente nucleótido?
La adición de nucleótidos se produce a través de un ataque nucleofílico del 3 & # 8242 –OH sobre el grupo de azúcar desoxirribosa de un nucleótido situado al final de una cadena de ADN en crecimiento.

Problema: ¿Qué proporciona la energía para la adición de nucleótidos a una cadena de ADN en crecimiento durante la replicación?
Durante la reacción de adición, se libera un grupo pirofosfato del nucleósido trifosfato que se agrega. La hidrólisis posterior del pirofosfato # 8217 proporciona la energía que impulsa la reacción de adición.

Problema: verdadero o falso. La replicación del ADN ocurre en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242 porque la replicación 3 & # 8242 a 5 & # 8242 es químicamente imposible. Explica tu respuesta.

Falso. Si bien la replicación del ADN ocurre en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242, la razón no es porque la replicación 3 & # 8242 a 5 & # 8242 sea químicamente imposible. 3 & # 8242 a 5 & # 8242, en principio, la replicación puede ocurrir. El 3 & # 8242 –OH del nucleótido entrante en lugar del nucleótido unido al final de la cadena en crecimiento sería el grupo atacante.

Problema: ¿Por qué la replicación de la hebra retrasada es más complicada que la replicación de la hebra principal?
La síntesis de hebras rezagadas es más compleja debido al requisito de que la replicación del ADN tenga lugar en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242. Dado que las hebras madre están orientadas de una manera antiparalela, una hebra está orientada en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242, mientras que la otra hebra está orientada en la dirección 3 & # 8242 a 5 & # 8242. La síntesis en la cadena que está orientada en la dirección 3 & # 8242 a 5 & # 8242 (cadena principal) puede ocurrir fácilmente porque la replicación simplemente comienza en el extremo 3 & # 8242 (sintetizando el extremo 5 & # 8242 de la cadena hija) y continúa junto con la bifurcación de replicación. La síntesis en la hebra que está orientada en la dirección 5 & # 8242 a 3 & # 8242 (hebra rezagada) no puede seguir la dirección de la horquilla de replicación porque eso conduciría a la síntesis 3 & # 8242 a 5 & # 8242 de la hebra hija. En cambio, la síntesis debe ocurrir en pequeños segmentos para preservar la dirección de síntesis adecuada.

Lectura de pruebas de ADN y reparación
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Errores en la replicación del ADN

La baja tasa general de mutación durante la replicación del ADN (cambio de 1 par de bases en mil millones de pares de bases por ciclo de replicación) no refleja el número real de errores que tienen lugar durante el proceso de replicación. El número se mantiene tan bajo por un sistema de corrección de pruebas que verifica el ADN recién sintetizado en busca de errores y los corrige cuando se encuentran. Los errores en la replicación del ADN pueden tomar diferentes formas, pero generalmente giran en torno a la adición de un nucleótido con la base incorrecta, lo que significa que el emparejamiento entre las bases de las cadenas madre e hija no es complementario. La adición de una base incorrecta puede tener lugar mediante un proceso llamado tautomerización. Un tautómero de un grupo de bases es un ligero reordenamiento de sus electrones que permite diferentes patrones de enlace entre bases. Esto puede llevar a un emparejamiento incorrecto de C con A en lugar de G, por ejemplo.

Figura%: tautomerización de citosina

El ADN conserva su alto nivel de precisión con su función de corrección de pruebas.

La exonucleasa de lectura de pruebas 3 & # 8242 a 5 & # 8242

La exonucleasa de corrección de pruebas 3 & # 8242 a 5 & # 8242 funciona escaneando directamente detrás a medida que la ADN polimerasa agrega nuevos nucleótidos a la hebra en crecimiento. Si el último nucleótido agregado no coincide, entonces la holoenzima de replicación completa retrocede, elimina la última base incorrecta e intenta agregar la base correcta nuevamente. La enzima es & # 82203 & # 8242 a 5 & # 8242 & # 8221 porque escanea en la dirección opuesta a la replicación del ADN, que aprendimos que siempre debe ser 5 & # 8242 a 3 & # 8242. El mecanismo del sistema de corrección de pruebas ofrece una explicación de por qué la replicación del ADN debe ocurrir en esta dirección.

Teniendo en cuenta el mecanismo químico que aprendimos para la adición de nucleótidos a la cadena de ADN en crecimiento, imagine lo que sucede cuando el sistema de corrección de pruebas elimina una base emparejada incorrectamente. La exonucleasa elimina la base escindiendo el enlace fosfodiéster que acaba de formarse. En la síntesis 5 & # 8242 a 3 & # 8242, esto deja el 3 & # 8242 -OH todavía unido al extremo terminal de la hebra en crecimiento listo para atacar otro nucleótido.

Figura%: Acción de exonucleasa 3 & # 8242 a 5 & # 8242

Si la síntesis ocurriera en la dirección opuesta, el extremo terminal de una cadena en crecimiento contendría un grupo trifosfato en lugar de un grupo -OH. Este trifosfato se convertiría en el objetivo de la exonucleasa correctora y su eliminación detendría la replicación del ADN.

Figura%: Síntesis incorrecta 3 & # 8242 a 5 & # 8242

Tipos de daño al ADN

Una vez que el ADN se ha replicado por completo, la cadena hija a menudo no es una copia perfecta de la cadena madre de la que proviene. Las mutaciones durante la replicación y el daño después de la replicación hacen necesario que exista un sistema de reparación para corregir cualquier error en el ADN recién sintetizado. Hay tres fuentes principales de daño al ADN.

Ataque del agua que puede provocar la eliminación de un grupo amina del grupo básico de un nucleótido o la pérdida de todo el grupo básico.
Daño químico que altera permanentemente la estructura del ADN.
Daño por radiación que puede provocar cortes en la columna vertebral del ADN o la formación de dímeros de timina, que se discutirán más adelante.
Estas diferentes fuentes de daño conducen a diferentes categorías de daño al ADN. El daño causado por el ataque de agua puede dar lugar a bases antinaturales. El daño químico y por radiación conduce a la formación de aductos voluminosos o se rompe en la cadena de ADN en crecimiento. En la sección anterior discutimos la exonucleasa correctora de pruebas 3 & # 8242 a 5 & # 8242 que es responsable de corregir los desajustes. Debido a que no es un sistema perfecto, puede pasar por alto bases que no coincidan. Como resultado, una tercera categoría de daño en el ADN son las bases que no coinciden.

Debido a que estas categorías de daños en el ADN son diferentes, se necesitan múltiples sistemas de reparación.

Sistema de reparación de escisión

El primer tipo de sistema de reparación que discutiremos es el sistema de reparación por escisión. Escindir simplemente significa eliminar, por lo que este sistema de reparación funciona eliminando el área dañada. Las enzimas especiales reconocen el ADN dañado. Este sistema de reparación viene en dos formas: reparación por escisión de base y escisión de nucleótidos de parche corto.

Reparación de escisión de pares de bases

En la escisión de pares de bases, los pares de bases individuales se identifican y eliminan. El espacio resultante se llena luego con una ADN polimerasa y la muesca se sella con una ADN ligasa.

Reparación de escisión con parche corto

La escisión de parches cortos varía de la escisión de pares de bases en que sus enzimas reconocerán y eliminarán & # 8220 parches cortos & # 8221 del ADN que están dañados. Estos pequeños parches de daño surgen de lesiones voluminosas como los dímeros de timina. Esta forma de daño es inducida por radiación y conduce a la formación de un enlace entre bases de timina adyacentes en la misma hebra de ADN. Este enlace conduce a una distorsión en el ADN que hace que un pequeño tramo alrededor del dímero de timina no pueda emparejarse correctamente. El sistema de reparación por escisión de parche corto reconoce tales distorsiones y corta la hebra dañada en ambos lados de la región dañada dejando un espacio de 12 pares de bases en la hebra. Luego, una helicasa desenrolla el tramo de la hélice con el daño que luego se puede rellenar y sellar con ADN polimerasa y ligasa. La reparación por escisión de parche corto también se puede utilizar para corregir el daño resultante de bases no naturales.

Reparación de bases no coincidentes

El otro tipo principal de sistemas de reparación corrige el daño resultante de bases no coincidentes, llamado sistema de reparación de discrepancias. El sistema de reparación de desajustes es capaz de identificar errores de desajuste porque tal daño conduce a una pequeña distorsión en la columna vertebral del ADN. Una vez que ha identificado un par de bases que no coinciden, marca el lugar con un corte y luego usa una exonucleasa para digerir o & # 8220 comer & # 8221 el ADN en el marcador. Entonces, una ADN polimerasa puede llenar el espacio con la base apropiada.

Queda una pregunta importante: ¿cómo sabe el sistema de reparación de desajustes la diferencia entre la hebra que contiene la base correcta y aquella en la que debe hacer la incisión? La forma en que distingue las dos hebras es mediante un marcador que se agrega a la hebra principal durante la replicación. Se añade un metilo adicional (-CH3) a los grupos de bases de adenina de la hebra parental y actúa como un indicador para el sistema de reparación de errores de emparejamiento para que sepa hacer sus cortes en la hebra opuesta.

Adeninas metiladas que se encuentran solo en la cadena madre

Problemas
Problema: ¿Cómo funciona la exonucleasa de corrección de pruebas 3 & # 8242 a 5 & # 8242?
La exonucleasa de corrección de pruebas escanea la cadena de ADN recién sintetizada en la dirección opuesta a la replicación del ADN en busca de errores en el apareamiento de bases. Cuando encuentra un error, corta el par de bases incorrecto de la cadena recién sintetizada y la holoenzima de replicación completa retrocede e intenta introducir la base correcta de nuevo.
Problema: ¿Dónde corta la exonucleasa la hebra hija para eliminar una base mal emparejada?
La exonucleasa escinde el enlace fosfodiéster que se encuentra entre el grupo fosfato de la base incorrecta y el 3 & # 8242 –OH de la base anterior en la cadena hija.

Problema: ¿Cuáles son las tres fuentes principales de daño al ADN?
Las tres fuentes principales son la hidrólisis, el daño químico y el daño por radiación.

Problema: ¿Qué sistema de reparación del ADN corrige las mutaciones del dímero de timina?
Sistema de reparación de escisión de parche corto.

Problema: en el sistema de reparación de desajustes, ¿cómo distingue la exonucleasa qué base es la correcta?
Las bases de adenina que se encuentran en la hebra de ADN original o parental se metilan durante la replicación. Cuando la exonucleasa de reparación de errores de emparejamiento encuentra un par de bases de errores de emparejamiento, elimina la base que está en la hebra que carece de adeninas metiladas.


25.1.2 Replicación del ADN en procariotas

La replicación del ADN se ha estudiado bien en bacterias principalmente debido al pequeño tamaño del genoma y a los mutantes disponibles. E. coli tiene 4,6 millones de pares de bases (Mbp) en un solo cromosoma circular y todo se replica en aproximadamente 42 minutos, a partir de un solo origen de replicación y avanzando alrededor del círculo bidireccionalmente (es decir, en ambas direcciones) (Figura 25.1.3). Esto significa que se agregan aproximadamente 1000 nucleótidos por segundo. El proceso es bastante rápido y se produce con pocos errores. E. coli tiene un solo origen de replicación, llamado oriC, en su único cromosoma. El origen de replicación tiene una longitud de aproximadamente 245 pares de bases y es rico en secuencias de adenina-timina (AT).

Figura 25.1.3 Replicación del ADN procariota. La replicación del ADN en procariotas comienza en un solo origen de replicación, que se muestra en la figura de la izquierda, y avanza de manera bidireccional alrededor del cromosoma circular hasta que se completa la replicación. La naturaleza bidireccional de la replicación crea dos bifurcaciones de replicación que median activamente en el proceso de replicación. La figura de la derecha muestra un modelo dinámico de este proceso. Los puntos rojos y azules representan la incorporación de nucleótidos de la cadena hija durante el proceso de replicación.

Descripción general de la replicación

Las regiones abiertas de ADN que se están replicando activamente se denominan horquillas de replicación. Todas las proteínas involucradas en la replicación del ADN se agregan en el horquillas de replicación para formar un complejo de replicación llamado repulsivo(Tabla 25.1.1 y Figura 25.1.4).Replicación del ADN en el organismo modelo. E. coli ha sido ampliamente estudiado, proporcionando una base para comprender los diversos mecanismos de duplicación del genoma empleados por todos los organismos. En E. coli, La replicación del ADN se inicia en oriC (Figura 25.1.3). oriC es & lsquomelted & rsquo por la acción del Proteína iniciadora de DnaA para exponer dos hebras de ssDNA de plantilla que actúan como plataformas para cargar el replicativo DnaB helicasa. Se carga un hexámero de DnaB completo en cada hebra de ssDNA con la ayuda del cargador de helicasa, DnaC. El ADNss expuesto adicional se recubre rápidamente proteína de unión a ssDNA (SSB), que protege el ADN y bloquea la carga adicional de helicasa DnaB. Cada hexámero de DnaB recluta primasa (DnaG), que sintetiza los cebadores de ARN utilizados para iniciar la síntesis de ADN, junto con las subunidades que componen el replicativo Holoenzima ADN polimerasa III (PolIII HE). Estas proteínas forman los replisomas centrales que copian el E. coli genoma. Una vez ensamblados, los replisomas se replican bidireccionalmente lejos de oriC hasta que, idealmente, se someten a un desmontaje programado en la región de terminación, donde se encuentran ter sitios vinculados por Tus proteínas que crean & lsquoreplication fork traps '. Una vez completada la replicación del ADN, los genomas recién sintetizados se separan y segregan en células hijas.

Tabla 25.1.1 Enzimas involucradas en la replicación del ADN en el procariota, E. coli

Figura 25.1.4 Descripción general de una bifurcación de replicación de ADN. En el origen de la replicación, la topoisomerasa II relaja el cromosoma superenrollado. Se forman dos horquillas de replicación mediante la apertura del ADN de doble hebra en el origen, y la helicasa separa las hebras de ADN, que están recubiertas por proteínas de unión monocatenarias para mantener las hebras separadas. La replicación del ADN ocurre en ambas direcciones. Un cebador de ARN complementario a la hebra parental es sintetizado por la ARN primasa y es alargado por la ADN polimerasa III mediante la adición de nucleótidos al extremo 3 & primo-OH. En la cadena principal, el ADN se sintetiza continuamente, mientras que en la cadena rezagada, el ADN se sintetiza en tramos cortos llamados fragmentos de Okazaki. Los cebadores de ARN dentro de la hebra rezagada se eliminan mediante la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa I, y los fragmentos de Okazaki se unen mediante ADN ligasa.

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Ensamblaje de Primosome

Como se señaló anteriormente, la replicación del cromosoma bacteriano se inicia en o yo C donde la proteína iniciadora, DnaA, se une para iniciar el ensamblaje de la máquina de replisoma enzimático. Las primeras etapas de este proceso implican el montaje de un primosoma, que funciona para desenrollar las dos hebras de ADN en las horquillas de replicación y agregar cebadores de ARN a las plantillas de ADN que serán utilizadas por las enzimas ADN polimerasa para comenzar la replicación. Posteriormente a la remodelación del origen de replicación inducida por DnaA, el ensamblaje del primosoma dependiente del cargador bacteriano ocurre en pasos discretos e involucra al menos cuatro proteínas diferentes (proteína iniciadora, helicasa, proteína cargadora de helicasa y primasa) que actúan de manera coordinada y de manera secuencial (Tabla 25.1.1).

los oriC La región de procariotas contiene motivos de secuencia altamente conservados que incluyen un dominio de caja rico en AT que sirve como secuencia de reconocimiento para la unión de la proteína iniciadora de DnaA. Enlace inicial de DnaA a oriC promueve la fusión de la doble hélice del ADN y el reclutamiento de múltiples subunidades de DnaA que forman un oligómero helicoidal a lo largo del ADN monocatenario (ssDNA) recién abierto (Figura 25.1.5). La proteína DnaA contiene cuatro dominios principales. Los dominios III y IV son parte integral de la unión del ssDNA, mientras que el dominio I está involucrado en las interacciones proteína-proteína. El dominio II forma un enlazador flexible entre el dominio de interacción de proteínas y los dominios de unión al ADN.

Figura 25.1.5 Montaje de un Primosome. ADN derritiéndose en oriC y carga del DnaB6& ndash (DnaC)6 helicasa y complejo ndashloader en la burbuja de ADN. Esquema inferior: el DnaA unido a ATP (la proteína iniciadora) se une a las cajas de DnaA a través del dominio IV, lo que promueve que el dsDNA se enrolle alrededor del filamento de DnaA, lo que provoca una tensión torsional del dsDNA. Mientras tanto, el dominio III de DnaA se une a una de las dos hebras de ssDNA del elemento que se desenrolla del ADN y estira la hebra. Estas interacciones hacen que el elemento desenrollador de ADN rico en AT se derrita, formando una burbuja. Al mismo tiempo, la unión de DnaC (el cargador de helicasa) atrapa a DnaB (la helicasa) en una conformación de arandela de seguridad abierta, para permitir su carga en ssDNA. DnaC interactúa con DnaA al final del filamento y sirve como adaptador para cargar un complejo de DnaB y ndashDnaC. No se sabe si el cierre de DnaB alrededor del ssDNA para formar un anillo hexámero ocurre antes o concomitantemente con la disociación de DnaC. El dominio I de DnaA interactúa con el dominio N-terminal de DnaB, lo que ayuda a cargar otro DnaB & ndashDnaC en la hebra complementaria. Inserciones superiores: el filamento helicoidal de DnaA formado por los dominios III (naranja claro) y IV (verde pálido) de Aquifex aeolicus DnaA (PDB: 3R8F) y dominio IV de E. coli DnaA (verde pálido) unido a dsDNA (PDB: 1J1V). El ssDNA se une en el medio del filamento de DnaA a través de interacciones con AAA + y thinspDomain III de DnaA.

En el E. coli En el sistema, la proteína cargadora de helicasa, DnaC, complejada con ATP, se une a la helicasa hexámera DnaB y forma un complejo de DnaB y ndashDnaC, que ha sido con & # 64257 armado por estudios de crioelectronmicroscopio (crio-EM). La proteína cargadora entrega la helicasa a las hebras simples de ADN fundidas del complejo de nucleoproteínas DnaA & ndash ori C en el origen de la replicación. En vivo , esta entrega está asociada con la proteína iniciadora, DnaA, cuyo dominio amino-terminal (DTN) se cree que tiene un papel en la carga del complejo cargador de helicasa y helicasa en el ori C interactuando con helicasa, DnaB. Después de que la proteína cargadora se disocia del anillo de helicasa, la DTN de la helicasa interactúa con el dominio carboxi-terminal (CTD) de la primasa y forma una primosoma. Dentro del primosoma, la helicasa (DnaB) actúa para desenrollar la hélice bicatenaria y la primasa (DnaG) sintetiza cebadores de ARN en las cadenas de ADN principales y rezagadas.

Helicases son proteínas motoras que se mueven direccionalmente a lo largo de la columna vertebral de un fosfodiéster de ácido nucleico, separando dos cadenas de ácido nucleico hibridadas, como el ADN y el ARN, utilizando energía de la hidrólisis del ATP. Existen muchas helicasas, que representan la gran variedad de procesos en los que se debe catalizar la separación de las hebras. Aproximadamente el 1% de los genes eucariotas codifican helicasas. El genoma humano codifica 95 helicasas no redundantes: 64 helicasas de ARN y 31 helicasas de ADN. Muchos procesos celulares, como la replicación del ADN, la transcripción, la traducción, la recombinación, la reparación del ADN y la biogénesis del ribosoma, implican la separación de cadenas de ácido nucleico que requiere el uso de helicasas. En E. coli, la DnaB Helicasa (Figura 25.1.5) es responsable de desenrollar las dos hebras de ADN parental para desenrollarlas y separarlas entre sí para formar una horquilla de replicación en forma de "Y". Las horquillas de replicación son el sitio real de copia de ADN. Durante la replicación dentro de la bifurcación, las proteínas desestabilizadoras de la hélice, llamadas proteínas de unión monocatenarias (SSB), se unen a las regiones monocatenarias evitando que las hebras se vuelvan a unir.

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ADN polimerasas

Enzimas ADN polimerasa son necesarios para el ensamblaje de las hebras hijas a lo largo de cada una de las hebras de ADN molde.Todas las ADN polimerasas requieren una plantilla de ADN y un cebador que se utiliza para comenzar el proceso de replicación. El cebador es una hebra corta de ARN que la enzima primasa coloca en la plantilla de ADN. Recuerde también que el ADN contiene dos cadenas antiparalelas y que las ADN polimerasas solo pueden agregar nuevos nucleótidos en la dirección 5 'a 3' cuando se sintetizan las cadenas hijas de ADN. Dado que ambas cadenas de ADN se replican simultáneamente por el mismo replisoma, el filamento principal,donde la cadena hija de ADN se mueve en la dirección 5 'a 3', se replica continuamente y fluye en la misma dirección que el movimiento replisome. los hebra rezagada, que se encuentra en la dirección antiparalela, tiene que sintetizarse en la dirección opuesta al movimiento del replisoma y se crea utilizando ráfagas cortas de actividad de la ADN polimerasa que conducen a la formación de Fragmentos de Okazakia lo largo de la hebra de la plantilla.Por lo tanto, la hebra rezagada debe ser cebado continuamente con secuencias cortas de ARN para mantener la formación de la Fragmentos de Okazaki. Las secuencias del cebador de ARN deben reemplazarse por ADN y también deben repararse los huecos en la columna vertebral del ADN.

E. coli tiene un total de cinco Polimerasas de ADN. Tres de estas enzimas están involucradas en la replicación del ADN (ADN polimerasas I, II y III). La ADN polimerasa III es la principal polimerasa involucrada tanto en la biosíntesis de la cadena principal como en la síntesis de los Fragmentos de Okazaki durante la replicación del ADN. La holoenzima de la ADN polimerasa III se compone de 10 proteínas diferentes organizadas en tres ensamblajes funcionalmente distintos, pero físicamente interconectados: (1) el núcleo & alpha & epsilon & theta, (2) el & beta2 abrazadera deslizante, y (3) el & delta & taunorte&gama3-n& delta '& PsiX complejo de cargador de pinzas (Figura 25.1.6). En el núcleo de la polimerasa, & alpha es la subunidad de la polimerasa, & epsilon la exonucleasa de corrección de pruebas 3 & rsquo & ndash5 & rsquo y & theta es una pequeña subunidad que estabiliza & epsilon. Después de que DnaG fabrica un cebador de ARN, & beta2La pinza se carga en el extremo del cebador mediante el cargador de pinzas. Las subunidades & alpha y & epsilon unen por separado la abrazadera, cada una a través de un motivo de unión de abrazadera lineal corto (CBM) a los dos bolsillos de unión CBM simétricamente relacionados de & beta2. Atado a la abrazadera, Pol III es capaz de sintetizar ADN a alta velocidad (& sim1000 & thinspNt / s) y con una procesividad mucho mayor (& gt150 & thinspkb).

Figura 25.1.6 El Replisoma de ADN. (a) El modelo de libro de texto estándar de un Replisoma de ADN que muestra los procesos acoplados y altamente coordinados de síntesis de la hebra principal y la hebra retrasada. La ADN polimerasa III está conectada a la DnaB helicasa a través de la subunidad & tau de los conjuntos de cargador de pinza y dos o tres núcleos de polimerasa replican el ADN de las plantillas de ADN de la cadena principal y de la cadena retrasada al mismo tiempo. El ssDNA en el bucle de la hebra rezagada está unido por proteínas de unión a ssDNA (SSB). (b) Estudios recientes han demostrado que la ADN polimerasa III de E. coli se puede intercambiar fácilmente en la bifurcación y que la síntesis de la hebra principal y la hebra retrasada puede no estar estrechamente acoplada, o incluso puede lograrse mediante diferentes holoenzimas de la ADN polimerasa III. La helicasa DnaB también se puede desacoplar del complejo de ADN polimerasa y desplazarse por delante del vértice de la bifurcación.

Los replisomas bacterianos son máquinas altamente flexibles y móviles, cuya dinámica está mediada y controlada por una red de interacciones proteína y ndashproteína de diferentes potencias. Muchas de las proteínas de replicación son conformacionalmente flexibles o contienen regiones flexibles o no estructuradas, lo que dificulta los estudios estructurales mediante cristalografía de rayos X o RMN. Sin embargo, a través de décadas de esfuerzos, las estructuras de todos E. coli Las proteínas de replicación o sus homólogos bacterianos se han resuelto como complejos, proteínas completas o dominios. Los avances recientes en la microscopía crioelectrónica de una sola partícula (crio-EM) han visto estructuras determinadas de grandes subconjuntos de replisomas, incluso el replisoma del bacteriófago T7 completo, aunque hasta ahora solo con una resolución modesta.

Estructuras Cryo-EM del E. coli Pol III núcleo y ndashclamp y ndash y tauC Los complejos (dominio C-terminal de la subunidad & tau de la pinza-cargador) en el ADN cebador y ndashtemplate en los modos de polimerización y corrección de pruebas se resolvieron recientemente en 8 y 6.7 & thinsp & Aring, respectivamente, junto con las estructuras de un complejo libre de ADN (Figura 9.7). Estas estructuras se asemejan a modelos estructurales propuestos anteriormente, con algunas sorpresas. Por ejemplo, en el complejo de polimerización unido al ADN, el & beta2 la abrazadera se vuelve casi perpendicular a las hebras de ADN (Figura 25.1.7a, b), en contraste con su configuración inclinada en la estructura cristalina de ADN-unido y beta2. Mientras que la subunidad Pol III y alfa polimerasa se une al ADN en una conformación similar a la estructura cristalina del ADN unido Thermus aquaticus (Taq) & alfa, las ubicaciones de los dominios C-terminales (& alphaCTD, que comprenden el dominio de unión a oligonucleótidos, OB, y los dominios de unión a & tau, TBD) son diferentes. En el Taq & alpha y el complejo libre de ADN, & alphaCTD está cerca del sitio activo de la polimerasa con el dominio OB posicionado para unirse y entregar la plantilla de ssDNA en el sitio activo (Figura 25.1.7c, d). En las estructuras crio-EM unidas al ADN, estos dominios se desplazan hacia el dominio del dedo meñique de & alpha, el dominio que contacta directamente con & beta2 abrazadera, por lo tanto, están lejos de la hebra de plantilla que ingresa al sitio activo (Figura 25.1.7e). El dominio OB contacta con los dominios del dedo meñique y pulgar de & alpha, así como con el & beta2 abrazadera y épsilon. La cara del dominio OB que se pensaba que estaba involucrado en la unión de la plantilla de ssDNA ahora se enfrenta directamente y está relativamente cerca del dsDNA. Además, & epsilon encaja entre el dominio del pulgar & alpha y la abrazadera. Esta red de interacción que antes no se apreciaba aparentemente estabiliza todo el complejo.

Figura 25.1.7 Estructuras de la E. coli polimerasa y ndashclamp- y tauCy complejos ndashDNA. (a) Representaciones superficiales de los complejos de polimerización (izquierda) y corrección de pruebas (derecha). Los dominios N-terminales de & alpha (& alphaNTD, residuos 1 & ndash963, están coloreados en salmón profundo), y los dominios de unión OB (964 & ndash1072) y & tau (TBD, 1173 & ndash1160) de & alphaCTD en salmón marrón y oscuro, respectivamente, y epsilon en amarillo, &beta2 en aguamarina, & theta en naranja y & tauC en pizarra. El complejo de polimerización no incluye & theta y & tauC y el & alphaCTD faltan en el complejo de corrección de pruebas. (B) Representaciones de dibujos animados de complejos que muestran las diferencias en el ADN del cebador y del ndashtemplate. En el complejo de polimerización (izquierda), el ADN tiene una estructura en forma B, mientras que en el complejo de corrección de pruebas, el ADN cebador se deshilacha con el extremo de la hebra recién sintetizada en el centro activo de & epsilon. El complejo de corrección de pruebas se gira ligeramente para mostrar el ADN en el centro activo de & epsilon y la subunidad & theta se omite para mayor claridad. (C) Representación de la superficie de & alphaNTD del complejo de polimerización unido a ADN (PDB: 5FKV), que muestra los dominios de pulgar, palma, dedos y PHP. (D) Posicionamiento de & alphaCTD en los complejos libres de ADN (PDB: 5FKU). (mi) Posicionamiento de & alphaCTD en el complejo de polimerización unido a ADN (PDB: 5FKV). Mientras que el dominio OB en el complejo libre de ADN está cerca del sitio activo de Pol III & alpha, está lejos en el complejo unido al ADN. El dominio OB está coloreado en marino y el TBD en magenta. & AlphaNTD (gris) en los dos complejos muestra cambios relativamente menores en comparación con & alphaCTD.

En general, hay cambios conformacionales significativos en el complejo de ADN polimerasa III al unirse al ADN que hacen que la cola de la polimerasa se mueva de interactuar con la pinza en el estado unido al ADN, a una posición 35 & thinsp & Aring alejada de la pinza en el ADN. -estado libre (Video 25.1.1). Se ha planteado la hipótesis de que este gran cambio conformacional puede ayudar a que la polimerasa actúe como un interruptor para facilitar la síntesis de la hebra rezagada. En la hebra rezagada, la polimerasa se reposiciona en un sitio recién cebado cada & sim1000 bp. Para hacerlo, la polimerasa necesita liberar tanto la abrazadera como el ADN. El movimiento en forma de interruptor de la cola de la polimerasa puede desempeñar un papel en la liberación y el consiguiente reposicionamiento de la polimerasa al final del fragmento de Okazaki.

Video 25.1.1 La unión al ADN induce grandes cambios de conformación en el complejo ADN polimerasa III. El video muestra la transformación lineal del estado libre de ADN al estado unido al ADN que muestra el gran cambio de conformación entre los dos estados. La subunidad verde es & beta-clamp, la subunidad & alpha se muestra en naranja con los residuos del sitio activo en magenta, el dominio & alpha-C-terminal (& alpha-CTD se muestra en marrón, la subunidad & epsilon en amarillo y el & tau-tail se muestra en azul.

El complejo de corrección de pruebas es bastante similar al complejo de polimerización, con pequeños movimientos de componentes proteicos individuales (Figura 25.1.7a, b). Los movimientos más significativos incluyen una rotación y una inclinación del ADN dúplex contra el plano de & beta2, bloqueando el ADN contra la superficie interna del & beta2 anillo (Figura 25.1.7b). El dominio del pulgar de la polimerasa y epsilon también se mueven hacia el ADN. El dominio del pulgar se encaja entre dos cadenas de ADN con pares de bases no coincidentes, lo que da como resultado un sustrato de ADN muy distorsionado y deshilachado. Por tanto, la hebra recién sintetizada puede alcanzar el sitio activo de nucleasa de & epsilon para su edición. Teniendo en cuenta que el complejo de corrección de pruebas es bastante similar a los complejos de polimerización y que el ADN dúplex con dos pares de bases no emparejados tiende a deshilacharse, se propone que & epsilon funcione pasivamente esperando que el ADN alcance su centro activo de nucleasa cuando se incorpora un nucleótido incorrecto en lugar de responder activamente al evento de incorporación incorrecta. En un estudio biofísico complementario de una sola molécula, se ha demostrado que el núcleo de Pol III unido a abrazaderas es notablemente estable y procesable en el modo de corrección de pruebas en ausencia de dNTP entrantes.

Durante mucho tiempo se ha creído que los replisomas bacterianos son máquinas altamente coordinadas y altamente procesivas capaces de copiar todo el cromosoma sin disociarse. Dos o tres núcleos de polimerasa del mismo E. coli Se creía que Pol III HE sintetizaba ambas hebras de ADN, reciclándose repetidamente la polimerasa de hebra rezagada para la nueva síntesis de Fragmentos de Okazaki, como se describió anteriormente. Se ha debatido que el reciclado de la polimerasa de hebra retrasada se desencadena por varios mecanismos de colisión o señalización de una manera bien controlada que probablemente implica el movimiento de la región de la cola & tau. Sin embargo, estudios recientes encuentran que las polimerasas bacterianas también se intercambian fácilmente en las bifurcaciones de replicación y que la síntesis de ADN de la cadena principal y la cadena retrasada no siempre puede estar estrechamente acoplada. La figura 9.6b muestra un modelo propuesto para este intercambio.

En general, la ADN polimerasa III es una enzima altamente procesadora que incorpora de 600 a 1.000 bases por segundo con más de 100.000 bases incorporadas por evento de unión y una tasa de error de aproximadamente 1 por millón.

ADN polimerasa I, ayuda en el proceso de síntesis de hebras rezagadas, en el sentido de que esta polimerasa elimina los cebadores de ARN e incorpora ADN en su lugar. ADN polimerasa II, aunque no se comprende bien, se cree que desempeña un papel de edición después de la síntesis de hebra retrasada por la ADN polimerasa I. Las ADN polimerasas I y II también desempeñan un papel en la reparación del ADN, al igual que ADN polimerasas IV y V.

ADN polimerasaIes similar a la ADN polimerasa III en que tiene actividad polimerasa 5 'a 3' y también tiene actividad exonucleasa 3 'a 5' para mediar tanto la procesividad como la función de corrección de pruebas de ADN de la enzima. Además, la ADN polimerasa I también contiene un gran dominio proteico llamado Fragmento de Klenowque exhibe actividad exonucleasa 5 'a 3' (Figura 25.1.8). La actividad exonucleasa 5 'a 3' es responsable de la eliminación de los cebadores de ARN a lo largo de la hebra rezagada. La procesividad de esta enzima permite a la polimerasa rellenar estos huecos con ADN. Sin embargo, la ADN polimerasa I no puede conectar la columna vertebral de los Fragmentos de Okazaki recién sintetizados con el fragmento corriente abajo. La reparación de los huecos en la columna vertebral del ADN está mediada por un Enzima ADN ligasa.

Figura 25.1.8 Estructura de E. coli ADN polimerasa I. La ADN polimerasa I exhibe actividad polimerasa 5 'a 3' y actividad exonucleasa 3 'a 5' que median la procesividad y las actividades de corrección de pruebas de la enzima. La ADN polimerasa I también contiene una actividad exonucleasa de 5 'a 3' alojada en un dominio especial de la enzima llamado fragmento de Klenow. Este dominio es responsable de eliminar las secuencias de cebadores de ARN del ADN recién sintetizado. La actividad polimerasa 5 'a 3' se usa luego para reemplazar el cebador de ARN con ADN. La actividad exonucleasa 3 'a 5' asegura que se incorporen las bases correctas.

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Enzimas ADN ligasa sellar las roturas en la columna vertebral del ADN que se producen durante la replicación del ADN, el daño del ADN o durante el proceso de reparación del ADN. La actividad bioquímica de las ADN ligasas da como resultado el sellado de roturas entre los terminales 5 & prime-fosfato y 3 & prime-hidroxilo dentro de una hebra de ADN. Las ADN ligasas se han diferenciado como dependientes de ATP o dependientes de NAD + dependiendo del cofactor (o cosustrato) que se usa durante su reacción. Normalmente, más de un tipo de ADN ligasa se encuentra dentro de un organismo. Como se muestra en la Figura 25.1.9, la enzima ADN ligasa se modifica covalentemente mediante la adición del resto AMP a un residuo de lisina en la enzima. El AMP se deriva del cofactor ATP o NADH. El 5'-fosfato corriente abajo en el sitio de la muesca del ADN es capaz de mediar un ataque nucleofílico en el complejo AMP-enzima, haciendo que el AMP se transfiera a la posición 5'-fosfato del ADN. El AMP sirve como un buen grupo saliente para el ataque nucleofílico del 3'-OH corriente arriba con el 5'-fosfato para sellar la columna vertebral del ADN y liberar el AMP.

Figura 25.1.9 Reacción de ADN ligasa. Las ADN ligasas catalizan el paso crucial de unir las roturas en el ADN dúplex durante la reparación, replicación y recombinación del ADN, y requieren trifosfato de adenosina (ATP) o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD +) como cofactor. Mostrado en el arriba a la izquierda es la ADN ligasa I que repara el daño cromosómico. Las tres estructuras proteicas visibles son: El dominio de unión al ADN (DBD) que está unido al surco menor del ADN, tanto aguas arriba como aguas abajo del área dañada. El dominio de pliegue OB (OBD) desenrolla el ADN ligeramente en un lapso de seis pares de bases y generalmente está involucrado en la unión de ácidos nucleicos. El dominio de adenilación (AdD) contiene residuos enzimáticamente activos que unen los nucleótidos rotos al catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre un grupo fosfato e hidroxilo. Es probable que todas las ADN ligasas de mamíferos (ligasas I, III y IV) tengan una arquitectura en forma de anillo similar y sean capaces de reconocer el ADN de manera similar. los diagrama superior derechoes una estructura de alta resolución de E. coli LigA en complejo con ADN adenilado cortado de PDB 2OWO, visualizado por UCSF Chimera. Los diversos dominios están indicados por diferentes colores y se relacionan con los dominios Pfam indicados. los diagrama inferior representa el mecanismo catalítico de la ADN ligasa I. El cofactor de ATP forma un enlace covalente con un residuo de lisina en la posición α-fosfato que encierra la liberación de difosfato. El AMP se utiliza para activar el grupo fosfato 5 'permitiendo que el grupo 3'-OH corriente arriba medie el ataque sobre el átomo de fósforo central. AMP sirve como grupo saliente.

Figura en la parte superior izquierda por: Ellenberger, T de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, St. Louis, MO, Figura a la derecha por: Pergolizzi, G., Wagner, GK y Bowater, RP (2016) Biosci Rep 36 (5 ) e00391, y la cifra inferior por: Showalter, A. (2002)

En el video 25.1.2 se muestra un resumen del proceso de replicación del ADN.

Video 9.2 Descripción general del proceso de replicación del ADN

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Enzimas de topoisomerasa

El desenrollado de la hélice de doble hebra en la horquilla de replicación genera una tensión de enrollamiento en el ADN en forma de superenrollamientos positivos aguas arriba de la horquilla de replicación. Enzimas llamadas topoisomerasas contrarreste esto introduciendo superenrollamientos negativos en el ADN para aliviar este estrés en la molécula helicoidal durante la replicación. Hay cuatro enzimas topoisomerasas conocidas que se encuentran en E. coli que se dividen en dos clases principales, topoisomerasas de tipo I y topoisomerasas de tipo II (Figura 25.1.10). La topoisomerasa I y III son topoisomerasas de tipo I, mientras que la ADN girasa y la topoisomerasa IV son topoisomerasas de tipo II.

Figura 25.1.10 Estructuras de topoisomerasa tipo I y tipo II. (A) Estructura cristalina de una topoisomerasa de tipo I, que se muestra en azul, unida al ADN, que se muestra en naranja y amarillo. (B) Estructura cristalina de una topoisomerasa de tipo II. La topoisomerasa II forma una estructura tetramérica, que se muestra en verde y azul. Los cofactores de ATP (rosa) se muestran unidos a la enzima.

Topoisomerasas tipo I aliviar la tensión causada durante el enrollamiento y desenrollado del ADN. Una forma de hacerlo es haciendo un corte o muesca en una hebra de la doble hélice del ADN (Figura 25.1.11). El lado 5'-fosforilo de la hebra de ADN mellada permanece unido covalentemente a la enzima en un residuo de tirosina, mientras que el extremo 3 'se mantiene de forma no covalente por la enzima. Las topoisomerasas de Tipo I rotan o hacen girar el extremo 3 'del ADN alrededor de la hebra de ADN intacta. Esto libera el exceso de enrollamiento en el ADN y efectivamente libera la tensión. La enzima completa la reacción volviendo a sellar el esqueleto del fosfodiéster o ligado la hebra rota de nuevo junto. En general, solo una hebra del ADN se rompe durante el mecanismo de reacción y hay NOrequerimiento de ATP durante la reacción. los E. coli La enzima Topo I solo puede eliminar superenrollamientos de ADN negativos, pero no positivos. Por tanto, esta enzima no participa en el alivio del superenrollamiento positivo causado por la helicasa de ADN durante la replicación. Esto contrasta con el Topo I eucariota que puede aliviar el superenrollamiento tanto positivo como negativo. A pesar de que E. coli La topoisomerasa I no participa directamente en el alivio de la tensión causada por la replicación del ADN, es esencial para E. coli viabilidad. Se cree que ayuda a equilibrar las acciones de las topoisomerasas de tipo II y ayuda a mantener una densidad de superenrollamiento óptima dentro del ADN cromosómico. Por lo tanto, se cree que Topo I ayuda a mantener el equilibrio homeostático del superenrollamiento de los cromosomas dentro E. coli. Topo III, que también es una topoisomerasa de tipo I, parece jugar un papel en la decantación de los cromosomas hijos durante la replicación del ADN, pero no juega un papel en la relajación del superenrollamiento.

Figura 25.1.11 Reacción de las topoisomerasas de tipo I. Durante la reacción, las topoisomerasas de tipo I cortan una hebra del ADN. Un extremo del ADN cortado está unido covalentemente a la enzima, que se muestra en verde claro en los diagramas inferiores.El otro extremo se sostiene de forma no covalente y se gira alrededor de la doble hélice para desenrollar el superenrollamiento y relajar el ADN. Una vez que se libera la tensión del superenrollamiento, la columna vertebral se vuelve a sellar y se libera la enzima Topoisomerasa I.

Figura remezclada de: Notahelix y JoKalliauer, y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano

Las topoisomerasas de tipo II tienen múltiples funciones dentro de la célula. Pueden aumentar o disminuir la tensión del devanado dentro del ADN o pueden desanudar o decatanar el ADN que se ha enredado con otra hebra (Figura 25.1.12). Lo hace mediante un método más peligroso que sus homólogos de Tipo I, al romper ambas hebras del ADN durante su mecanismo de reacción. La enzima se une covalentemente a ambos lados rotos mientras que la otra hélice de ADN pasa a través de la rotura. A continuación, se vuelve a sellar la rotura de doble hebra.

Figura 25.1.12 Reacción de las topoisomerasas de tipo II. El ciclo de reacción de la topoisomerasa de tipo II propuesto está ejemplificado por la topoisomerasa IV. Las subunidades de topoisomerasa IV se indican en gris, cian y amarillo. La puerta o G-DNA está en verde y el transportado o T-DNA está en malva. El ATP unido a los dominios de ATPasa se indica con un punto rojo. En el paso 1, el G-DNA se une a la enzima. El ATP y el segmento de T-DNA se asocian con la enzima en el paso 2. En el paso 3, el G-DNA se escinde y el T-DNA se pasa a través de la rotura. Los dominios dirigidos a fármacos dentro del complejo de topoisomerasa de tipo II se destacan en las subsecciones A, B y C con ejemplos en el lado derecho de la figura.

La ADN girasa es la enzima topoisomerasa de tipo II que participa principalmente en el alivio de la tensión de superenrollamiento positiva que se produce debido a que la helicasa se desenrolla en la horquilla de replicación. Las topoisomerasas de tipo II, especialmente Topo IV, también abordan un desafío mecanicista clave que enfrenta el replisoma bacteriano durante la terminación de la replicación del ADN. La naturaleza circular del cromosoma bacteriano dicta que un par de replisomas que se inician a partir de un solo origen de replicación eventualmente convergerán entre sí en una orientación de cabeza a cabeza. El superenrollamiento positivo se acumula entre los dos replisomas a medida que convergen, pero la actividad de ADN girasa, que normalmente elimina los superenrollamientos positivos, se ve limitado por la cantidad decreciente de ADN molde disponible. E. coli estos deben ser resueltos por Topo IV para que ocurra la segregación cromosómica.

Tus proteínas y la terminación de la replicación

La terminación adecuada de la replicación del ADN es importante para la estabilidad del genoma. E. coli la replicación termina en la región opuesta oriC. Hay diez Terminación de 23 pb (Ter) sitios en la región con algunas variaciones de secuencia que determinan sus afinidades de unión por el proteína de terminación monomérica Tus (Figura 25.1.13). Tus se une a Ter con alta afinidad en una proporción de 1: 1, y Tus & ndashTer puede formar además un complejo & lsquolock & rsquo muy estable si la citosina-6 del par de bases G & ndashC (6) estrictamente conservado de Ter se saca del dúplex de ADN y se une en un bolsillo de Tus de unión a citosina preformado (Figura 25.1.13b). El Tus & ndashTer El complejo de bloqueo es polar con una cara permisiva que permite que el replisome pase sin obstáculos y una cara no permisiva que puede bloquear el replisome. Los diez Ter Los sitios están organizados como dos grupos de cinco orientados de manera opuesta, lo que permite que el replisome pase al primer grupo y se bloquee en el segundo. Esto asegura que las dos horquillas de replicación converjan en la región terminal para una adecuada segregación cromosómica.

Figura 25.1.13 Mecanismos de bloqueo del replisoma de Tus & ndashTer complejos de terminación de replicación.(a) Representación esquemática del E. coli cromosoma, mostrando posiciones de oriC y Ter sitios. La bifurcación que se mueve en el sentido de las agujas del reloj pasa a través de los sitios permisivos que se muestran en verde y se detiene en los sitios no permisivos que se muestran en rojo. (B) Representación esquemática de la estructura del & lsquolocked & rsquo Tus-Ter complejo (PDB: 2I06), que muestra citosina-6 en su bolsillo de unión en Tus. (C) Interacciones del residuo Arg198 de Tus con ambas hebras de Ter en complejos con tipo salvaje bicatenario Ter (PDB: 2I05, izquierda) y Tus & ndashTer Complejo UGLC (PDB invertido de par de bases GC (6): 4XR3, derecha).

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Introducción

El daño del ADN ocurre a través de procesos exógenos y endógenos. Los carcinógenos, independientemente de su origen, tienen la capacidad de provocar el desarrollo de daños en el ADN a través de una variedad de mecanismos. Esto incluye, por ejemplo, la unión covalente de carcinógenos con ADN o roturas de doble cadena del ADN (DSB) formadas como resultado de la generación de radicales libres inducida por radiación ionizante (IR) [1, 2]. Los carcinógenos se clasifican como agentes químicos o físicos [3], que causan daños en el ADN atribuibles a sus propiedades físico-químicas, como la distorsión de las moléculas de ADN o la reticulación del ADN [3 & # x020136]. La Tabla 1 muestra un pequeño subconjunto de carcinógenos ambientales y / o dietéticos; sin embargo, hay muchos otros ejemplos a los que los humanos están potencialmente expuestos (Tabla 1).

Tabla & # x000a01

Agentes candidatosVisión generalReferencias
Aminas aromáticas heterocíclicas (HAA)Los HAA son agentes mutagénicos inducidos por calor, dependientes de la activación, presentes predominantemente en alimentos que contienen componentes nitrogenados y creatina. La estructura molecular de los HAA depende de la temperatura y el nivel de calor transferido a los alimentos. Puede generar SSB, aberraciones cromosómicas y aductos de ADN en regiones ricas en guanina. Los metabolitos activados pueden atacar la posición N 2 de la guanina (más común) o el átomo C8 de la guanina (ocurre con menos frecuencia).[13 & # x0201315]
Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH)La combustión de materia orgánica da como resultado la generación de HAP. Estos son los carcinógenos de acción indirecta más abundantes a los que están expuestos los seres humanos a diario. La exposición se ha asociado con el desarrollo de cáncer de mama, piel o pulmón. Se requiere la bioactivación de los HAP para que estos agentes exhiban propiedades mutagénicas, que están mediadas principalmente por las enzimas del citocromo P450. Los metabolitos bioactivados se dirigen a múltiples sitios genómicos, incluidas las bases de guanina y adenina a través de epóxidos diol de PAH. Esto da como resultado la generación de aductos de ADN químico de BPdG voluminosos. Los ejemplos incluyen entrecruzamiento mediado por quinona de la posición N7 de la guanina y N3 de la adenina.[11,16]
Ultravioleta (UV)Agente cancerígeno genotóxico de acción directa e indirecta, absorbido principalmente por componentes epidérmicos, como bases de ADN (timina y citosina) y proteínas. Este agente está implicado en la causa de los tumores de piel al dirigirse a las bases de pirimidina. La exposición a la epidermis y la dermis induce tanto la regulación positiva de la proliferación celular como la generación de fotoproductos, incluidos los CPD y las pirimidinas pirimidínicas (6 & # x020134).[5,17 & # x0201319]
Ácido aristolóquico (AA)Ácidos derivados naturalmente de plantas Aristolochiaceae. Se ha demostrado que la ingestión de estos carcinógenos se asocia en gran medida con nefrotoxicidad de la corteza renal y un mayor daño a la vejiga y al hígado, muy probablemente debido al desarrollo de abultados aductos químicos de ADN. La forma más abundante y mutagénica de aducto de ADN asociado con AA es dA-AA. En los exones 2 & # x0201311 de TP53, los abultados aductos químicos de ADN dan como resultado mutaciones, principalmente de los pares de bases A: T.[20 & # x0201324]
NitrosaminasEl metabolismo de las nitrosaminas induce posteriormente el daño del ADN alquilante a través de la formación de aductos de ADN como la O6-alquilguanina, el estrés oxidativo y la producción de iones de diazonio. Los seres humanos están expuestos a estos agentes a través de diversos alimentos y el humo del tabaco.[25,26]
MicotoxinasLas micotoxinas son metabolitos derivados de hongos que contaminan principalmente los alimentos. La micotoxina más común es la aflatoxina B1, descubierto a principios de la década de 1960. Estos son carcinógenos indirectos, que requieren bioactivación a través de CYP para generar aductos de ADN. Formación de aductos dirigidos a bases de guanina, que inducen transversiones G & # x02009 & # x02192 & # x02009T en el codón 249 en TP53.[27 & # x0201329]
Radiación ionizante (IR)La exposición a la radiación ionizante induce daño al ADN de manera indirecta o directa. El efecto carcinogénico indirecto está mediado por la radiólisis del agua, que promueve la producción de ROS, lo que resulta en daño oxidativo, que puede resultar en SSB. El efecto directo implica la interacción directa de electrones con el ADN que resulta en distorsión molecular y DSB.[5,6]
AmiantoEl asbesto es altamente cancerígeno y se ha utilizado históricamente en aplicaciones industriales y domésticas. La exposición a las fibras está directamente relacionada con la asbestosis, las placas pleurales y el mesotelioma. La dimensión, la forma y la composición química son factores de patogenicidad del amianto. El daño se produce por estrés oxidativo (puede dar lugar a roturas de la cadena de ADN), fibrosis e interacción con el aparato mitótico de las células en división. Se observa sinergia en la causa del cáncer de pulmón con otros mutágenos, incluidos los PAH, debido al núcleo insoluble del asbesto a través del cual los carcinógenos adsorbidos se administran a los sitios objetivo donde ejercen sus efectos genotóxicos.[30,31]
Nanopartículas (NP)La ingeniería en nanotecnología ha experimentado un uso cada vez mayor de nanopartículas en las industrias médica, cosmética y electrónica. Los NP tienen una dimensión & # x0003c100 & # x02005nm, lo que ayuda a la penetración celular después de la inhalación, exposición dérmica u oral con la consiguiente capacidad de causar daño al ADN. El daño puede ser directo y los efectos genotóxicos incluyen aductos de ADN resultantes de daño oxidativo, cambios epigenéticos y roturas de cadenas de ADN.[32 & # x0201334]

La exposición a carcinógenos puede directa [7] o indirectamente [1,8] inducir daño al ADN. Los mecanismos de reparación posteriores pueden provocar alteraciones en las secuencias de ADN, es decir, mutaciones [2,9]. Las mutaciones inducidas pueden ser eventos iniciadores en la causa del cáncer, cuando el daño se fija dentro de los oncogenes o genes supresores de tumores [10]. Este riesgo también puede estar directamente influenciado por la susceptibilidad individual y la inestabilidad genética [11]. Por ejemplo, en el trastorno genético hereditario Xeroderma pigmentoso (XP), las mutaciones en las proteínas XP interrumpen la reparación del ADN, lo que da como resultado la acumulación de lesiones inducidas por la luz solar en el ADN de la piel y una alta tasa de cáncer de piel [12].


Interrupción de genes de proteasa en microbios para la producción de proteínas heterólogas

3.6.1.4 Recombinación específica del sitio

La recombinación específica de sitio es un tipo de sistema de recombinación genética en el que se produce el intercambio de segmentos que poseen un cierto grado de homología de secuencia de cadenas de ADN (Bode et al., 2000). El sistema de recombinación específico del sitio es muy eficaz, rápido y específico. Por recombinación tanto homóloga como heteróloga, se ha informado que el ADN del vector circular de hongos filamentosos, incluidas las secuencias de plásmidos, puede integrarse en el conjunto de genes, en copias únicas o múltiples (Miller et al., 1985). En diferentes géneros, la proporción de integraciones homólogas: heterólogas difiere significativamente (Hinnen et al., 1978). Se espera que los primeros eventos de integración incluyan la reparación de roturas bicatenarias entre el vector integrado y las secuencias flanqueantes cromosómicas. La integración también requiere análisis de secuenciación (Mohr et al., 1989). En la década de 1970, el desarrollo de tecnologías de ADN recombinante sentó las bases para el progreso de varios sistemas de expresión de proteínas heterólogas. Escherichia coli, S. cerevisiae, levadura metilotrófica P. pastoris, y los hongos filamentosos se utilizaron ampliamente para la expresión de proteínas heterólogas (Hitzeman et al., 1981 Li et al., 2007 Lubertozzi y Keasling, 2009). Las tecnologías de expresión de proteínas heterólogas sirven como una técnica importante para la preparación de proteínas o enzimas para la experimentación académica y la importancia industrial. Algunas de las características de la recombinación específica de un sitio son: (1) en sitios específicos de la (s) molécula (s) de ADN que interactúan, se produce la recombinación (2) la recombinación es conservadora y (3) en pequeñas regiones de ADN, el intercambio de hebras de homología se produce dentro del sitios de recombinación.

Debajo in vitro condiciones, para la manipulación de grandes moléculas de ADN Cre recombinasa también se ha convertido en una herramienta poderosa (Sauer y Henderson, 1988). Cre recombinasa es una enzima tirosina recombinasa que utiliza un mecanismo similar a la topoisomerasa I para provocar eventos de recombinación específicos del sitio. En el ciclo de vida del bacteriófago P1, las enzimas juegan un papel importante, como la ciclación del genoma lineal y la resolución de cromosomas diméricos (Van Duyne, 2001). Se ha informado que Cre es una recombinasa eficaz además de E. coli y en levadura (Sauer, 1987). Tanto en células de levadura como de mamíferos, Cre puede dirigir la integración específica de sitio de un vector de direccionamiento que contiene IoxP a una diana loxP colocada cromosómicamente como, de manera similar, lo hace la FLP recombinasa en células de mamíferos (O'Gorman et al., 1991 Sauer y Henderson, 1990). FLP recombinasa derivada de S. cerevisiae se utilizan para manipular la estructura de los genomas y para controlar la expresión de genes. La recombinación Flp-FRT es un tipo de recombinación dirigida al sitio. La proteína Flp es una familia de tirosinas en la que la recombinasa específica de sitio realiza su función a través de un mecanismo de topoisomerasa de tipo IB, lo que provoca la recombinación de dos cadenas de ADN separadas. El paso inicial durante la recombinación provoca la creación de un intermedio de unión de Holliday. El segundo paso resultó en la recombinación de las dos cadenas complementarias (Ma et al., 2007).


Neoplasia

Stan K. Bardal BSc (Pharm), MBA, PhD,. Douglas S. Martin PhD, en Farmacología Aplicada, 2011

MOA (mecanismo de acción)

Los agentes alquilantes transfieren alquilo (químico) grupos al ADN. La alquilación del ADN en el núcleo conduce a la muerte de la celda.

Una vez en la célula, los agentes alquilantes experimentan una reordenación estructural que da como resultado la formación de un intermedio inestable, un ion etilenimonio.

Este ión, ya sea directamente o mediante otro intermedio, un ión carbonio, transfiere grupos alquilo a ácidos nucleicos como la guanina oa otros constituyentes celulares.

La alquilación de guanina u otras bases da como resultado un apareamiento anormal de bases así como la escisión de estas bases, lo que a su vez conduce a la rotura de la hebra.

Se considera que los agentes alquilantes están en fase del ciclo celular. inespecífico, con celdas en G1 y las fases S son las más susceptibles (Figura 20-1).

No se ha establecido la conexión entre la alquilación del ADN y la muerte de la célula cancerosa; sin embargo, uno de los mecanismos probables es el daño al ADN que es suficiente para activar proteínas proapoptóticas como p53, lo que conduce a la muerte celular.

Las nitrosoureas tienen un mecanismo de acción adicional. Las nitrosoureas experimentan otra reacción, conocida como carbamoilación, con residuos de lisina de proteínas. La carbamoilación es la transferencia de carbamoilo (NH2CO) a un grupo amino, como el que se encuentra en los aminoácidos.

El producto de esta reacción se denomina proteína carbamoilada, y este proceso parece limitar la capacidad de la célula cancerosa para reparar el ADN. Este mecanismo de acción único limita la resistencia cruzada entre nitrosoureas y otros miembros de esta clase.

Mecanismos de resistencia

Los mecanismos de resistencia incluyen los siguientes: ▴

Disminución de la entrada de fármaco en la célula.

Inactivación del agente alquilante por glutatión

La resistencia cruzada es común entre las diversas subclases de agentes alquilantes, con la excepción de las nitrosoureas.


Una reacción (S_N1 ) bioquímica

Como veremos en el capítulo 10, las reacciones (S_N1 ) catalizadas por enzimas juegan un papel crítico en el metabolismo de carbohidratos y nucleótidos de ADN / ARN. La siguiente reacción es parte de la biosíntesis de nucleótidos:

Observe algunas cosas aquí: primero, el grupo saliente difosfato se estabiliza por interacciones con el ión (Mg ^ <+ 2> ) unido en el sitio activo y también por enlaces de hidrógeno con residuos de aminoácidos del sitio activo (no se muestra). El carbocatión intermedio se estabiliza por resonancia con los pares solitarios en el oxígeno (ver sección 8.5), y también por una cadena lateral de aspartato del sitio activo. El nucleófilo de amoníaco se coloca en el sitio activo de modo que se acerque desde el lado "superior" del intermedio carbocatiónico plano, y la sustitución da como resultado la inversión de la configuración. Recuerde: las reacciones (S_N1 ) que ocurren libres en solución tienden a resultar en una mezcla de estereoisómeros, pero las reacciones catalizadas por enzimas, incluidas las reacciones enzimáticas (S_N1 ) como esta, son generalmente estereoespecíficas y regioespecíficas, lo que significa que casi siempre dan como resultado un solo producto isomérico, no una mezcla de productos.

Recuerde la afirmación de la sección 8.4 de que los grupos salientes pobres a menudo deben convertirse en grupos salientes buenos. Respaldando un paso metabólico de la reacción descrita anteriormente, vemos que un grupo saliente pobre (hidróxido) en la ribosa-5-fosfato se convierte primero en un grupo saliente bueno (difosfato), que puede estabilizarse a través de interacciones con el sitio activo del enzima que cataliza la reacción (S_N1 ).

Este paso de fosforilación preliminar, que requiere ATP (trifosfato de adenosina) como donante del grupo difosfato, es una reacción que estudiaremos con mucho más detalle en el capítulo 9.


Características de la ADN polimerasa:

  • Alta Procesividad: La catálisis por ADN polimerasa es rápida, es capaz de agregar hasta 1000 nucleótidos por segundo a una cadena de cebador. En el caso de la ADN polimerasa, el grado de procesividad se define como el número de nucleótidos añadidos cada vez que la enzima se une a una unión cebador: molde.
  • Múltiples sustratos: En la enzima procesiva, cada vez que la enzima se une a un cebador: unión de plantilla de múltiples sustratos, se agrega dNTP al cebador. En contraste con ninguna enzima procesiva, se agrega un solo dNTP al cebador y luego se libera de la unión cebador: molde.

La capacidad de la ADN polimerasa de deslizarse a lo largo de la plantilla de ADN facilita el aumento de la procesividad. La ADN polimerasa interactúa estrechamente con gran parte de la porción bicatenaria del ADN en una secuencia no específica. Estas interacciones incluyen interacciones electrostáticas entre la columna vertebral de fosfato y el dominio del pulgar, y la interacción entre el surco menor del ADN y el dominio de la palma. Se logra un mayor aumento en la procesividad a través de las interacciones entre la ADN polimerasa y la proteína & # 8220Sliding clamp & # 8221.

  • Actividad de exonucleasa: Parpadeo ocasional de las bases en la forma tautomérica & # 8216 incorrecta & # 8217. Esta forma alternativa de bases permite que los pares de bases incorrectos se coloquen correctamente para la catálisis. Las exonucleasas revisan el ADN recién sintetizado. Este tipo de exonucleasa se llama corrección de pruebas de exonucleasa. Estas exonucleasas son capaces de degradar el ADN a partir del extremo del ADN 3 & # 8242, es decir, del extremo en crecimiento de la nueva hebra de ADN y eliminar el nucleótido incorrecto.

El ADN mal emparejado altera la geometría del 3 & # 8242 OH y el nucleótido entrante debido a interacciones deficientes con la región de la palma. Esta geometría alterada reduce la tasa de adición de nucleótidos y aumenta la tasa de actividad de la exonucleasa de corrección de pruebas. La corrección de pruebas puede ocurrir sin liberar el ADN de la polimerasa. Cuando se detecta un par no coincidente, la unión cebador: molde se desliza desde el sitio activo de la ADN polimerasa hacia el sitio de la exonucleasa. después de eliminar el nucleótido incorrecto, el cebador correctamente emparejado: la unión de la plantilla se desliza de regreso al sitio activo de la polimerasa y la síntesis de ADN continúa.

La ADN polimerasa que realiza la síntesis y la edición.

  • Los nucleótidos se agregan a ambas plantillas. en la bifurcación de replicación al mismo tiempo.
  • Se requiere imprimación. La ADN polimerasa requiere un cebador para iniciar la ADN polimerasa.

Poca abundancia y alta procesividad de la ADN polimerasa III

La ADN polimerasa III tiene muchas de las propiedades esperadas para una polimerasa replicativa. Una de las complicaciones de los estudios de la ADN polimerasa III es que se aislaron diferentes formas mediante diversos procedimientos. Ahora nos damos cuenta de que estas formas difieren en el número de subunidades presentes en la enzima aislada. Para las enzimas con múltiples subunidades, nos referimos al complejo con todas las subunidades necesarias para su función principal como el holoenzima o holocomplejo . La holoenzima de la ADN polimerasa tiene diez subunidades, que se analizarán en detalle en la siguiente sección.

Es la holoenzima de la ADN polimerasa la que tiene las propiedades esperadas para una polimerasa replicativa, mientras que la ADN polimerasa I no las tiene (ver comparación en la Tabla 5.1). Está menos abundante que la ADN polimerasa I, pero no se necesita una gran cantidad de ADN polimerasas replicativas en la célula. Solo se pueden usar una o dos polimerasas en cada horquilla de replicación, por lo que las 10 moléculas de la holoenzima de la ADN polimerasa III serán suficientes. ADN polimerasa III cataliza la síntesis de ADN a una velocidad considerablemente mayor que la ADN polimerasa I, por un factor de aproximadamente 70. La tasa de elongación medida para la holoenzima de la ADN polimerasa III (42.000 nucleótidos por minuto) es cercana a la tasa de movimiento de horquilla de replicación medida en vivo en E. coli (60.000 nucleótidos por minuto).

Una propiedad clave para una ADN polimerasa replicativa es alta procesividad , que es una característica sorprendente de la holoenzima de la ADN polimerasa III. Procesividad es la cantidad de polimerización catalizada por una enzima cada vez que se une a una plantilla apropiada, o plantilla de cebador en el caso de las ADN polimerasas. Se mide en nucleótidos polimerizados por evento de unión. Para replicar el cromosoma de 4.5 megabase de E. coli en 30 a 40 minutos, la ADN polimerasa necesita sintetizar ADN rápidamente y de una manera altamente procesadora. La ADN polimerasa I sintetiza menos de 200 nucleótidos por evento de unión, pero como holoenzima, la ADN polimerasa III es mucho más procesiva y supera los límites del ensayo utilizado para obtener los resultados resumidos en la Tabla 5.1. En contraste, el núcleo de la ADN polimerasa III, que tiene solo tres subunidades (ver la siguiente sección), tiene una procesividad muy baja.

Cuadro 5.1. Comparación de ADN polimerasas I y III (Pol I y Pol III)

nucleótidos polimerizados min -1 (molécula enzima) -1

procesividad [nucleótidos polimerizados por iniciación]

Exonucleasa 3 'a 5', corrección de pruebas

Nota: + y se refieren a la presencia o ausencia de la actividad indicada en la enzima.

Pregunta 5.6. Si la tasa de movimiento de la horquilla de replicación medida en vivo en E. coli es 60.000 nucleótidos por minuto, ¿cuántas bifurcaciones se necesitan para replicar el cromosoma en 40 minutos? Recuerde que el tamaño del E. coli El cromosoma es 4,64 × 10 6 pb.


Figura complementaria 1 Conservación del PASR.

a. Alineación de secuencia basada en estructura entre E. coli YedK y dominio SRAP de HMCES humano, junto con un alineamiento de secuencia de dominios SRAP de 8 especies adicionales. La estructura secundaria de la estructura YedK DPC se muestra encima de la alineación. Los símbolos encima de los residuos específicos denotan aquellos involucrados en la unión del ADN (círculos), distorsionando el ADN en el lado 5 ′ del sitio AP (cuña, círculos azules), apilando contra el dsDNA inmediatamente a 3 ′ del sitio AP (estante, círculos magenta), y estabilizar la reticulación de tiazolidina (bolsillo Cys2, "×"). B. Vistas ortogonales de la estructura YedK DPC coloreada en arco iris desde N- (azul) hasta C-terminal (rojo). C. Superposición de E. coli YedK DPC (azul / dorado) y dominio HMCES SRAP humano (PDB ID 5KO9, plata). El r.m.s.d. entre las estructuras es de 1,40 Å para todos los átomos de la columna vertebral. D. Superposición de YedK DPC (azul / magenta) y YedK libre (naranja). Los bucles en YedK DPC que están desordenados en la proteína libre son de color magenta. Las proteínas se muestran como un rastro de la cadena principal de Cα.

Figura complementaria 2 Detalles del sitio activo del SRAP.

Vistas estereoscópicas de residuos que entran en contacto con el enlace tiazolidina en los dos complejos proteína-ADN en la unidad asimétrica de la estructura YedK DPC, superpuestos con densidad electrónica 1σ 2Fo-Fc. Las líneas discontinuas y los números indican las longitudes de los enlaces de hidrógeno en Å.

Figura complementaria 3 Detalles estructurales del complejo SRAP-ADN no covalente.

a. Superposición de YedK reticulado covalentemente a AP-DNA (azul) y unido de forma no covalente al DNA espaciador C3 (magenta). El sitio básico está marcado con un asterisco. La flecha de dos puntas muestra la diferencia más significativa entre las dos estructuras: el movimiento de la horquilla β (β7- β8) que estabiliza la columna vertebral del ADN 3 'en el sitio AP. B. Vista estereoscópica del sitio activo YedK en la estructura YedK / C3-spacer-DNA, superpuesta con densidad de electrones 1σ 2Fo-Fc. El espaciador C3 es de color verde y los nucleótidos flanqueantes son dorados. Las líneas discontinuas y los números indican las longitudes de los enlaces de hidrógeno en Å. C. ADN en las estructuras DPC (arriba) y espaciador C3 no covalente (abajo), coloreado por el factor B. D. Factor B promedio de cada nucleótido en las estructuras DPC (negro) y espaciador C3 no covalente (azul).

Figura complementaria 4 Unión del dominio SRAP de HMCES a uniones de ssDNA y ssDNA / dsDNA que contienen un análogo de sitio abásico de tetrahidrofurano (THF).

La unión se controló mediante un cambio en la anisotropía de fluorescencia a medida que la proteína se titulaba frente a los ADN que contenían un marcador FAM en el extremo 5 'de la hebra de THF. El cambio máximo en la anisotropía (amplitud de la isoterma de unión en la saturación) depende de la velocidad de rotación del marcador FAM, que es diferente para cada uno de los tres sustratos. Constantes de disociación (KD) se derivaron del ajuste de mínimos cuadrados no lineales de un modelo de unión de dos estados y un solo sitio a los datos.



Comentarios:

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